第七章 酶非水相催化
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第7章 酶的非水相催化
4、（正）胶束体系
胶束也称为正胶束或正胶团，是在大量水 溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂， 加入表面活性剂后形成的水包油（O/W）的 微小液滴。 表面活性剂是由亲水憎油的极性基团和亲 油憎水的非极性基团两部分组成的两性分 子，既能溶解水溶性物质又能增溶疏水性 物质。
正胶束是通过表面活性剂的极性端朝外， 与水结合，非极性端朝内，有机溶剂包在 液滴内部，形成一个非极性的核心形成。 正胶束水相是连续相，有机相是分散相。 酶催化反应时，酶在胶束外面的水溶液中， 疏水性的底物或产物在胶束内部，反应在 胶束的两相界面中进行。
6、pH“记忆”与pH“忘记”
在有机介质反应中，酶所处的pH环境与酶 的冻干或吸附到载体之前所使用的pH值相 同，这种现象称为pH“印记”或pH“记忆”。
第四节 反胶束体系的酶学研究
反胶束酶催化体系是指在非极性有机溶剂 中，酶分子溶解在由表面活性剂形成的含 水反向胶团内催化底物的转化。
一、反胶束的形成和酶的包覆
4、导电有机聚合物的合成
辣根过氧化物酶可以在与水混溶的有机介质（如
丙酮、乙醇、二氧六环等）中，催化苯胺聚合生 成聚苯胺。 聚苯胺-导电装置 塑料电池, 新型飞机上的电子器件,发光二极管、 太阳能电池以及移动电话和迷你电视的显示屏,导 电塑料制作分子大小的道路
5、发光有机聚合物的合成
辣根过氧化物酶可以在有机介质中催化对苯
当体系中水和有机溶剂同时存在时，两性 表面活性剂分子溶解于有机溶剂，并能够 增溶一定量的水，随水/表面活性剂/有机 溶剂三相浓度不同，会形成球状或椭球状 的胶束，形成所谓的“油包水”的结构， 即反胶束。
二、反胶束体系的制备方法
（1）注入法：将含有酶的水相注入到含有表 面活性剂的有机相中。 （2）液体萃取法：将含酶的水相与含表面活 性剂的有机相直接接触。 （3）固体萃取相：将酶的固体粉末与含水的 反胶束有机溶剂一起搅拌。
第七章化学人工酶和酶的非水相催化解析
1983年，Rupley等人从溶菌酶的结论得知，一个 干燥蛋白的水合过程经过4个步骤： (1)加入的水首先与酶分子表面的带电基团结合， 达到每克蛋白质0~0.07g水。 (2)然后与酶分子表面的极性基团结合(每克蛋白 质0.07~0.25g水)。 (3)多出来的水再凝聚到蛋白质分子表而相互作 用较弱的部位(每克蛋白质0.25~0.38g水)。 (4)最后，酶分子表面完全水化，被一层水分子 所覆盖(每克蛋白质0.38g水，大约300个水分子)。
第二节 非水介质中的酶催化反应
1984年A. Zaks 和A.M Klibanov 首 次发表了关于非水相介质中脂肪酶的催 化行为及热稳定性的研究报道，引起了 广泛的关注。传统的酶学领域迅速产生 一个全新的分支非水酶学。 现在非水酶学方法在多肽合成、聚 合物合成、药物合成以及立体异构体拆 分等方面显示出广阔的应用前景。
一、半合成酶
半合成酶 将具有一定结构和功能的物质与特异的 蛋白质结合，便可形成新的生物催化剂—— 半合成酶。
一、半合成酶
1．将具有催化活性的金属或金属有机物与 具有特异性的蛋白质相结合，形成半合 成酶。 Gray与Margalit将电子传递催化剂 [Rn(NH3)5]3+，与巨头鲸肌红蛋白结合， 产生半合成的无机生物酶。肌红蛋白传 递氧气， Rn(NH3)5]3+能氧化各种有机物 (如抗坏血酸)。这种人工酶的催化效率是 钙一咪唑复合物的200倍，接近天然的抗 坏血用人工方法合成 具有催化活性的多肽。 1977年人工合成一个八肽具有溶菌酶的活 性。
三、设计要点
设计前： 酶活性中心-底物复合物的结构 酶的专一性及其同底物结合方式的能力 反应的动力学及各中间物的知识
三、设计要点
设计中： 为底物提供良好的微环境（疏水性） 应提供形成离子键、氢键的可能性，以利 于结合底物 催化基团必须相对于结合点尽可能同底物 的功能团相接近 应具有足够的水溶性，并在接近生理条件 下保持其催化活性
酶的非水相催化(5)
反胶束微粒的大小取决于反胶束的含水量（W0），即反胶束中水分子 数与表明活性剂分子数之比。不同酶有不同的最适W0值，该值取决于表明 活性剂和酶的性质，即反胶束的精品内医核学p体pt 积与酶分子体积要相适应。 6
反应体系中水对酶催化反应的影响
酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行 催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少 的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催 化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还 与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。
极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水， 影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶 的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水 量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介 质中因脱水作用而影响其催化活性。
有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物 的分配，从而影响酶的催化反应。
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所 组成的两相体系。 不管采用何种有机介质反应体精系品医，学酶ppt催化反应的介质中都含有机溶剂5 和 一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。
7.2 有机介质反应体系（二）
（正）胶束体系 在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表明活性剂
酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水 的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子 需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的 空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。
有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水 含量。
第七章 酶的非水相催化
反应体系中水对酶催化反应的影响
酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行 催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少 的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催 化活性、酶的稳定性、酶的催化反应速度等都有密切关系，水还 与酶催化作用的底物和反应产物的溶解度有关。
极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水， 影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性,甚至引起酶 的变性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水 量，或者经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介 质中因脱水作用而影响其催化活性。
有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物 的分配，从而影响酶的催化反应。
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所 组成的两相体系。 不管采用何种有机介质反应体精系品医，学酶ppt催化反应的介质中都含有机溶剂5 和 一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。
7.2 有机介质反应体系（二）
（正）胶束体系 在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表明活性剂
酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水 的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子 需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。维持酶分子完整的 空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）。
有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水 含量。
第七章 酶的非水相催化
第七章_酶的非水相催化
第七章 酶的非水相催化
Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
拒接翻版
Go Go Go Go Go
1、酶非水相催化的主要内容 2、有机介质中水和有机溶剂对催化反应的 影响 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 5、酶非水相催化的应用
非水酶学的研究主要内容
第一，非水酶学基本理论的研究，影响酶催 化的主要因素以及非水介质中酶学性质； 第二，阐明非水介质中酶的催化机制，建立 和完善非水酶学的基本理论； 第三：应用
一、非水介质中酶的结构与性质
(一) 非水介质中酶的状态 存在状态有多种形．主要分为两大类 第一类为固态酶 它包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶，它们以固 固态酶， 固态酶
(二)非水介质中的酶学性质
有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精 细平衡，从而影响到酶的结合部位，有机溶 剂也会改变底物存在状态。因此酶和底物相 结合的自由能就会受到影响，而这些至少会 部分地影响到有机溶剂中酶的底物特异性、 立体选择性、区域选择性和化学键选择性等 酶学性质。
第二节:水对非水相介质中酶催化的影 响
第一节： 第一节：酶催化水相的主要内容
酶在非水介质中，酶存在状态与酶结构发生改变。 用于酶催化的非水介质包括 非水介质包括
有机溶剂体系
• • • • ①含微量水的有机溶剂单相体系； ②与水混溶的有机溶剂和水形成的单相体系； ③水与有机溶剂形成的两相或多相体系： ④胶束与反胶束体系；
超临界流体 气相 低共熔混合体系 又称为非常规介质。
体形式存在有机溶剂中。还有利用结晶酶进行非水介质中催化反应和酶 结构的研究，结晶酶的结构更接近于水溶液中酶的结构，它的催化效率 也远高于其他类型的固态酶。
Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
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1、酶非水相催化的主要内容 2、有机介质中水和有机溶剂对催化反应的 影响 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 5、酶非水相催化的应用
非水酶学的研究主要内容
第一，非水酶学基本理论的研究，影响酶催 化的主要因素以及非水介质中酶学性质； 第二，阐明非水介质中酶的催化机制，建立 和完善非水酶学的基本理论； 第三：应用
一、非水介质中酶的结构与性质
(一) 非水介质中酶的状态 存在状态有多种形．主要分为两大类 第一类为固态酶 它包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶，它们以固 固态酶， 固态酶
(二)非水介质中的酶学性质
有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精 细平衡，从而影响到酶的结合部位，有机溶 剂也会改变底物存在状态。因此酶和底物相 结合的自由能就会受到影响，而这些至少会 部分地影响到有机溶剂中酶的底物特异性、 立体选择性、区域选择性和化学键选择性等 酶学性质。
第二节:水对非水相介质中酶催化的影 响
第一节： 第一节：酶催化水相的主要内容
酶在非水介质中，酶存在状态与酶结构发生改变。 用于酶催化的非水介质包括 非水介质包括
有机溶剂体系
• • • • ①含微量水的有机溶剂单相体系； ②与水混溶的有机溶剂和水形成的单相体系； ③水与有机溶剂形成的两相或多相体系： ④胶束与反胶束体系；
超临界流体 气相 低共熔混合体系 又称为非常规介质。
体形式存在有机溶剂中。还有利用结晶酶进行非水介质中催化反应和酶 结构的研究，结晶酶的结构更接近于水溶液中酶的结构，它的催化效率 也远高于其他类型的固态酶。
酶工程-07-酶非水相催化2
（2）具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性。
（3）超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或 在酶催化的最适温度附近。 （4）超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用。
（5）容易获得，价格要便宜。
4
第七章 酶非水相催化
第一节 酶非水相催化的主要内容和特 点
二 、
根据所用非水介质的不同，分为四种：
酶
非
水 相 催 化 的 主 要 内 容
中（ 的四 酶） 催离 化子
液 介 质
概念：是指酶在离子液介质中进行 的催化作用。
5
第七章 酶非水相催化
第一节 酶非水相催化的主要内容和特 点
三
1、酶的热稳定性提高。
、
2、酶的催化活性有所降低。
酶
非
3、水解酶可以在非水介质中催化水解反应的逆反应。
水
相
4、非极性底物或者产物的溶解度增加。
酶催
催化 化反 反应 应都 的要 体在 系一 主定 要的 有反
非
水 有机介质反应体系
介 质 反
（研究最多，应用 最广泛）
应
体 超临界流体介质反
系 应体系
与水溶性有机溶剂组 成的均一体系
与水溶性有机溶剂组成 的两相或多相体系
（正）胶束体系
：
应 体
离子液介质反应体系
反胶束体系
7
第七章 酶非水相催化
第二节 有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响 （一）微水介质体系
KLD L
D
Km Kcat
立体选择系数 L-型异构体 D-型异构体 米氏常数 酶的转换数
酶在有机介质与在水溶液中催化比较,
影
由于介质的特性发生改变,使酶的对映体选
第七章 酶非水相催化
【pH记忆】在有机介质反应体系中，酶所处的pH环境与其在 冻干或吸附到载体之前所用的缓冲液pH相同，这种现象称为 “pH记忆”。 利用酶的这种pH记忆特性，可以通过控制缓冲液中pH值 的方法，来控制有机介质中酶催化反应的最适pH值。 【pH忘记】用疏水性的酸或碱与他们相应的盐所组成的混合 物，作为有机相的缓冲液，他们控制着有机相中酶的解离状态， 使酶完全“忘记”干燥它所处的水溶液的pH。
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
（1）干扰氢键和疏水键等改变酶的构象
有 机 介 质 体 系
有机溶剂
（2）酶分子必需水的变化和重新分布 （3）底物和产物的分配与扩散
水
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响 1、有机溶剂对酶结构的影响
枯草杆菌蛋白酶晶体在乙腈溶剂中，原有 的119个与酶分子结合的水分子中有20个 水分子被脱去，12个乙腈分子结合到了上 去，其中4个取代了原来水分子的位置。
超临界流体是指超过临界温度与临界压力状态的流体。
CO2的临界温度：31.1℃，临界压力：7.38MPa
离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴 离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、 稳定性好。 与传统的有机溶剂不同的是，离子液体没有蒸汽压，但是 有很好的溶解性，热稳定范围很宽，超过液态温度范围 （≤300℃）。
有机溶剂在正辛烷中的分配系数 有机溶剂在水中的分配系数
lgP = lg
极性系数越大，表明其极性越弱；极性系数越小，则极性越强。
一般选用2≤lgP≤5的有机溶剂。
第三节 酶在有机介质中的催化特性
一、有机介质体系中酶活性的变化 二、底物专一性的改变 三、稳定性的变化
四、pH特性
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
（1）干扰氢键和疏水键等改变酶的构象
有 机 介 质 体 系
有机溶剂
（2）酶分子必需水的变化和重新分布 （3）底物和产物的分配与扩散
水
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响 1、有机溶剂对酶结构的影响
枯草杆菌蛋白酶晶体在乙腈溶剂中，原有 的119个与酶分子结合的水分子中有20个 水分子被脱去，12个乙腈分子结合到了上 去，其中4个取代了原来水分子的位置。
超临界流体是指超过临界温度与临界压力状态的流体。
CO2的临界温度：31.1℃，临界压力：7.38MPa
离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机）阴 离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、 稳定性好。 与传统的有机溶剂不同的是，离子液体没有蒸汽压，但是 有很好的溶解性，热稳定范围很宽，超过液态温度范围 （≤300℃）。
有机溶剂在正辛烷中的分配系数 有机溶剂在水中的分配系数
lgP = lg
极性系数越大，表明其极性越弱；极性系数越小，则极性越强。
一般选用2≤lgP≤5的有机溶剂。
第三节 酶在有机介质中的催化特性
一、有机介质体系中酶活性的变化 二、底物专一性的改变 三、稳定性的变化
四、pH特性
第七章 非水相酶催化
1、低水体系
1）与水互溶的有机溶剂-水单相体系
有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶 解在这种体系中。这种反应体系主要适用于在单一水溶液中溶解 度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。
2）非极性有机溶剂-水两相体系
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体 系。反应一般发生在水相或者是两相的界面上。
适宜的温度下进行反应。
第一节 非水酶学概述
Enzyme Engineering
有机介质酶反应的应用现状
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
一、酶促反应的有机介质体系
低水体系(A)
高水分含量体系
A
B
(B、C、D)
C
D
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
渗透蒸发法调控水分的原理源自Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
1.有机溶剂对酶活性的影响
有机溶剂直接与酶分子周围的水相互作用，造成酶分子必需水的 变化和重新分配，从而影响酶的构象和活性。
溶剂的极性越强，对酶活性影响越大。溶剂的疏水性越强，酶在 该介质中的反应活性愈高。
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
100
酶
活 50
力
CLECs（辛烷） 冻干酶（辛烷）
CLECs（乙腈） 冻干酶（乙腈）
0
1
2
3
4
5
6
时间（天）
枯草杆菌蛋白交联酶晶体与冻干酶在己烷和乙腈中的稳定性
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
1）与水互溶的有机溶剂-水单相体系
有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶 解在这种体系中。这种反应体系主要适用于在单一水溶液中溶解 度很低、反应速度也很慢的亲脂性底物的生物转化。
2）非极性有机溶剂-水两相体系
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂相所组成的两相体 系。反应一般发生在水相或者是两相的界面上。
适宜的温度下进行反应。
第一节 非水酶学概述
Enzyme Engineering
有机介质酶反应的应用现状
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
一、酶促反应的有机介质体系
低水体系(A)
高水分含量体系
A
B
(B、C、D)
C
D
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
渗透蒸发法调控水分的原理源自Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
（二）有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响
1.有机溶剂对酶活性的影响
有机溶剂直接与酶分子周围的水相互作用，造成酶分子必需水的 变化和重新分配，从而影响酶的构象和活性。
溶剂的极性越强，对酶活性影响越大。溶剂的疏水性越强，酶在 该介质中的反应活性愈高。
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
100
酶
活 50
力
CLECs（辛烷） 冻干酶（辛烷）
CLECs（乙腈） 冻干酶（乙腈）
0
1
2
3
4
5
6
时间（天）
枯草杆菌蛋白交联酶晶体与冻干酶在己烷和乙腈中的稳定性
Enzyme Engineering 第二节 有机介质中的酶促反应
第七章非水相酶催化反应
2) 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同。溶剂疏 水性越强，需水量越少。
7.4 选择合适的酶及酶形式
酶种类的选择： 应具有对抗有机介质变性的潜在能力，在有机介
质中能保持其催化活性构象。
酶是否适于在有机介质中反应，除与酶性质有关 外，还取决于酶-底物、产物-溶剂间的关系问题。 这完全需要用实验来决定。
COOH
HN C O
N-Phac-D-Tle
COO-
HN C O
N-Phac-D-Tle
COOH
PAA Organic Phase Aqueous Phase
+
+ COO-
COO-
PAA
NH3
L-Tle
水-乙酸丁酯双相体系中叔亮氨酸的拆分 消除副产物苯乙酸的抑制
第七章 非水相酶催化反应
非常规介质
有机介质 气态反应介质 超临界流体 离子液体
有机相酶反应的优点
⒈ 有利于疏水性底物的反应 ⒉ 使酶促水解反应逆向进行（利用蛋白酶在非水介质
中催化合成肽）
3. 适合于转酯反应（水中因水解副反应而导致产物收率
低）
4. 反应产物在水中不稳定（酚的酶促氧化产物醌） ⒌ 可避免微生物污染 ⒍ 可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应
酶形式的选择
⑴ 酶粉：将酶做成冻干粉，在有机介质中充分搅拌， 超声波处理，使得颗粒变小，悬浮于介质中
⑵ 化学修饰酶：酶经过修饰变得稳定，有利于酶在 有机溶剂中的稳定性
⑶ 固定化酶：酶吸附在固相载体上（如硅胶、硅藻 土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质 变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高
手性药物两种对映体的药效差异
一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效 一种有显著疗效，另一种有毒副作用 两种对映体的药效相反 两种对映体具有各自不同的药效 两种消旋体的作用具有互补性
7.4 选择合适的酶及酶形式
酶种类的选择： 应具有对抗有机介质变性的潜在能力，在有机介
质中能保持其催化活性构象。
酶是否适于在有机介质中反应，除与酶性质有关 外，还取决于酶-底物、产物-溶剂间的关系问题。 这完全需要用实验来决定。
COOH
HN C O
N-Phac-D-Tle
COO-
HN C O
N-Phac-D-Tle
COOH
PAA Organic Phase Aqueous Phase
+
+ COO-
COO-
PAA
NH3
L-Tle
水-乙酸丁酯双相体系中叔亮氨酸的拆分 消除副产物苯乙酸的抑制
第七章 非水相酶催化反应
非常规介质
有机介质 气态反应介质 超临界流体 离子液体
有机相酶反应的优点
⒈ 有利于疏水性底物的反应 ⒉ 使酶促水解反应逆向进行（利用蛋白酶在非水介质
中催化合成肽）
3. 适合于转酯反应（水中因水解副反应而导致产物收率
低）
4. 反应产物在水中不稳定（酚的酶促氧化产物醌） ⒌ 可避免微生物污染 ⒍ 可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应
酶形式的选择
⑴ 酶粉：将酶做成冻干粉，在有机介质中充分搅拌， 超声波处理，使得颗粒变小，悬浮于介质中
⑵ 化学修饰酶：酶经过修饰变得稳定，有利于酶在 有机溶剂中的稳定性
⑶ 固定化酶：酶吸附在固相载体上（如硅胶、硅藻 土、玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质 变性的能力、反应速度、热稳定性等都可提高
手性药物两种对映体的药效差异
一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效 一种有显著疗效，另一种有毒副作用 两种对映体的药效相反 两种对映体具有各自不同的药效 两种消旋体的作用具有互补性
2015春 第七章 酶的非水相催化 to students
枯草杆菌蛋白酶
核糖核酸酶 酸性磷酸酶 腺苷三磷酸酶 ( F1-ATPase) 限制性核酸内切酶 （Hind Ⅲ） β-葡萄糖苷酶 溶菌酶
正辛烷，110℃
壬烷，110℃，6 h 水，pH 8.0, 90℃ 正十六烷，80℃ 水，70℃ 甲苯，70℃ 水， 60℃ 正庚烷，55℃，30d 2-丙醇，50℃，30 h 环己烷，110℃ 水
water)。
水对有机介质中酶催化反应的影响
2 . 水含量对酶催化反应速度的影响
有机介质中水含量与反应速率的 关系 最适水含量随着溶剂极性的增加 而增加 反应体系的最适水含量与酶的种 类、有机溶剂的种类等变化而有 所差别。
猪胰脂肪酶催化三丁酸甘油酯与正庚 醇转酯反应速率与水浓度的关系
必需水对酶活的影响：
T1/2 = 80 min
活力剩余95％ T1/2 < 10 min T1/2 = 8 min T1/2 = 1 min T1/2 > 24 h T1/2 < 10 min 活力不降低 活力剩余80％ T1/2 =140 min T = 10 min
2. 酶在有机介质中的底物特异性与选择性
2.1 底物专一性 在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位 与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的 底物特异性会发生改变。
是否存在非水介质能保证酶催化？？
长期的观点认为:
有机溶剂是酶的变性剂、失活剂这一传统酶学思
想的影响下，酶在有机介质中催化作用的研究此前几 乎毫无进展。 • 20世纪60年代发现有几种酶在有机溶剂中仍具有活性。
• 1984年， A.M.Klibanov在Science上发表“Enzymatic
Catalysis in Organic Media at 100℃” ，使原来认为生
酶的非水相催化
水介质酶催化体系中，水 分的影响是至关重要的，要使酶能够表现出最 大的催化活力，确定适宜的水活度就显得十分 重要。不同种类的酶因为其分子结构的不同， 维持酶具有活性构象的必需水量也就不同，即 使是同一种类的酶，由于酶的来源不同，所需 的水量也会有显著不同。 最适水含量：催化反应速度达到最大时的 水含量。最适水含量随溶剂极性的增加而增加。 最佳水活度与溶剂极性大小没有关系，可以确 切研究非水介质酶催化作用，一般控制在0.50.6之间。
2 有机溶剂对酶活性的影响
极性较强的有机溶剂能够夺取酶蛋白表面的“必需 水”，扰乱酶分子的天然构象的形成，从而导致酶 的失活。 极性系数lgP：P为溶剂在正辛烷与水两相中的分配 系数。lgP越小，极性越强。 lgP小于2的极性溶剂不宜使用。
在有机介质中进行酶催化时，应选择好所用 溶剂，或通过酶分子修饰提高酶的亲水性。
（三）有机溶剂对酶催化反应的影响 1 2 3 4 有机溶剂对酶结构的影响 有机溶剂对酶催化活力的影响 有机溶剂对底物和产物的影响 有机溶剂对酶选择性的影响
酶在非水介质中的存在形式 一、固态酶。 冻干酶粉、固定化酶、结晶酶 以固体形式悬浮在有机溶剂中 二、可溶解酶。 水溶性大分子共价修饰酶 非共价修饰的高分子—酶复合物 表面活性剂—酶复合物 微乳液中的酶等
（二）水对非水介质中酶催化的影响 酶只有在一定量水的存在下，才能进行催 化反应，特别是在有机介质中的酶催化反应， 水含量的多少对酶的空间构象、催化活性、稳 定性、催化反应的速度、底物和产物的溶解度 等都有密切关系。
1 必需水
维持酶分子完整的空间构象所必需 的最低水量。 氢键、盐键等次级键。 在无水的条件下，酶的空间构象被 破坏，酶将变性失活。 通过必需水的调控，可以调节有机 介质中酶的催化活性和选择性。
2 有机溶剂对酶活性的影响
极性较强的有机溶剂能够夺取酶蛋白表面的“必需 水”，扰乱酶分子的天然构象的形成，从而导致酶 的失活。 极性系数lgP：P为溶剂在正辛烷与水两相中的分配 系数。lgP越小，极性越强。 lgP小于2的极性溶剂不宜使用。
在有机介质中进行酶催化时，应选择好所用 溶剂，或通过酶分子修饰提高酶的亲水性。
（三）有机溶剂对酶催化反应的影响 1 2 3 4 有机溶剂对酶结构的影响 有机溶剂对酶催化活力的影响 有机溶剂对底物和产物的影响 有机溶剂对酶选择性的影响
酶在非水介质中的存在形式 一、固态酶。 冻干酶粉、固定化酶、结晶酶 以固体形式悬浮在有机溶剂中 二、可溶解酶。 水溶性大分子共价修饰酶 非共价修饰的高分子—酶复合物 表面活性剂—酶复合物 微乳液中的酶等
（二）水对非水介质中酶催化的影响 酶只有在一定量水的存在下，才能进行催 化反应，特别是在有机介质中的酶催化反应， 水含量的多少对酶的空间构象、催化活性、稳 定性、催化反应的速度、底物和产物的溶解度 等都有密切关系。
1 必需水
维持酶分子完整的空间构象所必需 的最低水量。 氢键、盐键等次级键。 在无水的条件下，酶的空间构象被 破坏，酶将变性失活。 通过必需水的调控，可以调节有机 介质中酶的催化活性和选择性。
第七章 酶的非水相催化
russellrussell将碱性磷酸酯酶冻干粉悬浮于将碱性磷酸酯酶冻干粉悬浮于44种有机溶剂种有机溶剂二甲基二甲基甲酰胺四氢呋喃乙腈和丙酮甲酰胺四氢呋喃乙腈和丙酮中密封振荡中密封振荡5h5h20h20h和和36h36h离心离心除溶剂冷冻干燥后重新悬浮于缓冲液中以对硝基苯磷酸酯为底除溶剂冷冻干燥后重新悬浮于缓冲液中以对硝基苯磷酸酯为底物测其酶活力物测其酶活力44种有机溶剂使酶发生了不同程度的不可逆失活种有机溶剂使酶发生了不同程度的不可逆失活图图772碱性磷酸酯酶在亲水有机溶剂中的不可逆失活作用碱性磷酸酯酶在亲水有机溶剂中的不可逆失活作用burkeburke用固态核磁共振方法研究了用固态核磁共振方法研究了胰凝乳蛋白酶在冷冻干燥向酶胰凝乳蛋白酶在冷冻干燥向酶粉中添加有机溶剂等过程中酶活性中心结构的变化发现活性中心的破粉中添加有机溶剂等过程中酶活性中心结构的变化发现活性中心的破坏是由于干燥脱水和添加有机溶剂冷冻干燥能破坏坏是由于干燥脱水和添加有机溶剂冷冻干燥能破坏4242的活性中心的活性中心冷冻干燥过程中加入冷冻干燥保护剂冷冻干燥过程中加入冷冻干燥保护剂如蔗糖如蔗糖会不同程度地稳定酶的活会不同程度地稳定酶的活性中心结构
•
他们还发现，有机溶剂中酶分子构象部分破坏的原因还与溶剂的介 电性有关，在高介电常数的溶剂中，随着溶剂介电常数的增大，酶分子 构象将发生去折叠、分子柔性增加。有机溶剂能使酶分子部分地去折叠， 但程度远小于冷冻干燥的过程。 • 他们试图通过测定酶活性中心的变化，解释溶剂极性对酶活力的影响。 但是他们的实验结果表明，不同介质中酶活性中心的完整性差别不大， 而酶活力却相差4个数量级。因此，他们认为酶分子活性中心的改变不是 导致不同介质中酶活力变化的主要原因，酶分子结构的动态变化很可能 是主要因素。 • 酶作为蛋白质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。 这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”(compact)而又有 “柔性”(flexibility)的状态。
•
他们还发现，有机溶剂中酶分子构象部分破坏的原因还与溶剂的介 电性有关，在高介电常数的溶剂中，随着溶剂介电常数的增大，酶分子 构象将发生去折叠、分子柔性增加。有机溶剂能使酶分子部分地去折叠， 但程度远小于冷冻干燥的过程。 • 他们试图通过测定酶活性中心的变化，解释溶剂极性对酶活力的影响。 但是他们的实验结果表明，不同介质中酶活性中心的完整性差别不大， 而酶活力却相差4个数量级。因此，他们认为酶分子活性中心的改变不是 导致不同介质中酶活力变化的主要原因，酶分子结构的动态变化很可能 是主要因素。 • 酶作为蛋白质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。 这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”(compact)而又有 “柔性”(flexibility)的状态。
酶工程-第七-酶的非水相催化
过多水的危害
➢ 过多的水分会进一步水化蛋白中极性低的基团使蛋白构 象更松散引起一些构象微调来降低酶活性，尤其是酶的 “热失活” ；（物理）
➢ 温度升高时酶分子发生可逆折叠，然后进行下述一种或 几种反应：(1)形成不规则的结构；(2)通过消除反应使 二硫键破坏；(3)天冬氨酸和谷氨酰氨残基的脱酰氨；(4) 天冬氨酸残基的肽键水解。（化学）
* 离子液体强极性的特点使它对精细化工和医用产品起始材料的 “构建单元”(如肽、糖、核酸等极性底物)具有的较强的溶解性， 预示着离子液体可能在精细化工和医用产品生产上扮演重要角色。
（3）同时还有很多研究者认为离子液体是一种“可设计”的溶剂，可 以通过合成手段合成一系列结构和性质迥异的离子液体来满足各方 面研究和应用的需求。
(三) 离子液体缺点
离子液体也有一些缺点妨碍着它的应用。 已合成的离子液体大多黏度很高，这势必给底物和产
物的传质带来困难。Kragl等人发现尽管β-糖苷酶在 80°C高温下在离子液体1-甲基-3-甲基咪唑甲基璜酸 盐(1-methyl-3-methylimidazolium methanesulfonate,[MMIM][CH3SO3])中仍具有很高的 稳定性，但80°C的高温仍然没有解决离子液体粘度 较大带来的传质困难。 尽管有些离子液体成本可达到70欧元/kg，但价格仍 然是限制其应用的重要因素。因此离子液体能否能完 全回收利用是其能否工业化应用的重要条件。
五 酶非水相催化的反应介质—离子液体
(一) 离子液体的结构及分类 离子液体是呈现为液态的盐 离子液体是完全由阴阳离子组成且常温下呈液态的
离子化合物，这些离子化合物结构上存在离子结构对 称性低、分子间作用力弱等特点，导致了离子液体熔 点接近室温或低于室温，使离子液体成为一种以液态 方式存在的盐。
第七讲 酶的非水相催化
反胶束体系
①溶剂：
非极性有机溶剂，常用的是六碳以上的直链及支链烷 烃、部分芳香族化合物及卤代烷烃（辛烷、氯仿、二 乙醚），其中正辛烷或异辛烷用得最多
②表面活性剂：
阳离子型(CTAB：溴化十六烷基三甲基胺) 阴离子型(AOT：2-乙基己基-琥珀酸酯磺酸钠) 非离子型（Tween系列） 两性型（卵磷脂）
国内外研究进展：
用酶催化转酯反应拆分外消旋体得高光学纯度对应体 在酶促反应体系中添加ß -糊精可提高对映体的纯度 枯草溶菌素有效催化合成氨基酸及肽的转酯等 杨波等提出了有机溶剂中在脂肪酶的催化作用下含手 性中心碳原子的胺类化合物酰胺化的异构选择性规则 李志远等用胰脂酶在有机介质中催化反应得到高光学 纯度的2-氨基丙醇（R-）和（S+）对映体 宗敏华等探讨了超声辐射对有机相中脂肪酶催化有机 硅醇与脂肪酸反应的促进作用 刘平等研究了有机溶剂中酶催化合成五肽前体的反应
近年来受到人们的普遍关注，其中研究最多的是肽的合成 和脂肪酶的催化反应： Xing等研究了AOT／正辛烷的反胶束体系中α-胰凝乳蛋白酶催 化合成肽衍生物的反应得到56％～88％的产率，而且还对反应 体系的Wo值、反应时间和酶浓度等条件进行了讨论； Chen等在反胶束体系中用不同的蛋白酶合成了二肽； Tsai等研究了AOT／异辛烷／磷酸盐缓冲液中脂肪酶催化油脂 水解反应时表面活性剂浓度对脂肪酶水解活力的影响； 李干佐等研究了AOT／异辛烷／水体系中解脂假丝酵母脂肪酶 催化庚酸和庚醇的酯化反应动力学； Rees等研究了阳离子表面活性剂CTAB的反胶束体系中有色黏 性细菌脂肪酶催化癸酸辛酯的合成； 马成松等还研究了辣根过氧化物酶在AOT／水／异辛烷中多底 物酶促反应等。
分析反胶束体系应用较广的原因？
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底物 ①N-乙酰-L丝氨酸乙酯 ②N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯
疏水性:
介质
蛋白酶
水解速度
水 辛烷
②﹥① ①﹥②
②﹥①
底物专一性(续)
①N-乙酰-L丝氨酸乙酯
不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样； 极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物易反 应; 底物 介质 反应速度 极性较弱的有机溶剂中 ,疏水性较弱的底物易反 二氯甲烷 应;
1、水对酶分子空间构象的影响
无水下酶空间构象被破坏,故需一层水化层; 必需水:维持酶分子完整空间构象所必需的最低 水量; 不同的酶所需求的必需水的量差别较大; 每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚 氧化酶却需3.5×102个水分子 原因:必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等 副键所必需的。
第一节 酶非水相催化的主要内容
受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同
酶的非水相催化类型主要包括:
一、有机介质的酶催化； 二、气相介质的酶催化； 三、超临界流体介质中的酶催化； 四、离子液介质中的酶催化
go
有机介质中的酶催化
指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催 化反应; 适用范围:底物、产物两者或其一为疏水性 物质的酶催化作用; 原因:酶在有机相中能保持结构的完整; 特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域 选择性、键选择性、热稳定性等有所改变； 应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子 合成、手性药物拆分的研究。
３、有机溶剂对底物和产物分配的影响
溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。 溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓 度。 ①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于 进入必需水层；
②有机溶剂极性过强，亲水性强，疏水性底物在 有机溶剂中溶解度太低； 故选择2≦lgp≦5的有机溶剂作为有机介质为宜。
2.水对酶催化反应速度的影响
典型的非水酶体系中水含量通常只占 0.01% ，但 其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。 水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和 稳定性。
3.水活度（activity of water)
有机介质中含两类水：结合水、游离水； 在结合水不变的条件下，体系含水量的变化对酶催化活性影响不大； 然而在一些体系中，溶剂和底物性质对酶活力也有直接或间接影响； 为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling建议用水活度（aw）描述 有机介质中酶催化活力与水的关系： 水活度：体系中水的逸度与纯水逸度之比； 用体系中水蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压之比表示； Aw=P/Байду номын сангаасo P：一定条件下体系中水的蒸汽压 Po:相同条件下纯水的蒸汽压 水活度与溶剂极性大小无关，最适含水量与溶剂极性成正比，故采用 水活度作参数更确切；
三 有机溶剂对有机介质中酶催化的影响
有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用: 一是有机溶剂与酶直接发生作用通过干扰氢键和疏水键等 改变酶的构象从而导致酶的活性被抑制或酶的失活; 二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正 常反应的进行; 三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用
气相介质中的酶催化
指酶在气相介质中进行催化反应； 适用范围：底物是气体或能转化为气体的物 质； 特性：气体介质密度低，扩散容易；与在水 相中明显不同；
超临界流体介质中的酶催化
酶在超临界流体中进行催化反应； 超临界流体指温度和压力超过临界点的流体； supercritical状态，简称SC 状态； 由于黏度、介电常数、扩散系数和溶解能力都与密度有 关，因此可以方便地通过调节压力来控制超临界流体的 物理化学性质。 要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性； 温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。
五、 热力学稳定性
有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高；有机溶剂中酶 的热稳定性还与介质中水含量有关； 原因：可能是有机介质中缺少引起酶变性的水分子； Klibanov和Volkin认为：由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，由 水引起的蛋白质热失活的全过程难以进行。
（2）有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响：通过减少整个 活性中心的数量，溶剂对酶的活性中心产生影响，活性中心数 目丧失的多少取决于溶剂中的疏水性大小。
Why？溶剂与底物竞争酶的活性中心结合位点，溶剂为非极性， 影响更明显，溶剂分子能渗透入酶的活性中心，降低活性中心 的极性，增加酶与底物的静电斥力。
2. 有机溶剂对酶活性的影响
酶
水相
有机相
二、水对有机介质中酶催化的影响
水在酶催化反应中发挥着双重作用: 一方面,水分子直接或间接地通过氢键疏水键及范 德华力等非共价键相互作用来维持酶的催化活 性所必需的构象,与酶分子紧密结合的一层左右 的水分子对酶的催化活性是至关重要的,称之为 必需水,不同酶与必需水结合的紧密程度及所结 合的必需水数量是不同的;
原因
有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲(疏)水性的变化而发生改变。 酶在水溶液中立体选择性强，疏水性强的有机溶剂中的酶的立体选择性差。 这种选择性是由底物的两种对映体把水分子从酶分子疏水结合位臵换出来的能力 不同； 介质的疏水性加大，L型底物臵换水的过程在热力学上不利。
溶剂的几何形状也影响酶的对映体选择性，如 Ottolina报道一些脂肪酶、蛋白酶在（R）-香芹酮 及（S）-香芹酮中立体选择性不同；
2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系 由水与极性较大的有机溶剂互混组成； 水与有机剂含量均较大； 适用的酶较少； 辣根过氧化酶（HRP）应用： 催化酚类或芳香胺类聚合成聚酚或聚胺 类物，在环保黏合剂、导电聚物、发光 聚合物材料中有重要作用。
3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系 由水和疏水性较强的有机溶剂组成两相或 多相体系； 游离酶、亲水性底物溶于水相，疏水性底 物或产物溶于有机相； 固定化酶在界面； 催化反应在两相界面进行； 适于底物或产物属于疏水化合物的反应。
例： 1,4-二丁酰基-2-辛基苯 + 丁醇
脂肪酶
甲苯
K4 ， 1 2
转脂反应
乙腈
0.5
四、键选择性（chemoselectivity)
即同一个底物分子中有2种以上化学键可与酶 反应，酶对其一优先反应；
占优
黑曲霉脂肪酶 毛霉脂肪酶
羟基酰化 氨基酰化
6-氨基-1-己醇
意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；
1. 有机溶剂对酶结构与功能的影响
在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好 地保持其构象； 有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分 子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持 也有不同。 有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏； 有的酶分子则保持完整；
（1）有机溶剂对酶分子表面结构的影响：由于酶分子与溶剂 的直接接触，酶分子表面结构发生变化；
+ 丙醇
枯草杆菌蛋白酶 吡啶
(极性较强)
①﹥② ②﹥①
②N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯 疏水性: ②﹥①
二、对映体选择性（enantioselectivity)
又称立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消 旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标；
立体选择系数：
立体选择系数越大，酶催化的对映体选择性越强
水的影响
另一方面水是导致酶的热失活的重要因素,有水存在时随着温 度的升高酶分子会发生以下变化而失活: (1)形成不规则结构; (2)二硫键受到破坏; (3)天冬酰胺和谷氨酰胺水解变为相应的天冬氨酸和谷氨酸; (4)天冬氨酸肽键发生水解. 因此在非水相酶反应体系中存在着最佳含水量,该最佳含水量 不仅取决于酶的种类也与所选用的有机溶剂有关.
第三节 酶在有机介质中的催化特性
有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精细平 衡,从而影响到酶的结合部位. 有机溶剂会改变底物存在状态. 结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性,立体选 择性,区域选择性和化学键选择性.
一、底物专一性
有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状 态发生改变,致使酶的底物特异性发生改变; 水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用; 有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强;
go
一、有机介质反应体系
1、微水介质体系； 2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系； 3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系； 4、（正）胶束体系； 5、反胶束体系。
1、微水介质体系
是有机溶剂和微量水组成的反应体系; 微量水主要是酶分子结合水,对维持酶分子空间 构象和催化活性至关重要; 另一部分水分配在有机溶剂中; 酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质 中; 是常见的有机反应体系.
（1）有机溶剂对结合水的影响
一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶表面 的必需水而导致酶失活。 酶失水的情况与溶剂的介电常数和疏水性参 数有关。 由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水 量与酶的用量及底物浓度有关。
（2）溶剂属性(极性)与酶活力的定量关系
酶在不同的有机溶剂中活力差别很大； 研究最多的是酶活力与溶剂极性参数lgP之间的关 系； P：指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数，lgP越 大，极性越小； Laane 的实验发现： lgP<2的极性溶剂中，由于溶剂极性强，易夺取酶 分子表面水层而降低酶的活力。 lgP>4，酶具有较高活力，此类溶剂较理想 。 2<lgP<4，酶活力中等。
优点： 1)与水相比较，脂溶性反应物和产物可溶于超临界CO２中，而酶作为蛋白 质不溶解，有利于三者的分离； 2)产品回收时，不需要处理大量的稀水溶液，可解决环境污染问题； 3)与有机溶剂体系相比，CO２无毒，不燃烧、廉价、无有机溶剂残留之虞； 4)CO２超临界体系具有气体的高扩散系数、低粘度和低表面张力使底物向 酶的传质速度加快从而使反应速度提高，且在临界点附近，溶解能力和介 电常数对温度和压力敏感，故反应速度提高。亦可以控制反应速率和反应 平衡； 5)可简化产物的分离，有可能将反应和分离过程耦合。 已对10多种酶反应进行了研究，主要是酯化反应、酯交换反应、酯水解反 应和氧化反应。反应条件温和，反应温度低于50℃
疏水性:
介质
蛋白酶
水解速度
水 辛烷
②﹥① ①﹥②
②﹥①
底物专一性(续)
①N-乙酰-L丝氨酸乙酯
不同的有机介质，酶的底物专一性也不一样； 极性较强的有机溶剂中,疏水性较强的底物易反 应; 底物 介质 反应速度 极性较弱的有机溶剂中 ,疏水性较弱的底物易反 二氯甲烷 应;
1、水对酶分子空间构象的影响
无水下酶空间构象被破坏,故需一层水化层; 必需水:维持酶分子完整空间构象所必需的最低 水量; 不同的酶所需求的必需水的量差别较大; 每分子凝乳蛋白酶只需50分子的水，每分子多酚 氧化酶却需3.5×102个水分子 原因:必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等 副键所必需的。
第一节 酶非水相催化的主要内容
受非水介质的影响，其催化特性与在水相中不同
酶的非水相催化类型主要包括:
一、有机介质的酶催化； 二、气相介质的酶催化； 三、超临界流体介质中的酶催化； 四、离子液介质中的酶催化
go
有机介质中的酶催化
指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催 化反应; 适用范围:底物、产物两者或其一为疏水性 物质的酶催化作用; 原因:酶在有机相中能保持结构的完整; 特性:酶的底物特异性、立体选择性、区域 选择性、键选择性、热稳定性等有所改变； 应用：多肽、酯类、甾体转化、功能高分子 合成、手性药物拆分的研究。
３、有机溶剂对底物和产物分配的影响
溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用。 溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓 度。 ①有机溶剂极性小，疏水性强，疏水性底物难于 进入必需水层；
②有机溶剂极性过强，亲水性强，疏水性底物在 有机溶剂中溶解度太低； 故选择2≦lgp≦5的有机溶剂作为有机介质为宜。
2.水对酶催化反应速度的影响
典型的非水酶体系中水含量通常只占 0.01% ，但 其微小差距会导致酶催化活力的较大改变。 水影响蛋白质结构的完整性、活性位点的极性和 稳定性。
3.水活度（activity of water)
有机介质中含两类水：结合水、游离水； 在结合水不变的条件下，体系含水量的变化对酶催化活性影响不大； 然而在一些体系中，溶剂和底物性质对酶活力也有直接或间接影响； 为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling建议用水活度（aw）描述 有机介质中酶催化活力与水的关系： 水活度：体系中水的逸度与纯水逸度之比； 用体系中水蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压之比表示； Aw=P/Байду номын сангаасo P：一定条件下体系中水的蒸汽压 Po:相同条件下纯水的蒸汽压 水活度与溶剂极性大小无关，最适含水量与溶剂极性成正比，故采用 水活度作参数更确切；
三 有机溶剂对有机介质中酶催化的影响
有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用: 一是有机溶剂与酶直接发生作用通过干扰氢键和疏水键等 改变酶的构象从而导致酶的活性被抑制或酶的失活; 二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正 常反应的进行; 三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用
气相介质中的酶催化
指酶在气相介质中进行催化反应； 适用范围：底物是气体或能转化为气体的物 质； 特性：气体介质密度低，扩散容易；与在水 相中明显不同；
超临界流体介质中的酶催化
酶在超临界流体中进行催化反应； 超临界流体指温度和压力超过临界点的流体； supercritical状态，简称SC 状态； 由于黏度、介电常数、扩散系数和溶解能力都与密度有 关，因此可以方便地通过调节压力来控制超临界流体的 物理化学性质。 要求：超临界流体对酶结构无破坏；具良好化学稳定性； 温度不可太高太低；压力不可太高；易获得等。
五、 热力学稳定性
有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高；有机溶剂中酶 的热稳定性还与介质中水含量有关； 原因：可能是有机介质中缺少引起酶变性的水分子； Klibanov和Volkin认为：由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，由 水引起的蛋白质热失活的全过程难以进行。
（2）有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响：通过减少整个 活性中心的数量，溶剂对酶的活性中心产生影响，活性中心数 目丧失的多少取决于溶剂中的疏水性大小。
Why？溶剂与底物竞争酶的活性中心结合位点，溶剂为非极性， 影响更明显，溶剂分子能渗透入酶的活性中心，降低活性中心 的极性，增加酶与底物的静电斥力。
2. 有机溶剂对酶活性的影响
酶
水相
有机相
二、水对有机介质中酶催化的影响
水在酶催化反应中发挥着双重作用: 一方面,水分子直接或间接地通过氢键疏水键及范 德华力等非共价键相互作用来维持酶的催化活 性所必需的构象,与酶分子紧密结合的一层左右 的水分子对酶的催化活性是至关重要的,称之为 必需水,不同酶与必需水结合的紧密程度及所结 合的必需水数量是不同的;
原因
有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲(疏)水性的变化而发生改变。 酶在水溶液中立体选择性强，疏水性强的有机溶剂中的酶的立体选择性差。 这种选择性是由底物的两种对映体把水分子从酶分子疏水结合位臵换出来的能力 不同； 介质的疏水性加大，L型底物臵换水的过程在热力学上不利。
溶剂的几何形状也影响酶的对映体选择性，如 Ottolina报道一些脂肪酶、蛋白酶在（R）-香芹酮 及（S）-香芹酮中立体选择性不同；
2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系 由水与极性较大的有机溶剂互混组成； 水与有机剂含量均较大； 适用的酶较少； 辣根过氧化酶（HRP）应用： 催化酚类或芳香胺类聚合成聚酚或聚胺 类物，在环保黏合剂、导电聚物、发光 聚合物材料中有重要作用。
3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系 由水和疏水性较强的有机溶剂组成两相或 多相体系； 游离酶、亲水性底物溶于水相，疏水性底 物或产物溶于有机相； 固定化酶在界面； 催化反应在两相界面进行； 适于底物或产物属于疏水化合物的反应。
例： 1,4-二丁酰基-2-辛基苯 + 丁醇
脂肪酶
甲苯
K4 ， 1 2
转脂反应
乙腈
0.5
四、键选择性（chemoselectivity)
即同一个底物分子中有2种以上化学键可与酶 反应，酶对其一优先反应；
占优
黑曲霉脂肪酶 毛霉脂肪酶
羟基酰化 氨基酰化
6-氨基-1-己醇
意义：可在不需基团保护下合成氨基醇脂；
1. 有机溶剂对酶结构与功能的影响
在水溶液中酶分子均一地溶解在水溶液中，较好 地保持其构象； 有机溶剂中酶分子不能直接溶解，因此根据酶分 子特性与有机溶剂特性不同，其空间结构的保持 也有不同。 有些酶在有机溶剂作用下，其结构受到破坏； 有的酶分子则保持完整；
（1）有机溶剂对酶分子表面结构的影响：由于酶分子与溶剂 的直接接触，酶分子表面结构发生变化；
+ 丙醇
枯草杆菌蛋白酶 吡啶
(极性较强)
①﹥② ②﹥①
②N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯 疏水性: ②﹥①
二、对映体选择性（enantioselectivity)
又称立体选择性或立体异构专一性，是酶在对称的外消 旋化合物中识别一种异构体的能力大小的指标；
立体选择系数：
立体选择系数越大，酶催化的对映体选择性越强
水的影响
另一方面水是导致酶的热失活的重要因素,有水存在时随着温 度的升高酶分子会发生以下变化而失活: (1)形成不规则结构; (2)二硫键受到破坏; (3)天冬酰胺和谷氨酰胺水解变为相应的天冬氨酸和谷氨酸; (4)天冬氨酸肽键发生水解. 因此在非水相酶反应体系中存在着最佳含水量,该最佳含水量 不仅取决于酶的种类也与所选用的有机溶剂有关.
第三节 酶在有机介质中的催化特性
有机溶剂的存在,改变了疏水相互作用的精细平 衡,从而影响到酶的结合部位. 有机溶剂会改变底物存在状态. 结果影响酶的稳定性和酶的底物特异性,立体选 择性,区域选择性和化学键选择性.
一、底物专一性
有机介质中酶活性中心结合部位与底物的结合状 态发生改变,致使酶的底物特异性发生改变; 水溶液中底物与酶活性中心结合靠疏水作用; 有机介质中有机剂与底物的疏水作用更强;
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一、有机介质反应体系
1、微水介质体系； 2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系； 3、与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系； 4、（正）胶束体系； 5、反胶束体系。
1、微水介质体系
是有机溶剂和微量水组成的反应体系; 微量水主要是酶分子结合水,对维持酶分子空间 构象和催化活性至关重要; 另一部分水分配在有机溶剂中; 酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质 中; 是常见的有机反应体系.
（1）有机溶剂对结合水的影响
一些相对亲水性的有机溶剂能够夺取酶表面 的必需水而导致酶失活。 酶失水的情况与溶剂的介电常数和疏水性参 数有关。 由于酶与溶剂竞争水分子，体系的最适含水 量与酶的用量及底物浓度有关。
（2）溶剂属性(极性)与酶活力的定量关系
酶在不同的有机溶剂中活力差别很大； 研究最多的是酶活力与溶剂极性参数lgP之间的关 系； P：指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数，lgP越 大，极性越小； Laane 的实验发现： lgP<2的极性溶剂中，由于溶剂极性强，易夺取酶 分子表面水层而降低酶的活力。 lgP>4，酶具有较高活力，此类溶剂较理想 。 2<lgP<4，酶活力中等。
优点： 1)与水相比较，脂溶性反应物和产物可溶于超临界CO２中，而酶作为蛋白 质不溶解，有利于三者的分离； 2)产品回收时，不需要处理大量的稀水溶液，可解决环境污染问题； 3)与有机溶剂体系相比，CO２无毒，不燃烧、廉价、无有机溶剂残留之虞； 4)CO２超临界体系具有气体的高扩散系数、低粘度和低表面张力使底物向 酶的传质速度加快从而使反应速度提高，且在临界点附近，溶解能力和介 电常数对温度和压力敏感，故反应速度提高。亦可以控制反应速率和反应 平衡； 5)可简化产物的分离，有可能将反应和分离过程耦合。 已对10多种酶反应进行了研究，主要是酯化反应、酯交换反应、酯水解反 应和氧化反应。反应条件温和，反应温度低于50℃