G筛选稳定表达细胞系经验总结
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4
(一)筛选结果鉴定:（1)基因组ＤＮＡ提取→PＣR鉴定外源基因（２)SHG－44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-４4-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定Ｐ16蛋白表达(Westeｒn-blot)。
(3)测定外源性基因对ＳHＧ-４４细胞增殖的影响①流式细胞仪分析：SHG-４4、ＳHＧ－44-vect、SＨG-44-重组ｐｃDＮA3→单细胞悬液→７0%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、Ｓ期比例。
②细胞生长曲线测定：SHG-4４、SHＧ-4４-vect、SＨG-44-重组ｐcＤNA3→5×104/孔接种２4孔培养板→２４hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。
③软琼脂克隆形成率分析:SHG－44、SＨＧ-44－vect、ＳHG-44－重组pｃDNA3→1０4细胞→0.3％低熔点琼脂糖培养→１－２周后计数不可少于５0个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。
三、注意事项1、优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和ＤNA 混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。
用于转染的核酸应高度纯化。
为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下,这是细胞惯常的做法。
但是，脂质体以及脂质体／DNA混合物无需滤过除菌。
２、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。
但是在随后的脂质体／ＤＮＡ与被转染细胞共孵育的过程中,血清又是培养基的一部分。
3、在转染之前更换培养基,可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。
４、脂质体／DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边,边加入边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。
常见问题和解答：Q：我觉得套环法操作不如９6孔办法效率高。
A：也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用９6孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆．即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞，十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板，对于转基因细胞筛选或基因打靶，工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下，远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选，需要的单细胞克隆株数量多少？Q:请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含ｎｅｏ抗性基因的质粒后，如何用G41８筛选?我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系简介G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿
G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2
最全的G418筛选稳定表达细胞系2前言在分子生物学领域中，稳定表达细胞系的制备是非常重要的。
而在制备稳定表达细胞系的过程中，G418耐受性筛选是最常用的一种方法。
本文就该方法进行细致的，希望对大家有所帮助。
G418的作用G418是一种广泛应用于细胞培养中的抗生素。
G418的主要作用是通过破坏靶细胞的核糖体的功能而发挥抗生素活性。
这依赖于靶细胞中的耐药性基因，通常经过转染或整体基因组编辑获得。
这些基因通常会转录RNA，并翻译成与蛋白质功能无关的药物代谢酶或其他抗性蛋白质。
筛选细胞系的基本流程G418的筛选过程是稳定表达细胞系的一部分。
经过瞬时转染或电穿孔后，与转染物质中的DNA共染色板并内化进入细胞。
在内化过程中，染色体或质粒DNA 可以在总体上被细胞机制视为异物并准备将其解除。
其中的一个解除机制是通过解除转录RNA，从而将它们从蛋白质生产途径中移除。
G418抑制暴露在表面的核糖体中的修饰基队的蛋白质的生产。
如果细胞体系不具有反抗力机制，则G418会破坏细胞并导致细胞死亡。
然而，通过特定酵母的CUP1锌指转录因子同源工程，使其对G418转化为一种有效的ATP结合剂，从而打开药物代谢酶表达。
可以在这些细胞中选择表达具有耐药性G418药物代谢酶的细胞，并在含有适量G418的培养基上进行培养和筛选。
筛选条件的优化G418抗性筛选过程具有一定的体系依赖性，因此筛选条件需要在洗脱和拍摄步骤之后进行优化。
根据选择的细胞线，典型的筛选条件是0.5mg/ml浓度的G418和2-4周的境况培养。
但是，这些条件可能需要优化以适应特定试验条件，例如在分子克隆中需要更强的选择并且可能需要更长的选育时间。
考虑到选择压连续存在的潜在影响，推荐根据具体情况进行测试并确定适当的药物添加量和持续时间。
稳定表达细胞系的优点与瞬时转染相比，生成稳定表达细胞系有很多优点。
首先，它们可以被保存和用于长期研究，免受数据库变化和反常的实验结果的影响。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2
Protocal1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。
a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结(总3页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。
）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5Q：G418怎么配制？A：我觉得不能用水配，因为这样ＰH会变化很大，至少要用PB Ｓ。
我是配在HEPＥS溶液中的,具体方法如下：1ｇ包装的G４18瓶子中，加入1０ml HＥPES 溶液，浓度为１00 mｇ/mｌ完全溶解后,0.2２uｍ过滤,－20度保存。
HEPEＳ缓冲液配方如下：90ml水中，0.8 g ＮaCl, 0.037g KCl, 0.0１3５gNa2HPO４.2Ｈ2O, ０．1 g葡萄糖,0．５g HＥＰES，溶解,NaO Ｈ调PH至7．05,定容至１00ｍｌ。
Gｏod ansｗｅｒ:推荐用HEPES。
特别是当细胞对G41８不敏感,Ｇ４18使用浓度高时，如果用水、PＢS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。
1mｏl/L HEPE Ｓ的简单配置：HEPES 11.91g,溶解于40ml的ddＨ２Ｏ,用１0moｌ／Ｌ的NaO Ｈ调节ｐH至7.５-8.0，定容至５0ml,０.2２um小滤器过滤。
ＨＥPES最终使用浓度15-20mM。
Q:我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的G4１8直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过Ｇ41８杀伤曲线,30０ｕg\ml就基本上可以杀死细胞,我想直接用1０00uｇ＼m ｌ来筛选,不知是否可行？会不会有什么问题?Ａ: G41８筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至100０cｅll/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0，,１０0, 200,3０0，400,５０0,600,７00，800,9００, 1000，１1.0０ng/ml等１2个级别，培养10-１４天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-8００左右,筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。
我用过Zeｏcｉn，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结一、引言简述稳定表达细胞系的重要性和应用领域阐明嘌呤霉素筛选法的原理和优势二、研究背景介绍稳定表达细胞系在生物制药、基因功能研究等领域的作用阐述嘌呤霉素筛选法在细胞系构建中的应用背景三、实验材料与方法详细列出实验所需的细胞株、质粒、嘌呤霉素等材料描述实验的基本流程，包括细胞转染、筛选、扩增等步骤四、嘌呤霉素筛选原理解释嘌呤霉素的作用机制和如何用于筛选稳定表达细胞阐述筛选过程中细胞的选择压力和适应性变化五、实验操作步骤详细描述实验的具体操作步骤，包括细胞培养、转染、筛选等提供实验操作中的注意事项和常见问题解决方案六、筛选效率与稳定性分析通过实验数据展示筛选效率，包括细胞存活率、表达水平等分析细胞系的稳定性，包括长期培养后的表达水平变化七、优化策略与改进措施根据实验结果提出优化筛选条件的建议描述改进措施，如提高转染效率、调整筛选压力等八、实验结果展示实验中获得的稳定表达细胞系的数据和图像分析实验结果，包括成功构建的细胞系数量、表达效率等九、案例研究选取几个典型的案例，详细描述筛选过程和结果分析案例成功或失败的原因，提供经验教训十、问题与挑战列出在筛选过程中遇到的主要问题和挑战分析问题产生的原因，提出解决方案十一、经验总结总结在嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系过程中积累的经验强调实验操作的准确性、条件控制的重要性十二、未来展望根据当前研究趋势，预测稳定表达细胞系构建的未来发展方向提出未来研究中可能采用的新方法和技术十三、结语强调稳定表达细胞系在生物医学研究中的应用价值表达对参与实验的团队成员的感谢十四、参考文献列出实验过程中参考的文献资料十五、附录附上实验操作的详细步骤、实验数据、图表等。
G418筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
G418筛选稳定表达细胞系
G418筛选稳定表达细胞系分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结3
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是最常用的筛选剂之一，可用于筛选稳定表达的质粒载体含G418抗性基因的细胞系。
在这篇文档中，我们将介绍如何进行G418筛选，以及如何评估稳定表达的细胞系。
G418的使用G418是一种广谱抗生素，能够影响细胞内的核糖体功能。
在含有G418抗性基因的质粒载体中，这一基因将在细胞内表达，从而使细胞对G418具有抗性。
因此，通过加入G418到培养基中，可以筛选出含有G418抗性基因的细胞。
G418的浓度和作用时间很重要。
一般情况下，使用0.4 ~ 1 mg/mL的G418浓度，作用时间为72小时。
当G418加入到培养基中后，需要每两天换一次培养基，并检查细胞生长情况。
如何评估稳定表达的细胞系进行G418筛选后，需要评估哪些细胞系是确实稳定表达了目标基因。
以下是常用的评估方法：1. RT-PCRRT-PCR是常见的定量分析方法之一，可以用于测量目标基因在细胞中的表达水平。
通过提取RNA，用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后用PCR来放大目标区域。
在最后的荧光测量中，可以测量出目标基因的表达水平。
RT-PCR的优点是灵敏度高，且可以针对不同寡核苷酸的序列进行定量分析。
2. Western BlotWestern Blot是常见的蛋白质分析方法之一，可以用于测量目标蛋白在细胞中的表达水平。
通过提取蛋白质，将其分离成各种大小不同的片段，然后用抗体来特异地检测目标蛋白。
Western Blot的优点是能够定量分析特定蛋白，且具有较高的灵敏度。
3. 细胞功能实验在某些情况下，需要通过测量细胞的功能来评估细胞系的稳定表达水平。
例如，对于表达了RNA干扰分子的细胞系，可以通过测定下游基因的表达量或细胞增殖率来检验RNA干扰是否成功实现。
G418筛选稳定表达细胞系是一种常见的实验方法。
在筛选前，我们需要准备含有G418抗性基因的质粒载体，然后在适当的时间和浓度下进行G418筛选。
G418筛选稳定表达细胞株精要总结
G418筛选稳定表达细胞系总结一分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经历总结嘌呤霉素杀灭曲线确实定〔shRNA稳定转染细胞株，仅作参考〕〔1〕24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进展后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；〔2〕准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基〔如0-15μg/mL，至少5个梯度〕；〔3〕细胞孵育过夜后参加筛选培养基，孵育细胞；〔4〕约2-3天更换新鲜的筛选培养基；〔5〕每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最正确作用时间一般在1-4天之间。
〔6〕最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开场1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞〔1〕day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；〔2〕制备筛选培养基：含有最正确筛选浓度嘌呤霉素〔由杀灭曲线确定〕的新鲜培养基；〔3〕day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，参加一定量MOI的病毒颗粒；〔参加无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
〕〔4〕病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基〔血清和双抗，如果已经使用双抗。
〕到细胞内，然后孵育过夜；〔5〕病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
〔6〕约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；〔7〕每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最正确的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性：嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结电子教案
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。
）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性：嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结3
Feynman_Ｒ汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们就认为它们100%汇合，也就是汇合度1０0％。
最近的一个实验是：3×106细胞电转后,我把电激杯中的细胞分别接种1/４００0和1/10０0和1／3０0到2４孔板中，48小时后加g４18筛选，这个时候接种了1/３00细胞的孔会大约50%汇合,而理论上接种了1/40０0细胞的孔会4%左右汇合，今天是筛选后第9天,观察到1/40００孔有两三个小克隆,按道理1/300孔会有２0-３0个克隆，但实际的情况是它们几乎全部死光了,仅有少数存活细胞!所以我认为汇合度对g418筛选影响很大，这耽误了我将一个多月。
jiaｎgql 同意菊花与刀对你的建议。
我的感觉G418筛选时间太长,到后来一般会对细胞生长有影响。
以下是一些建议，供参考：首先需要扩增细胞,冻存部分中间产物细胞后,再做克隆化比较合适,否则一旦污染就会全军覆没。
一般5~7天后G４18就可以减半维持。
勤换液，去除死细胞,可以减少对存活细胞的影响。
血清浓度可以高到2０％，质量要好。
进行真核转染的一般程序:克隆目的基因(经测序验证)—准备真核表达载体-将目的基因插入表达载体中－转染－筛选-鉴定下面以pｃDNA３为载体,p16为目的基因，介绍真核转染的实验操作。
一、试剂准备1、ＨBS(Heｐｅs-buｆfered saline）：876mｇNaCl溶于90ml ddH2O,加入1ＭHepeｓ，调ｐH到7.4,补dｄH2Ｏ至１00ｍl,pH７．4，滤过除菌。
2、核酸贮存液,过滤除菌。
3、培养基：含血清或不含血清的,用于转染细胞的正常培养。
二、操作步骤(一）克隆目的基因1、根据GenＢank检索的目的基因序列,设计扩增引物，并在上、下游引物的5’-端分别引入酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ,行RＴ-PCR。
2、回收特异性扩增片段，连入T载体。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5
Q：G418怎么配制？A：我觉得不能用水配，因为这样ＰH会变化很大，至少要用PBＳ。
我是配在HEPＥS溶液中的,具体方法如下：1ｇ包装的G４18瓶子中，加入1０ml HＥPES 溶液，浓度为１00 mｇ/mｌ完全溶解后,0.2２uｍ过滤,－20度保存。
HEPEＳ缓冲液配方如下：90ml水中，0.8 g ＮaCl, 0.037g KCl, 0.0１3５gNa2HPO４.2Ｈ2O, ０．1 g葡萄糖,0．５g HＥＰES，溶解,NaOＨ调PH至7．05,定容至１00ｍｌ。
Gｏod ansｗｅｒ:推荐用HEPES。
特别是当细胞对G41８不敏感,Ｇ４18使用浓度高时，如果用水、PＢS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。
1mｏl/L HEPE Ｓ的简单配置：HEPES 11.91g,溶解于40ml的ddＨ２Ｏ,用１0moｌ／Ｌ的NaO Ｈ调节ｐH至7.５-8.0，定容至５0ml,０.2２um小滤器过滤。
ＨＥPES最终使用浓度15-20mM。
Q:我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的G4１8直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过Ｇ41８杀伤曲线,30０ｕg\ml就基本上可以杀死细胞,我想直接用1０00uｇ＼mｌ来筛选,不知是否可行？会不会有什么问题?Ａ: G41８筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至100０cｅll/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0，,１０0, 200,3０0，400,５０0,600,７00，800,9００, 1000，１1.0０ng/ml等１2个级别，培养10-１４天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-8００左右,筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。
我用过Zeｏcｉn，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418，又称为geneticin，是一种广谱抗生素，常用于筛选稳定转染的哺乳动物细胞系。
G418能够靶向细胞内的Neo基因表达，使转染后含有Neo基因的细胞能够存活。
在此，我们将详细介绍如何使用G418筛选稳定表达细胞系，并常见问题以及解决方法。
G418筛选实验步骤转染表达向量在进行G418筛选实验之前，首先需要将目标基因克隆到表达向量中，并将表达向量转染到细胞系中。
转染方法常见的转染方法有磷酸钙共沉淀法、聚乙烯醇法、脂质体转染法等，具体方法可参考相应文献或实验室内部标准操作规程进行操作。
添加G418将转染过的细胞在培养基中培养至80%～90%的密度后，加入G418。
加入G418前需进行药物浓度优化实验，确定最适合本实验所用细胞系及所选转染质粒的G418浓度。
筛选G418作用于Neo基因表达的细胞会死亡，而未表达Neo的细胞能够幸存下来。
因此通过逐渐增加G418浓度，筛选出稳定表达目标基因的细胞。
扩增筛选出稳定表达细胞后，需要扩大细胞数量以供后续实验使用。
可使用限稀稀释法或其他适合本实验的细胞扩增方法进行扩增。
常见问题及解决方法细胞死亡太多可能原因： - G418浓度过高； - 转染效率低。
解决方法： - 降低G418浓度； - 提高转染效率。
细胞生长太慢可能原因： - G418浓度不足； - 细胞密度过高。
解决方法： - 增加G418浓度； - 控制细胞密度。
稳定表达效果不理想可能原因： - Neo基因位点修饰造成表达低下； - 转染质粒与细胞系不匹配。
解决方法： - 检查Neo基因位点修饰； - 更换适合细胞系的转染质粒。
通过对G418筛选稳定表达细胞系的介绍，我们可以看出，G418筛选是一种快速、有效的细胞系稳定性筛选方法。
通过对常见问题及解决方法的，可以及时解决可能出现的问题，保证实验顺利进行。
祝大家在细胞实验中取得好的结果。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结(总3页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。
）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
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G筛选稳定表达细胞系经验总结Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞的抗性基因是否已经得到表达。
一般是转染48小时后加入抗生素。
挑出单后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。
关于维持浓度，有人说细胞会出现对抗生素的抗性，应不断提高其浓度。
而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的的话，可以调整抗生素的浓度。
当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。
筛选时的培养液加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。
这时会出现两个问题：1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液2，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。
这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。
再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
3，适当增加血清浓度。
筛选时出现的问题及其解决办法：1，问题1。
做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？a、可以减少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度温箱预热，并且PBS润洗细胞层，以减少可能残存的血清的影响；b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散；c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可隆了呀d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。
我的建议：1、在100mmdish中挑克隆，细胞分的稀一点。
2、把细胞全部消化下来，在96孔板中逐步稀释获得单2，问题2。
筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。
一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表达量高且能稳定表达的，不大容易。
这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。
3，问题3。
细胞形态的改变：稳定转染后阳性均出现不同程度的细胞形态的改变。
想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。
不过，我转的是一种抑癌基因。
4，问题4。
单克隆化的时机和个数：加药筛选时,一般等到确认的转染细胞长到70%以上时,再做有限稀释法,以克隆出阳性细胞,同时要保持适当的药物浓度,以防突变和污染。
若细胞长好了,如有40%以上,就可以有限稀释了一般，筛选5，6个克隆就有需要的，但保险起见，筛10个吧。
5，从单化时开始，就要加大营养，清和生长因子。
单化的操作方法；1.方法1。
单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。
培养SPC-A1（人肺癌细胞），转染了EGFP，然后进行了G418抗性筛选和96孔板单筛选，最终获得了成功将我的实验步骤写出来，希望对你有所帮助。
2.方法2。
实验步骤大致为：预先对96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎牛血清的液，0.1ml/孔，并放于箱中温育，然后胰酶消化稳定表达GFP的细胞，细胞液稀释至密度为1000cell/ml的单细胞悬浮液，上述细胞液接种于96孔板的第一排，0.2ml/孔，从中吸取0.1ml细胞溶液接种于第二排，混合后，从第二排中吸取0.1ml接种于第三排……，一直到第八排，最后一排都丢弃0.1ml细胞液，操作示意图见下图。
一般来说，每一列都会有某个孔中只有1~2个细胞。
3.方法3。
我的改进之处：我在显微镜下观察，标记孔中小于10个细胞的孔，然后在显微镜下用记号笔在皿底把单个荧光细胞圈住，然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一共获得了6株单。
但需注意的是：时间不能超过30min，否则细胞极容易死亡。
解决操作时间长的方法：拿一个96板，在里面随便种一些细胞，然后用牙签练习，我练了5～6次后非常熟练了培养液：最好是含15％的胎牛血清，加大营养，有利于细胞生长；另外一种方法是对还没有变黄的细胞液进行过滤，过滤后的培养含有很多生长因子，可以作为单的培养液。
4.方法4。
我曾经帮同事做过挑单克隆，直接将倒置显微镜搬到操净台内紫外照射30分钟，然后先在显微镜下把要挑的单克隆初看一遍，算一下大概要挑几个，然后在96孔板内先加好培养基，再将6孔板内的培养基吸出，加入少量的胰酶，大概能盖住板底即可，然后在显微镜下观察细胞状态，在有些变圆时，即用10ul枪在显微镜下直接吸克隆，放入事先准备好的加了培养基的96孔板内，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使细胞松散扩散开了时，已经吸了将近十个克隆了，动作快一些时能吸十几个，我做过几次了效果很好，没有出现污染。
（在要进行操作时，用酒精将手好好擦擦，将显微镜用新洁尔灭也擦一下，一般不会有什么问题），你可以试试，只要小心一些就行了。
5.方法5。
关于稳转的方法，好像园子里很多xdjm都用的是有限稀释法来作，但是我们实验室基本上都不用九十六孔做有限稀释来作单的，一般的做法都是这样：1。
3.5cm皿铺细胞，长到大概80％以上的时候作转染。
2。
转染后一天消化，传到一个大皿（1：6）或者两个大皿（1：12）。
3。
再过一天后加入带G418的培养基。
4。
依据细胞不同，大概从加入G418的第三天到第八天之间细胞开始出现大量死亡，活下来的细胞就形成单。
5，单长到相对较大的集落后，于显微镜下用200ul枪挑取细胞集落，一般挑上48个，种在两块24孔板上。
6。
于24孔板上继续培养，约4、5天后即可消化传代，取部分作收蛋白western之用，根据western结果确定真阳性。
我们基本上都是这样pickstable的，除非一些对细胞生长抑止作用强大或者apoptosis的inducer之类的基因比较难挑到stable外，一般还都能挑到stable。
当然，转染效率不能太低，超过50％就相对比较容易了，10％以上的可能最后形成的细胞集落就少，而且真阳性也较少。
对于那些转染效率很低的细胞，我会连续转染三次（中间如果细胞长满了就传代），好像比较有效。
除非是类似带GFP这样能直接观察到是否真阳性的基因，我们才用有限稀释法来作，要不好像也太麻烦了吧？耗时也多单化后细胞特点和处理：1.单后细胞生活习性改变：考虑质粒的表达对细胞的生长有一定的影响，查文献确认一下。
2.单后的培养需要多加些血清，再传代时保证板子不影响细胞贴壁，避免出现传代后细胞浮起来后死亡的现象。
3.筛选成单后，不加药培养2代，再加药继续筛选两代，此时如果不出现死亡细胞则可以认为是稳定细胞系。
复苏后加G418传代2次，然后按部就班。
4.过一段时间再筛选时，G418的浓度有人认为需要比稳转时小写，此外，加药后对蛋白质的表达，细胞形态有影响，因此做功能时要停药培养合适时间后再做。
5.稳转PA317细胞后再次筛选（需要隔一段时间再加压筛一次），细胞也是死的厉害，不过还是可以筛到，不过需要用合适的浓度。
可以在细胞传几代后，分出一小部分，不加G418培养一段时间，然后再加你维持细胞的抗性的G418浓度培养一天看细胞会不会死亡，如果死亡，说明外源基因还没有丢失。
6.有人这样做的：转染加药一段时间后，板子上出现了几个克隆，如果有几十个克隆，然后挑其中七八个到24孔板里继续加药筛选，等24孔长满后再转到6孔板继续加药筛选，6孔板里长差不多满后，每孔消化下来大概一半做WB鉴定目的基因表达，剩一半留着继续加药培养，等WB结果出来有阳性的孔就保留下来，阴性的丢掉。
单化后鉴定：1.稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。
原因：瞬转是在强启动子下,稳转时你得到的可能失去了此启动子,或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下!2.转染后质粒整合到是随机的，一般两月后（传代10代以上）还表达你想要蛋白的单可以认为是整合了质粒的。