平面色谱法

2、氧化铝 氧化铝可分为中性(pH7.5),碱性 (pH9.0)和 酸性(pH4.0)三种。
应用范围： 碱性氧化铝用来分离中性或碱性化合物， 如生物碱、脂溶性维生素等。 中性氧化铝适用于酸性及对碱不稳定的 化合物的分离。 酸性氧化铝可用于酸性化合物的分离。
表19-1 硅胶与氧化铝的活度与含水量的关系
Rr = Rf(a) / Rf(s) = La / Ls
薄层色谱Rr值的示意图
参考物质可以是加入试样的纯物质，也 可以是试样中的某一已知组分。
Rr的优点： 1）可以消除系统误差，重现性和可比 性都比Rf好。 2） Rr可以大于1，也可以小于1。
(二)相平衡参数
分配系数K 和容量因子k。
1因. K为、k与RRf值' 的v关系 u
(三)面效参数 理论塔板数，塔板高度
1.理论塔板数(number of theoretical plate;n)：反映组分在固定相和流动相中 动力学特性的色谱技术参数，代表色谱 分离效能的指标。
计算公式
n =16(L/W)2 L:原点到斑点中心 的距离， W：组分斑点的纵 向宽度。 若L相等，斑点越集 中，即W越小，n越 大。
吸附薄层色谱法 分配薄层色谱法 分子排阻薄层色谱法 胶束薄层色谱法
按分离效能分: 经典薄层色谱法 高效薄层色谱法
(一)吸附薄层色谱法 定义:固定相为吸附剂的薄层色谱法为 吸附薄层色谱法。
分离原理：将A、B两组分的混合溶液 点在薄层板的一端，在密闭的容器中 用适当的溶剂(展开剂，developing solvent,developer)展开。
Rf = L / L0
定时展开, L=ut, L0=u0t, L/L0=u/u0
v=u,u=u0 ; 所以 Rf =R΄
R' 1
1 k
Rf
1 1 k
或
k 1 Rf Rf
1 R'
1 K Vs Vm
则
Rf

1
1 KVs
/ Vm
Rf =1，K=0，k=0,组分不被固定相保留。 Rf =0，K=k=∞，组分停留在原点，完全 被固定相保留。
R (L2 L1) 2d (W1 W2 ) / 2 W1 W2
L2 ,L1:分别为原点至两斑点中心的距 离。 d:两斑点中心的距离， W1,W2：斑点的宽度。
2.分离数(separation number; SN) 分离数是衡量平面色谱分离容量的主 要参数，也是面效的评价参数。
20cm的硅胶板上，用氯仿-乙醇-庚烷(1:1:1)为 展开剂上行展开。当展开剂前沿距板上沿1.5cm 时停止展开。此时，磺胺嘧啶斑点距板下沿 6.7cm，斑点直径9mm。磺胺噻唑斑点距板下沿 9.2cm，斑点直径12mm。已知样品原点距板下沿
2cm,计算它们的Rf值各为多少？分离度又是多
少？ 解：L0=20-1.5-2=16.5cm L嘧=6.7-2=5.7cm, Rf嘧 =L嘧/L0=5.7/16.5=0.28 L噻=9.2-2=7.2cm, Rf噻=L/L0=7.2/16.5=0.44
薄层色谱法的特点： ①分离能力强，斑点集中。
②灵敏度高，几微克，甚至几十纳克 的物质也能检出。
③展开时间短，一般只需十至几十分 钟。一次可以同时展开多个试样。
④试样预处理简单，对被分离物质性 质没有限制。 ⑤点样量较大，可点成点或条状。 ⑥所用仪器简单，操作方便。
一、薄层色谱法的主要类型 按使用的固定相和分离机制分：
1.硅胶 吸附特性：硅胶为多孔性无定形粉末， 表面带有硅醇基(silanol, Si OH )呈弱酸 性，通过硅醇基(吸附中心)与极
性基团形成氢键而表现其吸附性能， 由于各组分的极性基团与硅醇基形成 氢键的能力不同，而各组分被分离。
O H·····O H Si O Si
活化：硅胶吸附水分形成水合硅醇基而 失去吸附能力，将硅胶加热至100℃左 右，该水能可逆被除去，而提高活度， 这一过程称为“活化”(activation).
2.相对比移值(relative Rf ,Rr) 定义：组分与参考物质在同一条件下
的Rf值(或移行距离)之比。
计算公式
Rf = Rf(i) / Rf(s) = L(i) / L(s) 其中 Rf(i)：组分i的Rf值。 Rf(s)：参考物质的Rf值。
同一条件 下测得。
前沿 S A
l0
原点
ls la
薄层色谱法： 1938年 产生 20世纪60年代 发展和普及 20世纪80年代 仪器化薄层色谱法 (instrumental thin layer chromatography))
第一节 平面色谱法的分类和原理
• 平面色谱法的分类 • 平面色谱法参数
一、平面色谱法的分类
按操作方式分为薄层色谱法、纸色谱法、 薄层电泳法。
(b0 b1) (0.36 0.94)
分离数SN=7.3，说明TLC板为普通板， 板效不高。HPTLC板的SN应大于10。
第二节 薄层色谱法
• 薄层色谱法的主要类型 • 吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂 • 薄层色谱操作方法 • 定性和定量分析 • 高效薄层色谱法 • 薄层扫描法 • 薄层色谱的应用及实例
第十九章 平面色谱法
• 平面色谱法的分类和原理 • 薄层色谱法 • 纸色谱法
平面色谱法(plane chromatography): 在平面上进行分离的一种色谱方法， 主要包括薄层色谱法和纸色谱法。
纸色谱法： 20世纪40年代 产生 应用于生化医药学方面的微量分析。 20世纪60年代后，应用减少。
常见化合物的极性由小到大为： 烷烃( CH3, CH2 )＜烯烃( CH CH ) ＜醚( OCH3, OCH2 )＜硝基化合物 ( NO2)＜酯＜酮( C O)＜醛( CHO)
＜胺( NH2)＜醇( OH)＜酚(Ar OH) ＜羧酸( COOH)。
常用溶剂的极性强弱： 水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇
定义：在相邻斑点分离度为1.177时， 在Rf=0和Rf=1两种组分斑点之间能容纳 的色谱斑点数。
计算公式: SN=L0/(b0+b1)-1
b0,b1: Rf=0和Rf=1的组分的半峰宽。
SN越大，平面的容量越大。经典薄层 板的分离数为7～10，高效薄层板的 分离数在10～20范围内。
例1：含磺胺嘧啶和磺胺噻唑的样品，在20cm×
2.塔板高度(height of theoretical plate;H) 塔板高度是由理论塔板数及原点到展开 剂前沿的距离(L0)算出的单位理论塔板 的长度。
计算公式： H= L0/n
H与n成反比，n值越大，H值越小。
(四)分离参数 分离度和分离数
1.分离度 (resolution; R): 两相邻斑点中心的 距离与两斑点平均 宽度的比值。 计算公式：R = 2(L2 –L1) /(W1+W2) =2d/(W1+W2)
A,B两组分 吸附剂
吸附
新的吸附剂
A，B移动
吸附
展开剂溶解 解吸附
展开剂 薄层板上
解吸
吸附，解吸附，再吸附
再解吸，反复多次
A ,B得以分离
KA＞KB, RfA＜RfB
注意：一般极性大的组分移动速度慢， 极性小的组分移动速度快。
(二)分配薄层色谱法 定义：利用试样中各组分在固定相与流 动相之间的分配系数的不同，各组分在 板上迁移速度不同而获得分离的薄层色 谱法。
1.薄层色谱法 定义：把固定相均匀地铺在玻璃板、铝 箔或塑料板上形成薄层，在此薄层上进 行色谱分离，称薄层色谱法。 分离原理：随所用的固定相不同而异， 与柱色谱相同。
2.纸色谱法 定义：以纸作为载体的色谱法。 分离原理：属于分配色谱的范畴。
3.薄层电泳法 电泳法是指带电荷的分离物质(蛋白质、 核苷酸、多肽、糖类等)在纸、醋酸纤维 素、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶等支 持介质上，向与其相反的电极方向以不 同速度泳动(或迁移)而实现分离，然后 对组分进行定性和定量的方法。聚丙烯 胺凝胶平板电泳等属平面色谱。
二、平面色谱法参数
(一)定性参数 比移值 ，相对比移值。
1.比移值(retardation factor, Rf) 定义：比移值是溶质移动距离与流动相 移动距离之比。或者说原点到斑点中心 的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。
基本公式：
Rf= L/L0 L:原点(origin)至斑点中心 的距离， L0：原点至溶剂(solent front)前沿的距离。 要求: 0＜Rf ＜1 适宜范围：0.2＜Rf ＜0.8 最佳：0.3＜Rf ＜0.5
3.硬板的制备：
硬板加了粘合剂，常用的粘合剂有羧甲 基纤维素钠(CMC-Na)和锻石膏 (CaSO4·1/2H2O)两种。
a.硅胶-G板制备 商品硅胶-G本身含有13%的锻石膏,制备 时只需取一定量的硅胶-G在研钵中，加 2～3倍量的水，朝同一方向研磨成糊状， 当稠度适宜时，立即铺板。
b.硅胶-CMC板制备 取羧甲基纤维素钠5～7g,加1000ml水， 加热使溶解，放置澄清，取上清液 100ml,分次加入硅胶约33g,调成糊状。 去除气泡后，将糊状的吸附剂倒在清 洁的玻璃板上，使均匀涂布于整块玻 璃板上，平放自然晾干，105℃活化1h, 置干燥器中保存备用。
c.硅胶GF254板的制备 取硅胶GF254板5g, 加入15～17mL 4‰ 的CMC-Na，调成糊状。去除气泡后，
硅胶的类型： 常用的有硅胶H、硅胶G和硅胶GF254。
硅胶H不含黏合剂，铺成硬板需另加粘 合剂。 硅胶G是硅胶和锻石膏混合而成。 硅胶GF254含锻石膏和无机荧光剂，即锰 激活的硅酸锌(Zn2SiO4:Mn),在254nm紫 外光下呈强烈黄绿色荧光背景。
应用范围：
酸性和中性物质的分离。如有机酸、酚 类、醛类等。
＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二 氯甲烷＞甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯 化碳＞环己烷＞石油醚
选择原则： 先用单一溶剂展开，根据被分离物质在 薄层上的分离效果，进一步考虑改变展 开剂的极性，即采用二元、三元甚至多 元展开剂。
选择依据见 Stahl设计的 一个简图。
例：某物质用氯仿展开时，⑴Rf值太小， 甚至停留在原点，该如何调整展开剂？ ⑵若Rf值太大，斑点在前沿附近，又 该如何调整展开剂？
定义： 1.薄层色谱法(thin layer chromatography; TLC):将细粉状的吸附剂或载体涂布于 玻璃板、塑料板或铝箔上，成一均匀薄 层，经点样、展开与显色后，与适宜的 对照物质在同一薄层板上所得的色谱斑 点作比较，用于进行定性鉴别或含量测 定的方法。 2.薄板(thin layer plate):铺好薄层的板， 称为薄板或薄层板。
解： ⑴Rf值太小，说明流动相极性太 小，应该加大流动相的极性。在氯仿 中加入一定量的甲醇或丙酮。 ⑵若Rf值太大，说明流动相极性太大， 应加入一定量的烷烃或石油醚。
三、薄层色谱操作方法 薄层色谱法一般操作程序可分为制板、 点样、预饱和、展开和显色5个步骤。
（一）薄层板的制备
1.对玻璃板的要求： 表面光滑，清洁。 2.对薄层板的要求： 吸附剂涂铺均匀，表面光滑，厚度一致。 一般厚度为250μm为宜。
分类 正相色谱：流动相的极性比固定相小。 反向色谱：流动相的极性比固定相大。
在正相色谱中，极性大的组分在固定 相中保留时间大，分配系数大，Rf值 小； 在反相色谱中，极性大的组分在固定 相中保留时间短，分配系数小，Rf值 大；
二、吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂
(一)吸附剂 吸附薄层色谱法的固定相(stationary phase)为吸附剂，常用吸附剂有硅胶、 氧化铝和聚酰胺等。
R 2d 2 (9.2 6.7) 2.4 W1 W2 0.9 1.2
例2：用薄层扫描法在一氧化铝薄层板 上物测质得半如峰下宽数为据3.6：mLm0;=R1f=0.18的cm物,R质f=半0的峰 宽为9.4mm，试评价该薄层板的板效。
解：SN L0 1 10.8 1 7.3
硅胶含水量%
0 5 15 25 38
活性级
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
氧化铝含水量%
0 3 6 10 15
含水量越高，活性越弱。
源自文库
（二）展开剂 展开剂选择是薄层分离成功的重要条 件之一。
选择依据： 根据被分离物质的极性、吸附剂的活性、 展开剂的极性来考虑。 一般的极性大的组分用极性大的展开剂， 极性小的组分用极性小的展开剂，即 “相似相溶原则”。