酶联免疫反应常用底物
【医学PPT课件】酶免疫测定技术
4. 酶结合物的制备： ⑴ 戊二醛交联法 ⑵ 过碘酸盐氧化法
二、反应条件的选择 1. 酶标二抗浓度：100ug/L IgG，加稀释的酶标
二抗，取OD=0.8者。 2. 包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法 3. 3. 温度、时间等
4. 三、操作标准化 5. 1 加样 6. 2 保温 7. 3 洗涤 8. 4 比色 9.
五. ELISA出现“一片黄”的原因： ⑴酶结合物浓度过高 ⑵底物不新鲜 ⑶洗涤不干净 六.ELISA出现“一片白”的原因： ⑴载体吸附性能差 ⑵底物错 ⑶稀释液作包被液 ⑷加错试剂 ⑸包被时间过短 ⑹酶活力低或下降 ⑺样品含有NaN3。
第三节 酶标记技术的发展
一、斑点ELISA 二、免疫印迹法 三、重组免疫结合试验 四、亲和素-生物素系统
二、反应条件的选择 ㈠ 酶标二抗浓度选择 ㈡ 包被抗原浓度的选择
三、操作标准化
一、试剂制备：
㈠ 免疫吸附剂
1. 固相载体
2. ⑴ 要求：① 吸附力强
3.
② 能保持Ag或Ab活性
4.
③ 不参与化学反应
5. ⑵ 载体性能比较
6. ① 载体材料：+、- 结果差别大
7. ② ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG， 显色后，测20孔的OD，要求CV<10%。
底增 加。 5. 标本用NaN3防腐，可出现假“-”。
试剂的准备：
注意不同地区冬、夏温差，可造成达到 37℃的时间差异，对弱阳性结果有很大 影响。
加样：
总体积约360ul，包被和封闭均为100ul， 未封闭部分可吸附非特异蛋白
温育：
1 4℃过夜最佳， 37℃2h较好， 2 43℃20min可造成弱“+”假“-” 3 2 水浴较温箱等空气浴均匀
分子医学练习题
单选题:1.酶联免疫吸附试验间接法的“酶联”意指( )A．酶与酶标反应板相结合B．酶与已知抗原相结合C．酶与已知抗体相结合D．酶与免疫学反应相结合E．酶与抗原抗体复合物相结合2.酶联免疫吸附试验是最常用的一种( )A．免疫荧光技术B．同位素标记技术C．免疫酶技术D．免疫组化技术E．以上都不是3.酶联免疫吸附试验双抗体夹心法一般用于检测( )A．抗原B．抗体C．补体D．酶E．蛋白质4.酶联免疫吸附试验竞争法可以用于检测( )A．抗原B．抗体C．抗原或抗体D．酶E．补体5.若要检测血清中的某种抗体，我们可选择酶联免疫吸附试验的( )A．间接法B．双抗体夹心法C．竞争法D．以上A或C E．以上B或C6.若要检测某种抗原，我们可选择酶联免疫吸附试验的( )A．间接法B．双抗体夹心法C．竞争法D．以上A或C E．以上B或C7.酶联免疫吸附试验双抗体夹心法第一步吸附到酶标反应板上的是( )A．已知抗原B．已知抗体C．已知抗原或抗体D．已知酶标抗体E．已知酶标抗原8.酶联免疫吸附试验间接法第三步吸附到酶标反应板上的是( )A．待测抗原B．待测抗体C．待测抗原或抗体D．待测酶标抗体E．待测酶标抗原9.酶联免疫吸附试验间接法第四步吸附到酶标反应板上的是( )A．已知抗原B．已知抗体C．已知抗原或抗体D．已知酶标二抗E．已知酶标抗原10.酶联免疫吸附试验每步的洗涤非常重要，洗涤的目的主要是( )A．洗去影响实验结果的杂质B．洗去吸附不牢的抗原（或抗体），以及非特异性吸附的抗原（或抗体）C．洗去吸附不牢的抗原（或抗体）D．洗去非特异性吸附的抗原（或抗体）E．洗去与实验反应无关的物质11.酶联免疫吸附试验最常用的酶是( )A．细胞色素氧化酶B．辣根过氧化物酶C．蛋白酶D．核酸酶E．Taq酶12.酶联免疫吸附试验最终酶催化的常用底物是( )A．ODA B．MAC C．TMB D．ABTS E．5-AS13.酶联免疫吸附试验间接法参与反应的免疫学成分包括( )A．一种抗原和两种抗体B．一种抗体和两种抗原C．一种抗原和一种抗体D．一种抗原、一种抗体和补体E．一种抗原、一种抗体和一种酶14.酶联免疫吸附试验间接法检测结果，底物的显色程度( )A．与待测抗体呈反比B．与待测抗体呈正比C．与包被抗原呈反比D．与包被抗原呈反比E．与底物量呈正比15.系统性红斑狼疮可通过酶联免疫吸附试验间接法检测的血清中（）A．抗线粒体抗体B．抗红细胞抗体C．抗甲状腺球蛋白抗体D．类风湿因子E．抗核抗体16.酶联免疫吸附试验间接法底物显色后用于终止反应的物质是( )A．1mol/L H2S04 B．2mol/L H2S04 C．1mol/L HCL D．2mol/L HCL E．以上都不对17.酶联免疫吸附试验间接法用酶标仪测定实验结果时（用TMB做底物），选择的波长为( )A．450nm B．492 nm C．260 nm D．300 nm E．270 nm18.下列关于酶联免疫吸附试验的内容，错误的是( )A．酶联免疫吸附试验是一种常用的免疫酶技术B．将酶催化的高效性和抗原抗体反应的特异性有机的结合在一起C．灵敏度非常高D．测抗体通常选择双抗体夹心法E．参与反应的通常不只一对抗原-抗体系统19.酶联免疫吸附试验双抗体夹心法适用于检测的是( )A．小分子半抗原B．多价抗原C．单体抗体D．聚体抗体E．小分子抗体20.下列关于酶标仪的描述，错误的是( )A．使用酶标仪前必须预热B．酶标仪和分光光度计的原理相同C．使用后直接拔下电源插头D．避免太阳光直射酶标仪E．酶标仪是酶联免疫吸附试验的专用仪器21.下列物质不能作为免疫标记技术的示踪物质的是( )A．EB B．放射性核素C．酶D．胶体金E．荧光素22.关于如何使用微量加样器的描述错误的是( )A．微量加样器不用时应调到最大值B．使用之前先将其调节至所需的刻度C．取液时应先按下微量加样器按杆至第一阻力处，再吸取液体D．吸尖安装时不可使用手E．加样时不应该将微量加样器按杆按到底23.下列与PCR反应无关的物质是( )A．酶B．引物C．dNTP D．模板DNA E．Ca2+24.决定PCR反应特异性的关键物质是( )A．酶B．引物C．dNTP D．模板DNA E．Ma2+25.用于PCR的引物的适宜长度为( )A．15 bp～30bp B．10 bp～20bp C．20 bp～30bp D．25 bp～50bp E．30 bp～45bp26.用于PCR的引物，其碱基尽可能随机分布，G+C含量不宜过高或过低，其最适宜的比例是( )A．10%～30% B．20%～40% C．30%～50% D．40%～60%E．60%～80%27.决定PCR反应特异性的因素中最关键的是 ( )A．引物与模板DNA特异正确的结合B．碱基配对原则C．Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性D．靶基因的特异性与保守性E．以上都不对28.PCR反应中，若目的DNA长度不足1Kb，延伸的温度与时间宜为( )A．65℃lmin B．65℃2min C．72℃1min D．72℃2min E．94℃lmin29.PCR反应的循环次数一般为( )A．10次～20次B．15次～25次C．25次～35次D．40次～50次E．50次～60次30.理论上PCR过程中反应产物是以指数规模增长的，而实际的PCR扩增曲线呈现( ) A．直线形B．S形C．V形D．U形E．抛物线形31.关于PCR反应体系中Mg2+的描述，正确的是( )A．Mg2+浓度对PCR反应特异性无影响B．Mg2+浓度浓度以1.5mmol/L～2.0mmol/L为宜C．Mg2+浓度过低可降低PCR扩增的特异性D．浓度过高则影响会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少E．以上都不对32.关于PCR反应体系中dNTP的描述，正确的是( )A．4种dNTP浓度差不多即可B．dNTP浓度过低会增加碱基的错误掺入率，使反应特异性下降C．dNTP浓度过高反而会导致反应速度下降D．均衡的dNTP有利于减少错配和提高使用效率E．以上都不对33.关于PCR反应的退火温度与时间的描述，错误的是( )A．退火温度=Tm值（解链温度）-（5℃～10℃）B．复性时间一般为30～60secC．退火温度与时间取决于目的基因的长度D．退火温度太低容易发生引物与模板之间的非特异结合E．退火温度太高不能有效退火34.关于PCR反应的延伸温度与时间的描述，错误的是( )A．延伸常用温度为65℃B．延伸温度过高不利于引物和模板的结合C．延伸时间一般为1min /1KbD．延伸时间过长，会出现非特异性的扩增产物E．对低浓度模板的扩增，延伸时间可以稍长些35.Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度是( )A．37℃B．50℃~55℃C．60℃~65℃D．70℃~75℃E．93℃~94℃36.关于PCR反应中引物的描述，错误的是( )A．引物的适宜浓度约为0.1～1mol/LB．引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增C．引物浓度偏高可增加引物之间形成二聚体的机会D．引物应与目的基因以外的其它序列无明显同源性E．引物长度常为20bp左右37.关于PCR反应体系中Mg2+的描述，错误的是( )A．Mg2+浓度比dNTP总浓度高出0.5mmol/L～1.0mmol/L为宜B．Mg2+浓度对PCR反应效率有重要影响C．Mg2+浓度对PCR特异性无影响D．浓度过低则会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少E．Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性38.关于PCR反应的延伸温度与时间的描述，错误的是( )A．延伸时间过长，会出现非特异性的扩增产物B．延伸常用温度为72℃C．延伸时间一般为2min /1KbD．延伸温度过高不利于引物和模板的结合E．对低浓度模板的扩增，延伸时间可以稍长些39.可用于PCR反应的酶是 ( )A．HindⅢB．Taq DNA聚合酶C．RNA酶D．大肠杆菌连接酶E．T4连接酶40.关于PCR反应中引物的描述，错误的是( )A．引物的适宜浓度约为0.1μmol/L～1μmol/LB．引物碱基G+C含量以40～60%为宜C．引物浓度偏高可增加引物之间形成二聚体的机会D．引物应与目的基因以外的其它序列无明显同源性E．引物浓度过低会引起错配和非特异性扩增41.核酸在紫外光区的吸收峰是( )A．230nm B．260nm C．280nm D． 300nm E． 495nm42.盐和小分子在紫外光区的吸收峰是( )A．230nm B．260nm C．280nm D． 300nm E． 495nm43.DNA纯品OD260/OD280的值约为( )A．1.6 B．1.8 C．1.9 D． 2.0 E． 1.544.提取DNA后进行光密度检测，若测得OD260/CD280的值为2.0，可能的原因是( ) A．盐或小分子污染B．RNA污染C．蛋白质污染 D．有机溶剂污染E．以上都不对45.提取DNA后进行光密度检测，若测得OD260/CD280的值为1.5，可能的原因是( ) A．DNA降解B．RNA污染C．蛋白质污染 D．盐污染E．其它小分子污染46.核酸在碱性电泳缓冲液中解离的状态是( )A．核酸等电点低于缓冲液pH，故带正电B．核酸等电点低于缓冲液pH，故带负电C．核酸等电点高于缓冲液pH，故带正电D．核酸等电点高于缓冲液pH，故带负电E．核酸等电点等于缓冲液pH，故不带电47.不同核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时出现迁移率的差异，最为主要的原因是( ) A．电荷效应B．浓缩效应C．分子筛效应 D．电压梯度效应E．不连续效应48.下列关于微量移液器的操作，错误的是( )A．先按到第一档，垂直进入液面再缓慢松开B．打出液体时应贴壁并有一定角度C．打出液体时先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出D．平放带有残余液体吸头的移液器E．应该垂直吸液，慢吸慢放49.对标准品来说，当OD260=1时，dsDNA的浓度约为( )A．30ug/mL B．37ug/mL C．40ug/mL D． 50ug/mL E． 60ug/mL50.提取细胞或组织RNA时，决定实验成败的关键因素是( )A．必须要取新鲜的组织B．防止Rnase对RNA的降解C．裂解液的量不足D．蛋白质污染E．以上都不对51.提取细胞或组织RNA所用的裂解液主要成分是( )A．DEPC B．异硫氰酸胍C．氯仿D．苯酚E．以上均是52.组织或细胞基因组DNA的提取一般使用的离心机是( )A．低速离心机B．高速离心机C．超高速离心机D．常速离心机E．过滤离心机53.提取组织或细胞基因组DNA使用的细胞裂解缓冲液中EDTA的作用是( )A．破坏细胞膜、核膜B．使组织蛋白与DNA分离C．抑制DNase的活性D．降解蛋白质E．抑制RNase的活性54.提取组织或细胞基因组DNA使用的蛋白酶K的作用是( )A．破坏细胞膜、核膜B．使组织蛋白与DNA分离C．抑制DNase的活性D．降解蛋白质E．抑制RNase的活性55.基因工程技术的基本操作步骤：①使目的基因与与载体相连；②将目的基因导入受体细胞；③检测目的基因的表达；④提取目的基因，正确的操作顺序为( )A．②④①③B．④②①③C．④②③①D．②④③①E．④①②③56.不属于基因工程技术生产的药物是( )A．干扰素B．青霉素C．白细胞介素D．乙肝疫苗E．人-鼠嵌合抗体57.基因工程技术中我们用“剪刀”、“针线”分别代表( )A．Taq酶、引物B．Taq酶、DNA连接酶C．限制性内切酶、DNA连接酶D．限制性内切酶、RNA连接酶E．Taq酶、RNA连接酶58.下列操作中，不发生碱基配对的是( )A．人工合成基因B．将目的基因导入受体细胞C．目的基因与质粒载体结合D．PCR E．目的基因检测59.基因工程中最为常用的连接酶是( )A．大肠杆菌DNA连接酶B．T4 DNA连接酶C．大肠杆菌DNA连接酶D．T4 RNA连接酶E．以上都不对60.基因工程中最为常用的基因载体是( )A．质粒B．噬菌体C．病毒D．穿梭质粒E．基因组61. 基因工程技术应用最广泛地受体是（）A. 支原体B. 动物细胞C. 酵母细胞D. 植物细胞E. 大肠杆菌62.加速催化剂催化Acr和Bis聚合反应的物质是( )A．硫酸铵B．硫化铵C．TEMED D．过硫酸铵E．核黄素63.下列关于TEMED的描述，错误的是( )A．中文名为N,N,N′,N′－四甲基乙二胺B．具有强神经毒性C．易挥发，使用后立即盖紧瓶盖D．是Acr和Bis聚合反应的催化剂E．宜避光保存64.聚丙烯酰胺凝胶是三维网状结构，控制其孔径大小的因素主要是( ) A．丙烯酰胺的浓度B．甲叉双丙烯酰胺的浓度C．凝胶凝固的时间长短D．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联度E．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺总浓度65. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的英文缩写为( )A．PGAE B．PAGE C．PEGA D．PEAG E．PAEG66.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳上下层胶依次为( )A．大孔径分离胶、小孔径浓缩胶B．大孔径浓缩胶、小孔径分离胶C．小孔径浓缩胶、大孔径分离胶D．小孔径分离胶、大孔径浓缩胶E．孔径一致的分离胶、浓缩胶67.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶中跑在最前面的是( )A．Gly－B．Pr－C．Cl－D．核酸E．以上都不对68.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶中跑在最后面的是( )A．Gly－B．Pr－C．Cl－D．核酸E．以上都不对69.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶胶中跑的最慢的是( )A．Gly－B．Pr－C．Cl－D．溴酚蓝E．以上都不对70.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳时出现的肉眼可见指示条带是( )A．Gly－B．Pr－C．Cl－D．溴酚蓝E．以上都不对71. 聚丙烯酰胺凝胶上层浓缩胶中的待测蛋白质离子被哪两种离子形成的狭小夹层所浓缩( )A．CH3COO－、Pr－B．CH3COO－、Cl－C．Gly－、Pr－D．Gly－、Cl－E．CH3COO－、Pr－72. 聚丙烯酰胺凝胶上层浓缩胶中三种离子泳动率关系为( )A．Pr－＞Gly－＞Cl－B．Gly－＞Cl－＞Pr－C．Cl－＞Pr－＞Gly－D．Cl－＞Gly－＞Pr－E．Gly－＞Pr－＞Cl－73. 聚丙烯酰胺凝胶电泳用到的蛋白质染色剂为( )A．溴化乙锭B．溴酚蓝C．考马斯亮蓝D．氨基黑E．硝酸银74.聚丙烯酰胺凝胶电泳配制浓缩胶所用缓冲液是( )A．pH8.8 Tris-HCl缓冲液B．pH6.8 Tris-HCl缓冲液C．pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液D．PBS缓冲液E．1×TAE75.聚丙烯酰胺凝胶电泳配制分离胶所用缓冲液是( )A．pH8.8 Tris-HCl缓冲液B．pH6.8 Tris-HCl缓冲液C．pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液D．PBS缓冲液E．1×TAE76.聚丙烯酰胺凝胶电泳所用电泳缓冲液为( )A．pH8.8 Tris-HCl缓冲液B．pH6.8 Tris-HCl缓冲液C．pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液D．PBS缓冲液E．1×TAE77.聚丙烯酰胺凝胶电泳加样前将样品煮沸处理，其目的在于( )A．破坏样品中的核酸B．浓缩蛋白C．使其裂解成小分子D．破坏蛋白质的空间构象E．以上都对78.连续和不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳最关键的差别在于( )A．有无电压梯度效应B．有无浓缩效应C．有无电荷效应D．凝胶在空间上是否连续E．有无分子筛效应79.下列物质对人体无毒的是( )A．溴化乙锭B．聚丙烯酰胺C．TEMED D．丙烯酰胺E．甲叉双丙烯酰胺80.聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶和浓缩胶成分的区别在于( )A．孔径大小不同B．发挥功能不同C．配制所用缓冲液pH值不同D．丙烯酰胺浓度不同E．以上都对81.用于凝胶过滤层析的凝胶使用前应该做的预处理是( )A．加热B．溶胀C．平衡D．装柱E．预冷82.脲酶的凝胶过滤分离纯化实验中，将凝胶装柱之前要做的是( )A．平衡层析柱B．溶胀C．检查是否通畅D．关闭出口E．调整流速83.脲酶的凝胶过滤分离纯化实验中，绘制蛋白酶活性曲线的横、纵坐标分别是（）A．试管编号、A480 B．试管编号、A280C．试管编号、酶活性D．NH3的μmol数、A280 E．NH3的μmol数、A480参考答案单选题：1.C2.C3.A4.C5.D6.E7.B8.B9.D 10.B 11.B12.C 13.A 14.B 15.E 16.B 17.A 18.D 19.B 20.C 21.A 22.E 23.E 24.B 25.A 26.D 27.A 28.C 29.C 30.B 31.B 32.D 33.C 34.A 35.D 36.A 37.C 38.C 39.B 40.E 41.B 42.A 43.B 44.B 45.C 46.B 47.C 48.D 49.D 50.B 51.B 52.B 53.C 54.D 55.E 56.B 57.C 58.B 59.B 60.A 61.E 62.C 63.D 64.E 65.B 66.B 67.C 68.A 69.B 70.D 71.D 72.C 73.C 74.B 75.A 76.C 77.D 78.B 79.B 80.E 81.B 82.C 83.C单选题:101.凝胶过滤层析分离混合物的基本原理是（）A．离子交换B．分配系数差异C．吸附力差异D．电荷差异E．分子筛作用102.凝胶过滤层析一般包括三大主要步骤，按顺序依次是（）A．加样、装柱、洗脱B．装柱、加样、洗脱C．装柱、平衡、加样D．装柱、平衡、洗脱E．加样、平衡、洗脱103.凝胶过滤层析是根据分子什么特点进行分离的（）A．分子量大小B．对吸附剂吸附的能力不同C．分配系数不同D．带电性质与荷电量不同E．构像不同104.离子交换层析是根据分子什么特点进行分离的（）A．分子量大小B．对吸附剂吸附的能力不同C．分配系数不同D．带电性质与荷电量不同E．构像不同105.亲和层析是根据分子什么特点进行分离的（）A．分子量大小B．对吸附剂吸附的能力不同C．分配系数不同D．带电性质与荷电量不同E．与相应受体或配体亲和力不同106.脲酶催化尿素水解释放氨，再与下列何种试剂反应产生黄色化合物，根据颜色深浅即可判断酶活性大小（）A．班氏试剂B．奈氏试剂C．酚试剂D．考马斯亮蓝E．TEMED107.用Nessler试剂检测氨可产生什么颜色的化合物（）A．红色B．黄色C．蓝色D．紫色E．橙色108.碱裂解法提取质粒所用的溶液I、溶液Ⅱ、溶液III发挥的作用分别是( )A．裂解、中和、悬浮B．中和、悬浮、裂解C．悬浮、裂解、中和D．裂解、悬浮、中和E．悬浮、中和、裂解109.对理想的克隆载体的描述，错误的是( )A．大小一般在1kb～15kb之间B．分子量小、单拷贝、紧密控制型C．具有多种常用的限制性内切酶的单切点D．能插入较大的外源DNA片段E．具有容易操作的检测表型110．取质粒最常用的方法是( )A．煮沸法B．冷冻法C．超声波法D．碱裂解法E．酶解法111．裂解法提取质粒所用的试剂中，最关键的是( )A．悬浮缓冲液B．裂解缓冲液C．中和缓冲液D．TE缓冲液E．酚:氯仿:异戊醇112．裂解法提取质粒所用悬浮缓冲液试剂中，包括的成分是( )A．50 mmol/L 葡萄糖，10mmol/L EDTAB．0.2 mol/L NaOH，1％SDSC．3mol/L乙酸钾，2mol/L冰醋酸D．50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl ，10mmol/L EDTA，RNase E．1％SDS，25 mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA113.裂解法提取质粒所用裂解缓冲液试剂中，包括的成分是( )A．50 mmol/L 葡萄糖，10mmol/L EDTAB．0.2 mol/L NaOH，1％SDSC．3mol/L乙酸钾，2mol/L冰醋酸D．50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-ClE．1％SDS，25 mmol/L Tris-Cl114.裂解法提取质粒所用中和缓冲液试剂中，包括的成分是( )A．50 mmol/L 葡萄糖，10mmol/L EDTAB．0.2 mol/L NaOH，1％SDSC．3mol/L乙酸钾，2mol/L冰醋酸D．50 mmol/L 葡萄糖，2mol/L冰醋酸E．1％SDS，25 mmol/L Tris-Cl115.于高速离心机的使用和维护，下列描述错误的是( )A．离心机应放置在水平而坚实的台面上，以免离心时造成机器震动B．转头中不能装载单数的管子C．离心管一定要对称放置D．使用前，换上所需的转头E．预设时间一到即可打开机盖取出离心管116.裂解法提取质粒时，加入裂解缓冲液，反应时间不超过( )A．2min B．3min C．4min D．5min E．7min117.裂解法提取质粒时，裂解细胞这一步必须要轻柔的重要原因是( ) A．避免基因组DNA断裂B．避免基因组DNA变性C．避免质粒DNA变性D．避免质粒DNA开环E．避免质粒DNA断裂118.解法提取质粒时，裂解细胞这一步时间不能过长的重要原因是( )A．避免基因组DNA断裂B．避免基因组DNA变性C．避免质粒DNA变性D．避免质粒DNA开环E．避免质粒DNA断裂119.解法提取质粒时，形成大量沉淀的步骤是( )A．加入RB后B．加入LB后C．加入NB后D．加酚:氯仿:异戊醇后E．加无水乙醇后120.解法提取质粒时，加入NB后形成大量沉淀，与之有关的重要成分是( )A．乙酸钾和冰醋酸B．SDS和乙酸钾C．SDS和冰醋酸D．EDTA E．SDS121.裂解法试剂LB在温度较低时，可能会产生沉淀，应怎样处理( )A．无需处理，不影响结果B．在室温下放置一段时间C．说明已经变性，应予废弃D．摇匀至沉淀消失再用E．需先用水浴加热溶解，混匀后再用122.裂解法试剂LB易被空气中的CO2酸化，用完后应立即盖紧瓶盖。
elisa酶联免疫吸附实验报告
e l i s a酶联免疫吸附实验报告一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。
二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（ＲeinheitZahl）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。
用于ELISA检测的HRP的RZ 值要求在3.0以上。
E L I S A的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
酶联免疫分析技术
室 温 温 育 的 反 应 ， 操 作 时 的 室温 应 严格 限 制 在 规 定 的 范围 内 ， 标准 室 温温 度 是指 20-25℃ ， 应注 意 温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点， 一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对 硝基苯磷酸酯 作 为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm 波长处 有吸收峰。用 NaOH 终止酶反应后，黄色可稳定一时 间。 AP也有发荧光底物（磷酸 4- 甲基伞酮），可用 于 ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的 比色法。
洗涤液
常用的稀释液为含 0.05% 吐温 20磷酸盐缓冲液。
异相法：
?Ab* A* *g*和Ab 分离，然后测定 Ab Ag 或Ab 的量， 从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
*
Ab *
Ab A g
均相法 ：
?Ab *Ag中的标记物 *失去特性，直接测定游离 Ab *的量，从而推算出 Ag量。
*
A
过量 Ab
g
* Ab *
Ab A g
1 特异性
抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结 合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高 度的特异性。
2013-8-13
免疫检验
? 利用免疫检测原理检测与免疫相关的 物质（抗原、抗体、补体、细胞因子 等）
? 利用免疫检测原理检测体液中的微量 物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、 药物浓度等） 这些检测结果为临床上确定诊断， 分析病情，调整治疗方案和判断预后 提供有效的实验依据 。
酶联免疫分析技术
实验三 酶联免疫吸附试验(医学免疫学)
（5）阻断法测定抗体
本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎 （TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。
A. 将抗原吸附在固相载体表面; B.先加待检血清（抗体）, 形成抗原-抗体复合物; C. 再加酶标单抗； D. 加底物。
酶联免疫吸附试验
【实验目的】
酶联免疫吸附试验
【实验材料】
1.商品化的AFP检测试剂盒：
酶标板(各孔内预先已包被AFP抗体)， AFP标准品(400,200,100,20,10, 0ng/mL)， 酶结合物(HRP-抗AFP)， 底物(H2O2)，显色剂(TMB)，终止液(2mol/L硫酸)， 洗涤液等。
2. 微量移液器，恒温培养箱，洗瓶，吸水纸， 记号笔等。
（1） 直接法测定抗原
A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。
（2）间接法测定抗体
A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体； D. 加底物。测定底物的降解量＝抗体量。
（3）双抗体夹心法测定抗原
酶联免疫吸附试验
【实验方法】
1.加样
预包被孔编号，用微量移液器分别加入标 准品，每孔50ul，
随即加入酶结合物50ul。轻轻振荡混匀后， 置37℃温育30分钟。
2.洗涤
将各孔液体甩掉，用洗涤液注满各孔，静置 20s，甩掉液体，重复5次后在吸水纸上拍干。
3.显色
每孔加底物50ul，再加显色剂50ul，混匀， 室温避光反应5min，肉眼观察结果。
• 分类：
✓ 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ✓ 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。
临床检验技术 相关专业知识试题
临床检验技术相关专业知识试题1.适用于尿17-羟、17-酮检查的防腐剂是A.二甲苯B.甲醛C.浓盐酸D.浓硫酸E.麝香草酚答案：C解析：盐酸使尿液保持酸性，阻止细菌繁殖，同时防止一些化学物质因尿液碱化而分解，常用于 17-羟皮质类固醇和 17-酮类固醇等定量测定。
2.镜下血尿是指尿液中的红细胞大于A.5 个/HPFB.4 个/HPFC.3 个/HPFD.1 个/HPFE.10 个/HPF答案：C解析：镜下血尿是指尿外观变化不明显，离心沉淀后，镜检时每高倍视野红细胞平均大于3个，血中红细胞随同尿液一起排出体外的现象。
3.下列哪种试验与苯酚结合出现不溶性蛋白盐而.出现浑浊A.Ross-JoneB.Nonne-ApeltC.Pandy试验D.Rivalta试验E.李凡他试验答案：C解析：Pandy 试验为脑脊液中蛋白质与苯酚结合形成不溶性的蛋白盐，所需脑脊液标本量少，检测灵敏度高，结果易于观察，沉淀物的多少与标本中蛋白质含量成正比。
4.阴道清洁度为II度时，球菌的数量为A. +C. ++D. +++E. ++++答案：C5.酶联免疫反应常用的底物是A.四乙基罗丹明B.四甲基联苯胺C.邻苯二胺(0PD)D.氨基水杨酸E.四甲基-伞酮基-R-D-半乳糖苷答案：B解析：四甲基联苯胺（TMB）是一种优于OPD的新型色原底物，具有稳定性好，成色无避光，无致突变作用等优点，已成为目前ELISA中应用最广泛的底物。
6.革兰阳性菌特有的成分是A.肽聚糖B.磷壁酸C.荚膜D.脂多糖E.脂蛋白答案：B解析：革兰阳性细菌细胞壁的特有成分是磷壁酸，包括壁磷壁酸和膜磷壁酸两种，它们构成革兰阳性菌的表面抗原，可用于血清学分型。
7.20 世纪初法国有两位细菌学家，他们足足花了13年的时间，终于成功培育了第230代被驯服的结核杆菌，作为人工疫苗，又称“卡介苗”。
关于卡介苗的说法，正确的是A.是毒力减弱而保留免疫原性的病毒B.是毒力减弱而保留免疫原性的非变异株C.是毒力臧弱而保留免疫原性的变异株D.是毒力增强而保留免疫原性的非变异株E.是毒力增强而未保留抗原性的变异株答案：C解析：卡介苗是将有毒的牛分枝杆菌在含有甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒活疫苗，是毒力减弱而保留免疫原性的变异株。
酶联免疫吸附实验的原理及分类
酶联免疫吸附实验的原理及分类酶联免疫吸附实验的原理及分类如下原理：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本形成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。
多用于检测IgG类型抗体。
分类如下1.间接法：最常用的方法，属非竞争性结合试验。
原理：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本形成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。
多用于检测IgG类型抗体。
2.双抗原夹心法此法可检测各类抗体，因此双抗原夹心法的灵敏度和特异性要高于间接法。
其原理及操作步骤类似双抗体夹心法，也可采用一步法。
由于机体产生抗体IgG的效价有限，一般不会出现钩状效应。
临床上乙型肝炎表面抗体的测定常用此法。
3.竞争法一般抗体检测是较少采用，当相应抗原材料中含有与抗人IgG 反应的物质，而且不易得到足够的纯化抗原或抗原的结合特异性不稳定时，可采用这种方法测定抗体，目前临床运用较多的是乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）的检测。
竞争抗体与待测抗体的特异性及亲和力越接近，则测定的可靠性越强。
4.捕获法又称反向间接法主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定，最常用的是病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。
原理：先将针对IgM的二抗包被于固相载体，加入待测标本，其中IgM类抗体可被固相抗体捕获，再加入特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标记特异性抗原的抗体，形成固相二抗-IgM-抗原-酶标记抗体复合物，加底物显色后，即可对待测标本中IgM是否存在及含量进行测定。
酶联免疫反应常用底物
酶联免疫反应常用底物辣根过氧化物酶HRP底物辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP具有分子量小，标记方法简单，性质稳定等优点，是临床检验试剂中常用的酶。
该产品广泛用于各类生化检测项目及免疫类（ELISA）试剂盒。
中华试剂网辣根过氧化物酶的底物种类丰富，可满足不同的实验需求。
■ HRP的发色底物辣根过氧化物酶发色底物为过氧化物和供氢体（DH2，其真正底物是HLQ,但人们习惯把供氢体称为底物或统称供氢体底物。
在ELISA中常用的供氢体有以下几种：1、OPD是ELISA技术中应用较多的供氢体，酶作用后显黄色（最大吸收波长为492 nm）,其灵敏度高，测定方便。
2、TMB是近年来常用的一种供氢底物，经酶作用后显天蓝色，目测对比度鲜明，加酸终止酶反应后变黄色（最大吸收波长为450 nm），易比色定量测定。
3、D B A供氢底物，其反应产物为不能溶解的棕色吩嗪衍生物，可用不同光镜观察。
此种多聚物能被还原和++ H :O a5 g 10 g1 g1 g ■ HRP 的发光底物鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼，Luminol ）或其衍生物如异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼，Isoluminol ），是一类重要的发光试剂。
用 HRP 标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在 HRP 和起动发光试剂（NaOH+HO ）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。
反应过程如下图所示:纯度包装25 g英文名称 CAS 号 纯度 包装A5300 异鲁米诺Isoluminol 3682-14-298%产品编号中文名称英文名称CAS328061鲁米诺Luminol 521-31-3 98%分子式：CsHNQ 分子量：433.63 熔点：194-195 °C 储存条件：2-8 ° C产品编号 中文名称 洗涤渚除沪双抗体夹心复合物♦XE + V +取抗体夹心复合物増强剤書米诺鲁米诺发光抗怀包彼固相我体% ♦注靡W +HiO I 抗原 掠朦体唑-6-磺酸）铵 盐3-氨基-9-乙基咔唑3-Amino-9-ethylcarbazole, AEC红色、可 溶性132-32-15 g25 g4-氯-1萘酚Chloro-1-naphthol蓝色、可 溶性604-44-425 g探小贴士：氧化物、硫化物、氟化物及叠氮化物等可抑制 HRP 的活性，故勿用这类试剂作为防腐剂分子式：GH7NO分子量：177.16熔点:194-195 °C 储存条件：2-8 ° C■配套产品中文名称英文名称CAS号纯度包装4-碘苯酚4-Iodophenol 540-38-5 99%5 g 25 g 100 g四苯基硼酸钠Sodium tetraphenylborate 143-66-8 99.5%(ACS)25 g 100 g 500 g牛血清白蛋白Bovine serum albumin [ FractionV], BSA 9048-46-8 —5 g25 g100 g十二烷基硫酸钠Dodecyl sulfate sodium salt, SDS 151-21-3 99% 100 g 500 g脱氧胆酸钠Sodium deoxycholate 302-95-4 98%25 g 100 g 500 g苯甲基磺酰氟化物Phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF 329-98-6 99%25 g 100 g亮抑酶肽Leupeptin 103476-89-7 96.5% 10 mg 50 mg三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride, Tris-HCl1185-53-1 99%25 g100 g500 g吐温80 Polysorbate 80 9005-65-6 —250 mL1 L碱性磷酸酶(Alkaline phospharase, AP) 是一种能够在碱性情况下将对应底物去磷酸化的酶，广泛分布于人体的各脏器器官中，以肝脏、骨骼、小肠中存在的量最多。
酶联免疫
分子生物学与生物化学课程论文酶联免疫（ELISA）检测方法学院: 山西农业大学信息学院系部: 农业与生命科学系专业: 生物技术班级: 102 班学号: 2010010229姓名: 高淼时间: 2013年5月5日酶联免疫（ELISA）检测方法摘要：酶联免疫法简称ELISA，是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
关键词：ELISA 基本方法抗体抗原前言：1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA) 。
ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques ) 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。
尽管早期的ELISA 由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。
一、基本原理将抗原或抗体结合到某种固相载体，并保持其免疫活性，将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留酶的活性，也不会改变抗体的免疫学特性。
而常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酶（AKP)等。
临床医学检验临床免疫技术：酶免疫技术必看题库知识点
临床医学检验临床免疫技术：酶免疫技术必看题库知识点1、单选制备酶标记物的交联剂的反应基团至少应有（）A.5个B.4个C.3个D.2个E.1个正确答案：D2、单选ELISA双抗体夹心法（）A.将（江南博哥）酶标记特异抗体用于检测抗原B.先将待测抗原包被于固相载体C.标记一种抗体可检测多种抗原D.能用于半抗原的测定E.将酶标记抗抗体用于抗原检测正确答案：A3、单选为消除非特异性显色导致的本底偏高，酶免疫技术中将抗原抗体包被后需再进行封闭的是（）A.15％～25％牛血清白蛋白B.10％～15％牛血清白蛋白C.10％牛血清白蛋白D.1％～10％牛血清白蛋白E.1％～5％牛血清白蛋白正确答案：E4、单选下述哪一种酶联免疫吸附实验方法最常用于抗原测定（）A.间接法ELISAB.反向间接法ELISAC.竞争法ELISAD.双抗体夹心法ELISAE.捕获法正确答案：D5、单选以下哪一种复合物的形成属于间接法ELISA免疫反应结果（）A.固相抗原-抗体-酶标二抗B.固相抗体-抗原-酶标抗体C.固相二抗-IgM抗原-酶标抗体D.固相抗体-酶标抗原E.固相抗体-抗原-抗体-酶标抗体正确答案：A参考解析：间接法是检测抗体常用的方法。
其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
6、单选酶免疫技术中的酶结合物指的是（）A.酶标记抗体B.酶标记抗原C.酶标记抗原或抗体D.结合在固相载体上的酶E.酶与底物的结合正确答案：C7、单选酶联免疫吸附试验（ELISA）中应用最多的底物是（）A.邻苯二胺（OPD.B.四甲基联苯胺（TMB.C.ABTSD.对硝基苯磷酸酯（p-NPP）E.以上都不是正确答案：B参考解析：邻苯二胺灵敏度高，比色方便，是ELISA中应用最早的底物，但稳定性差，反应过程需要避光，还具有致癌性；四甲基联苯胺稳定性好，反应无需避光，没有致突变作用，是目前应用最广泛的底物，但是水溶性差。
酶免实验2020-1-1
（3）标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本，血清中 IgG 可聚合成 多聚体、AFP 可形成二聚体，在间接法 ELISA测定中会导致本底过深 、甚至造成假阳性；标本放置时间过长（如一天以上），有时抗原或 抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA测定 的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 天内测定的血 清标本 可存放于 4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本 ，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻 柔，不可强烈振 荡。反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分
• 注意：当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分 别同固相抗体和酶标记抗体结合而抑制夹心复合 物的形成，出现钩状效应（hook effect），显色 降低，严重时可出现假阴性结果，必要时可将标 本适当稀释后重新测定。
HBsAb检测
• 双抗原夹心法
HBeAg检测
HBeAb检测
原理
竞争法
• HBcAb：先将核心抗原包被在固相载体上 形成固相抗原，然后加入待测标本和酶标 记的特异性核心抗体，此时待测标本中的H BcAb与酶标记HBcAb竞争性地与固相载体 上的核心抗原相结合。温育后洗涤，加入 底物显色。显色的强弱与待测标本中的 HBcAb的含量呈负相关。
通常将抗体或抗原溶于缓冲液（常用PH9.6的 碳酸盐缓冲液）中，加于ELISA板孔中4℃过夜或者 37℃两小时。包被好的固相载体可在4℃放置一段 时间（6个月以上）而不失去免疫活性。包被的蛋 白质浓度不易过大，以免过多的蛋白质分子在固相 载体表面形成多层聚集，洗涤时易脱落，影响免疫 复合物的稳定性和均一性。因此用于包被的抗体或 抗原的浓度需要预实验筛选确定。
（5）医源性诱导的抗鼠 Ig (s) 抗体 临床开展的用鼠源性 CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的 影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产 生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可 以产生抗鼠 Ig (s) 抗体。这些病人 ELISA测定时均可产生假 阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正 常鼠 Ig (s) ，从而克服由于上述原因造成的假阳性。 （6）交叉反应物质 类地高辛、类 AFP 样物质等，是与靶抗 原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响 不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇 正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳 性结果。 （7）标本中其它成分的影响 血清脂质过高、胆红素、血红 蛋白及血液粘度过大等，均对 ELISA 测定结果有干扰作用。
(整理)酶联免疫反应常用底物
酶联免疫反应常用底物辣根过氧化物酶HRP底物辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）具有分子量小，标记方法简单，性质稳定等优点，是临床检验试剂中常用的酶。
该产品广泛用于各类生化检测项目及免疫类（ELISA）试剂盒。
中华试剂网辣根过氧化物酶的底物种类丰富，可满足不同的实验需求。
■ HRP的发色底物辣根过氧化物酶发色底物为过氧化物和供氢体（DH2），其真正底物是H2O2，但人们习惯把供氢体称为底物或统称供氢体底物。
在ELISA中常用的供氢体有以下几种：1、OPD是ELISA技术中应用较多的供氢体，酶作用后显黄色（最大吸收波长为492 nm），其灵敏度高，测定方便。
2、TMB是近年来常用的一种供氢底物，经酶作用后显天蓝色，目测对比度鲜明，加酸终止酶反应后变黄色（最大吸收波长为450 nm），易比色定量测定。
3、DBA供氢底物，其反应产物为不能溶解的棕色吩嗪衍生物，可用不同光镜观察。
此种多聚物能被还原和唑-6-磺酸)铵盐3-氨基-9-乙基咔唑3-Amino-9-ethylcarbazole, AEC红色、可溶性132-32-15 g25g4-氯-1萘酚Chloro-1-naphthol 蓝色、可溶性604-44-425g※小贴士：氧化物、硫化物、氟化物及叠氮化物等可抑制HRP的活性，故勿用这类试剂作为防腐剂。
■ HRP的发光底物鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼，Luminol）或其衍生物如异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼，Isoluminol），是一类重要的发光试剂。
用HRP标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在HRP和起动发光试剂(NaOH+H2O2)作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。
反应过程如下图所示：产品编号中文名称英文名称CAS纯度包装328061 鲁米诺Luminol 521-31-398%1 g5 g25 g分子式：C8H7N3O2分子量：433.63熔点：194-195℃储存条件： 2-8°C产品编号中文名称英文名称CAS号纯度包装A5300 异鲁米诺Isoluminol 3682-14-298%1 g 10 g分子式：C8H7N3O2分子量：177.16熔点：194-195℃储存条件： 2-8°C■配套产品中文名称英文名称CAS号纯度包装4-碘苯酚4-Iodophenol 540-38-5 99%5 g 25 g 100 g四苯基硼酸钠Sodium tetraphenylborate 143-66-8 99.5%(ACS)25 g 100 g 500 g牛血清白蛋白Bovine serum albumin [ FractionV], BSA9048-46-8 ——5 g25 g100 g十二烷基硫酸钠Dodecyl sulfate sodium salt, SDS 151-21-3 99% 100 g 500 g脱氧胆酸钠Sodium deoxycholate 302-95-4 98%25 g 100 g 500 g苯甲基磺酰氟化物Phenylmethylsulfonylfluoride, PMSF329-98-6 99%25 g100 g亮抑酶肽Leupeptin 103476-89-7 96.5% 10 mg 50 mg三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride, Tris-HCl1185-53-1 99%25 g100 g500 g吐温80 Polysorbate 80 9005-65-6 ——250 mL1 L碱性磷酸酶底物碱性磷酸酶(Alkaline phospharase, AP)是一种能够在碱性情况下将对应底物去磷酸化的酶，广泛分布于人体的各脏器器官中，以肝脏、骨骼、小肠中存在的量最多。
ELISA原理
ELISA 原理－－操作规则（新手适用）一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）, 生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。
借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。
待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。
二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。
常用于ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。
由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。
辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin ）区作辅基。
酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。
氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml 含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。
高纯度HRP的RZ值在 3.0 左右，最高可达 3.4 。
用于ELISA 检测的HRP的RZ值要求在 3.0 以上。
ELISA 的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
前两种方法主要用于测定抗体和大分 子抗原，适用于临床诊断上，而竞争法事 测定小分子抗原的方法，因而尤其适用于 食品分析。
ELIZA 方法图示
间接法
“Indirect” ELISA
The steps of "indirect" ELISA follows the mechanism below: 1. A buffered solution of the protein antigen to be tested for is added to each well of a microtiter plate, where it is given time to adhere to the plastic through charge interactions. 2. A solution of non-reacting protein, such as bovine serum albumin, or casein is added to block any plastic surface in the well that remains uncoated by the protein antigen. 3. Then the serum is added, which contains a mixture of the serum donor's antibodies, of unknown concentration, some of which may bind specifically to the test antigen that is coating the well. 4. Afterwards, a secondary antibody is added, which will bind any antibody produced by a member of the donor's species (for example, an antibody produced in a mouse that will bind any rabbit antibody). This secondary antibody often has an enzyme attached to it, which has no effect on the binding properties of the antibody. 5. A substrate for this enzyme is then added. Often, this substrate changes color upon reaction with the enzyme. The color change shows that secondary antibody has bound to primary antibody, which strongly implies that the donor has had an immune reaction to the test antigen. This can be helpful in a clinical setting, and in R&D. 6. The higher the concentration of the primary antibody that was present in the serum, the stronger the color change. Often a spectrometer is used to give quantitative values for color strength
酶联免疫吸附测定法优秀文档
HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L
AP用NaOH终止
实验方法:
1. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于已包被之反应 孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴 性对照孔及阳性对照孔)。 2. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗 体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 3. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的底物溶 液0.1ml，37℃10～30分钟。 4. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 5. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果： 反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极 浅。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，以空白对照孔调 零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍， 即为阳性。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control) 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。 ③酶作用的底物（显色剂）
实验原理 双抗体夹心法
DNM-9602G酶标分析仪 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) 酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。
DNM-9602 标配酶标分析仪 阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。
DNM-9602G酶标分析仪 在这种测定方法中有3种必要的试剂： 1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 ②酶标记的抗原或抗体（标记物）
酶联免疫方法的原理及详细操作步骤
不易吸附得非蛋白质抗原可用间接包被得抗原经固相抗体得亲 和层析作用,包被在固相上得抗原纯度大大提高,因此含杂质较 多得抗原也可采用捕获包被法。
亲和素生物素 即用亲和素先包被载体,加入生物素化得DNA, 这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质得定量测 定。 脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中 溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精 挥发后,让脂质自然干固在固相表面。
3、4 洗涤液
在板式ELISA中,常用得稀释液为含0、05%吐温20 磷酸盐缓冲液。
ELISA得试剂准备B
3、2 结合物
即酶标记得抗体(或抗原)就是ELISA中关键得试剂 1 酶得催化活性 2抗体(或抗原)得免疫活性 3含有或少含有游离得抗体(或抗原) 4结合物尚要有良好得稳定性。
3、2、1 结合物用得抗原和抗体
3、 ELISA得试剂(A、B、C三部分)
ELISA中有三个必要得试剂:免疫吸附剂、结合物和酶得底 物。 (1)已包被抗原或抗体得固相载体(免疫吸附剂); (2)酶标记得抗原或抗体(结合物); (3)酶得底物; (4)阴性对照品和阳性对照品,参考标准品; (5)结合物及标本得稀释液; (6)洗涤液; (7)酶反应终止液
TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定,可配成 溶液试剂,只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后 ,TMB产物由蓝色呈黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为 450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感,但空白值极低,也为一些试剂盒 所采用。
HRP对氢受体得专一性很高,仅作用于H2O2、小分醇得过氧 化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。
可设计出各种不同类型得检测方法。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
辣根过氧化物酶HRP底物
辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）具有分子量小，标记方法简单，性质稳定等优点，是临床检验试剂中常用的酶。
该产品广泛用于各类生化检测项目及免疫类（ELISA）试剂盒。
中华试剂网辣根过氧化物酶的底物种类丰富，可满足不同的实验需求。
■ HRP的发色底物
辣根过氧化物酶发色底物为过氧化物和供氢体（DH2），其真正底物是H2O2，但人们习惯把供氢体称为底物或统称供氢体底物。
在ELISA中常用的供氢体有以下几种：
1、OPD是ELISA技术中应用较多的供氢体，酶作用后显黄色（最大吸收波长为492 nm），其灵敏度高，测定方便。
2、TMB是近年来常用的一种供氢底物，经酶作用后显天蓝色，目测对比度鲜明，加酸终止酶反应后变黄色（最大吸收波长为450 nm），易比色定量测定。
3、DBA供氢底物，其反应产物为不能溶解的棕色吩嗪衍生物，可用不同光镜观察。
此种多聚物能被还原和
※小贴士：氧化物、硫化物、氟化物及叠氮化物等可抑制HRP的活性，故勿用这类试剂作为防腐剂。
■ HRP的发光底物
鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼，Luminol）或其衍生物如异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼，Isoluminol），是一类重要的发光试剂。
用HRP标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在HRP和起动发光试剂(NaOH+H2O2)作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。
反应过程如下图所示：
■配套产品
碱性磷酸酶底物
碱性磷酸酶(Alkaline phospharase, AP)是一种能够在碱性情况下将对应底物去磷酸化的酶，广泛分布于人体的各脏器器官中，以肝脏、骨骼、小肠中存在的量最多。
其含量的变化能引起肝炎、肝癌等疾病，是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。
PNPP（p-Nitrophenyl phosphate disodium salt）是常用的碱性磷酸酶底物，当碱性磷酸酶与PNPP反应后，形成黄色水溶性反应产物，其在&lambda＝405 nm有光吸收。
其反应灵敏，颜色鲜明，在诊断试剂盒生产中得到广泛应用。
BCIP和NBT是碱性磷酸酶最佳的发色底物组合之一，产物为深蓝色。
在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan，从而达到标记作用。