电泳技术

CH2=CH C=O NH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH CH2-CH( CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O C=O NH2 NH NH2 CH2 NH C=O CH2-CH ( CH2-CH)n CH2-CH ( CH2-CH )m CH2-CH C=O NH2 C=O NH2 C=O
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不同浓度（T%）和不同交联度（C%）的凝胶电镜照片 15
凝胶浓度与被分离物相对分子质量的关系
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SDS-PAGE电泳
还原型SDS-PAGE电泳
SDS、2-巯基乙醇
非变性PAGE电泳 （Native-PAGE）
非还原型SDS-PAGE电泳
SDS
SDS-尿素胶 Tricine-SDS-PAGE
AP(核黄素 核黄素) 核黄素 TEMED
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聚丙烯酰胺凝胶的优点 聚丙烯酰胺凝胶的优点
在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应； 对pH和温度变化较稳定； 几乎无电渗作用； 样品不易扩散，其灵敏度可达10-6g； 凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节； 凝胶孔径与蛋白质分子大小相近，分辨率高； 易于显色和观察； 与后续蛋白质提纯和鉴定方法兼容性较好。
1809年
1909年
1937年
1948年
1960s
1970s
1990s
Michaelis在U形 管中电泳，提出 电泳概念。
等电聚焦电泳、双向电 Wieland和 泳、印迹转移电泳等。 Fischer建立纸 电泳分离氨基酸 圆盘电泳、垂直板电泳、 双向电泳、脉冲电泳等。
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电泳的分类
自由界面电泳 滤纸电泳 U型管电泳
（A为正面，B为剖面） 1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.7 3：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3 10
不连续凝胶电泳的特点
在不连续的系统里，存在三种物理效应， 在不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的 浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应， 浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这 三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。 三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。
1967年
1981年
1984年
1987年
Jorgenson，75um，荧光检测器
Hjerten，cIEF Kanger，CGE
每两年
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毛细管电泳技术的特点
与传统电泳技术比较：毛细管内径小，比表面积大，易于散 热，减少焦耳热的产生。 与HPLC比较： 柱效高，理论板数可达105-106m-1； 分析速度快，几十秒至十几分钟内即可完成一个试样的 分析； 溶剂和样品消耗极少，样品用量仅为纳升（nL）级。 不需高压泵输液，毛细管价格低廉，因此工作成本更低； 通过改变操作模式和缓冲溶液的成分，该法有很大的选 择性，可对各种成分进行有效的分离。
电泳技术及其在抗体药物分析 中的应用
主 要 内 容
电泳技术概述 聚丙烯酰胺凝胶电泳 毛细管电泳
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电泳技术概述
电泳技术
带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动， 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动， 在电场作用下向着与其电性相反的电极移动 称为电泳（ 称为电泳（electrophoresis，EP）。 电泳 ， ） 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的 电泳技术。 方法和技术叫电泳法或电泳技术 方法和技术叫电泳法或电泳技术。
SiO2+2OH-
SiO32-
阴离子运动方向与电渗流（EOF） ν-=ν电渗流-ν-ef 阴离子运动方向与电渗流（EOF）相反 34
HC
200
100
50
蛋白质定量 LC 蛋白质水解的分析 Western blotting 免疫印迹的第一步 analysis for reduced IgG 蛋白质修饰的鉴定 Marker 1 2 3 4 分离和浓缩用于产生抗体的抗原 电泳后蛋白质的洗脱
被动扩散 电洗脱
1、3: with PNGase 2、4: without PNGase
琼脂糖凝胶（ ） 琼脂糖凝胶（AG）
琼脂糖在氢键作用下结合，孔径大, 分离速度快, 稳定性差（几天）
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毛细管凝胶电泳（ 毛细管凝胶电泳（CGE） ） 1.
2.
3.
---------------------------------------------------------------------------------+++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ------------------------------------------------------+++++++++++++++++++++++++++++++++++++ ---- ---------------------------- + ++++++++++++++++++++++++++++++++++++
免疫学染色
Western Blotting，ng
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蛋白质分子量和纯度分析
应用范围
放射性标记样品的检测
凝胶迁移或电泳迁移率实验 （electrophoretic mobility shift assay，EMSA）
电泳迁移率对分子量的对数作图
Marker 6 4 2 1 0.5 0.25
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应用范围
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SDS-PAGE凝胶电泳操作 凝胶电泳操作 凝胶电泳
配制缓冲液 配制凝胶 加样 安装装置 电泳 显色:染色、漂洗、 显色:染色、漂洗、检测
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配制凝胶
凝胶不聚合：AP或TEMED量不够，质量差、 或失效。温度太低。
加样
蛋白沉淀：蛋白质变性、SDS量太少、还原剂太少、 过度的酸性环境。 样品混合物黄色：溶液偏酸，加NaOH，否则，蛋 白质发成反常迁移。 空孔加入等量上样缓冲液。 储存在-20 ℃的已煮沸的样品，上样前使其升至室 温，使SDS沉淀溶液。 19
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凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
T=
Acr（g）+Bis（g） （ ） （ ） V（ml） （ ）
X100%
C=
Bis（g） （ ） Acr（g）+Bis（g） （ ） （ ） X100%
T：凝胶总浓度 C：交联度
凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大， 凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大， 孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小， 孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小， 凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后， 凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联 度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过 或低于5%时凝胶孔 度为 时 凝胶具有最小孔径，超过5%或低于 时凝胶孔 或低于 径都要增大。 径都要增大。
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分离的原理
支持介质
区带电泳
形状
琼脂凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 自由电泳
柱状电泳
毛细管电泳
平板电泳
4
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶 作为支持介质的一种电泳方法。
5
聚丙烯酰胺凝胶的特点 聚丙烯酰胺凝胶的特点
目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其 目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其 生物化学与分子生物学 密切相关的医学、 密切相关的医学、农、林、牧、渔、制药及某些工业分 析中必不可少的手段。 析中必不可少的手段。
2
电泳技术的发展过程
Rеuсе进 行了世界 上第一次 电泳实验。 Tiselius建立了研究蛋 白质的移动界面电泳 方法，并证明血清由 白蛋白及α、β、γ球蛋 白组成的 1948年诺贝尔化学奖 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳 毛细管电 泳技术
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梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳（PG-PAGE） ）
形成梯度凝胶：从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度 呈梯度变化，如通常顶部凝胶浓度为5％，底部凝 胶浓度为25％。 凝胶梯度是通过梯度混合器形成。
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蛋白质溶液浓缩
三氯醋酸沉淀法 丙酮沉淀法 免疫沉淀法 硫酸铵沉淀法 有机溶剂沉淀法 聚乙二醇沉淀法 超滤法 透析法 离子交换层析 冷冻干燥
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分子筛效应
蛋白质进入pH8.9的同一孔径的分离胶后，分子小且为 球状的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面； 反之，则阻力大，移动慢，走在后面，从而通过凝胶 的分子筛作用将各种蛋白质分成各自的区带。
电荷效应
在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不 同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则慢。
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毛细管凝胶电泳（ 毛细管凝胶电泳（CGE） ）
毛细管凝胶柱制备技术 聚丙烯酰胺凝胶( 聚丙烯酰胺凝胶 PAG)
AP Acr+Bis TEMED
凝胶柱制备过程中 PAG
交联凝胶：凝胶缺陷（bubble或void）
电渗流效应 分离过程产生 离子贫化效应 样品效应
线性高分子凝胶：制备方法简单，牺牲交联凝胶的高分离能力 而获得良好的重现性 主要线性高分子材料：线性聚丙烯酰胺（linear polyacrylamide， LPA）
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银染（sliver stain）
检测限1ng
荧光染料
丹磺酰氯(2，5-二甲氨基萘磺酰氯dansyl chloride，DNS-C1) (2 5dansyl chloride DNS-C1) 荧光胺(fluorescamine，又称fluram) 2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮(MDPF) 1-苯胺基-8-萘磺酸
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毛细管电泳
毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又 称高效毛细管电泳（HPCE），是指离子或带电 粒子以毛细管为分离室，以高压直流电场为驱 动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为 上的差异而实现分离的液相分离分析技术。
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毛细管电泳技术的发展
Terabe，MECK Hjerten，CZE（3mm毛细管）
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毛细管电泳仪基本结构
进样系统、高压系统、毛细管、温控系统、数据采集处理系统
冷却系统: 液冷、风冷。
进样系统：气 压进样、电压 进样。
紫外检测器、二极管阵列 检测器、激光诱导荧光检 测器、电化学检测器、质 谱检测器等。
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毛细管电泳的分类
毛细管区带电泳（ 毛细管区带电泳（CZE） ） 毛细管凝胶电泳（ 毛细管凝胶电泳（CGE） ） 毛细管等电聚焦电泳（ 毛细管等电聚焦电泳（cIEF） ） 胶束电动力学电泳（ 胶束电动力学电泳（MECC） ） 等速聚焦电泳（ 等速聚焦电泳（ITP） ）
特别适合蛋白质理化分析
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聚丙烯酰胺凝胶的分类 聚丙烯酰胺凝胶的分类
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连 续系统两大类。
SDS-PAGE电泳 IEF-PAGE电泳 PG-PAGE电泳
目前常用的多为圆盘电泳和板状电泳。
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电泳槽
迷你双垂直电泳槽
卧式电泳槽
等电聚焦多用电泳槽
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聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
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样品的浓缩效应
凝胶孔径的不连续性
浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶
缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 pH
均有Tris及HCl,Cl-（快离子） 电泳缓冲液（Gly，pI=6.0，慢离子）
电位梯度的不连续性
快离子的快速移动会形成一个低电导区
蛋白样品压缩成狭窄的区带
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电洗脱仪
GeBAflex管电洗脱
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聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳（ 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳（IEF-PAGE） ）
利用pI不同，以PAGE为电泳支持物，并在其中加 入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载 体在凝胶中移动，形成pH梯度。 pH 蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而 聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳 （isoelectric focusing-PAGE，IEF-PAGE）。
显色
氨基黑10B（amino black 10B） 考马斯亮蓝（Coomassie brilliant blue，CBB ）
检测限100ng R250：偏红，慢染，脱色脱的完全，比氨基黑高5倍 G250：偏绿，快染，脱色脱的不彻底，比氨基黑高3倍， 适合定量
固绿(Fast green，FG)
染色灵敏度不如CBB，近似于氨基黑，但却可克服CBB 在脱色时易溶解出来的缺点。