PCR技术简述

PCR技术简述

北京大学医学部基础医学院 07级临床一班陈依然 90701114

一、摘要

早在高中时期，生物课教程中就已经出现了“PCR技术”的字样。但是由于当时知识深度与教学要求、目的所限，教师并未对“PCR技术”即行明确的讲解。这个疑问一直延伸到今天。

结合查阅的资料，本文对PCR技术进行了简要而比较全面地介绍，内容主要涉及PCR技术的发展历程、原理、主要步骤、反应特点、反应的关键因素——引物与DNA聚合酶、荧光实时定量技术以及PCR在医学与法医学领域的应用，并且将该项技术与用于DNA扩增的常规基因工程技术进行了比较。

基于以上内容，本文呈现了有关PCR技术的基本知识。

二、关键词

PCR技术基本知识原理应用与常规方法的比较

三、正文

3.1 PCR技术简介

多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是近十年来发展最快、应用最广的分子生物学技术。PCR是在细胞外（体外）快速扩增特定DNA序列的技术，故又称体外基因扩增技术或无细胞分子克隆技术（Cell-free molecular cloning）。

该项技术采用定向酶促扩增法，选择性地富集某一特异性DNA序列，将被认为不可能监测到的极微量靶DNA分子扩增到足以方便地进行监测和分析的数量级。PCR不但有高的监测能力，还简化了操作程序，省去了诸多繁琐的操作，被人们称为分子克隆技术中的一次重大革命，对基础研究、实际应用，推动现代分子生物学技术的发展，具有难以估量的作用。而且由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，该项技术的发明者Mullis也于1993年获得了诺贝尔化学奖。

3.2 PCR技术发展历程

PCR技术的最初设想是由美国Cetus公司的Kary Mullis博士于1983年提出的。

自1993年至今，该项技术一共经历了手动/机械手式水浴基因扩增、自动化控制型定性基因扩增、终点定量/半定量PCR、实时定量PCR四代产品。随着产品的发展，操作大幅简化，成本迅速降低，而这些都有赖于DNA聚合酶的改良和荧光定时定量PCR等技术的发明与应用。

目前的第四代产品，对PCR可以进行精确的定时定量控制，并采用了微电脑控制全部反应过程，大大简化了操作过程，节省了实验时间，降低了成本，极大促进了PCR 技术的实际应用与发展。迄今PCR技术在生物科研和临床应用中得到广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术之一。

3.3 PCR技术原理

DNA的半保留复制是生物遗传物质向后代传递的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两个DNA分子。在实验中发现，DNA分子在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

PCR是根据以上原理，以特定顺序DNA的两条链为模板，在一对引物的介导下，在

体外运用DNA聚合酶合成特定DNA序列的反应。

PCR包括以下三个主要的连续步骤：

1、热变性：加热破坏DNA两条链之间的结合力，使目的DNA于高温解链成为

单链模板。

2、退火：退火是属于分子杂交复性的过程，在一定温度条件下，两个人工合

成的寡聚核苷酸引物分别与目的片段两侧的两条链互补结合而起到启动子

的作用。

3、延伸：在最适温度条件下，DNA聚合酶将核苷酸从引物3’端开始掺入，沿

模板由5’至3’方向延伸，合成DNA。

经过几年的探索与实践，在发现耐高温的DNA聚合酶之后，以上三个步骤的温度与循环已有规律可循。一般情况下，94℃加热1分钟，56℃退火2分钟，72℃延伸5分钟，如此循环25至35次，即可得到所需目的DNA的数量，理论值为2n，n为循环次数。

3.4 PCR的引物设计和DNA聚合酶

正确地设计引物和合理地使用DNA聚合酶是PCR实验工作能否成功的关键所在。

3.4.1引物设计

PCR反应中所使用的引物都是人工合成的一段寡聚核苷酸。设计引物所须考虑的原则有以下几点：

1、引物须与目的DNA两条链的5’端相匹配；

2、引物的G+C含量应设计为50%左右，尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列；

3、引物需要避免内部形成二级结构；

4、两个引物之间不应发生互补，避免形成引物二聚体；

5、人工合成的引物最好通过PAGE或离子交换HPLC进行纯化。

3.4.2 DNA聚合酶（DNA polymerase）

在PCR技术中，DNA聚合酶是关键的因素之一。DNA聚合酶最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于20世纪70年

代的初期由Dr. H. Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因

此也制约了PCR技术的应用和发展。经过改进后目前使用的DNA聚合酶是Saiki

等人于1988年从温泉中得到的一种水生嗜热杆菌（Thermus aquaficus）分离出

来的，称为TaqDNA聚合酶。该聚合酶具有极佳的热稳定性，并且提高了扩增目的

产物的特异性，使PCR技术进入实用化阶段。

3.5 荧光实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR, qPCR)

荧光实时定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数，计算起始DNA复制数，做到了真正意义上的DNA定量。

荧光实时定量PCR技术最早是在1992年由一位日本人Higuchi提出的。经过不断发展完善，到1996年当时的PE公司（后来的ABI）推出了世界第一台商品化的荧光定量PCR仪，标记方法也由最初的染料法，逐渐发展到了特异性更高的Taqman探针法，以及Molecular Beacon、Fret等不同方法的标记探针。

实时定量PCR技术真正实现了PCR从定性到定量的飞跃，通过对PCR过程的实时监