DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li

DPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验)：详细说明与疑难解答

李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7）

（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH•) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl

3-Oxid e (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297

【概述】DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表：

工作液外观

紫色

墨绿色

蓝紫色

工作液紫外光谱与最大吸收

200

400

6008000.00.51.0

1.5

2.0

2.5

3.0吸光度

波长/nm

519nm

(50 μg/mL)

200

300400

500600700800900

0.00.5

1.0

1.5

2.0

734nm

吸光度

波长/nm

415nm

（0.07mM (NH 4)2ABTS+0.03mM K 2S 2O 8）

200

400

600

800

01

2

吸光度

波长/nm

557nm

(50 μg/mL)

检测波长 519 nm 734nm

557nm （水溶液）

检测原理

当A 519 nm 值减少，表明DPPH·被清除。其清除机制主要是氢转移HAT (hydrogen atom transfer) 当A 734nm 值减少，表明ABTS·+被清除。其

清除机制主要是电子转移ET (el ectron transfer)

当A 557减少，表明ABTS·

+被清除。 其清除机制主要是电子移ET (electron transfer)加质子转移PT (proton transfer)

用途

主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。 主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。

通过调节缓冲液的pH 值，可以检测其抗氧化机制。

优势

清除速度较快，约30分钟（室温下）。 清除速度较快，约6分钟（室温下）。

（1）水溶性好，与生物相关性强；

（2）是氧自由基，能更好地表往ROS 清除水平；

（3）抗氧化机制明确：pH 值小于5.0时，为电子转移ET 机制。当调节pH 值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH 值有关，也就是说与氢离子（质子）浓

【实验讲解】

1.DPPH•自由基清除实验[1]

1.1 DPPH测试液的配置

取DPPH固体1mg溶于24mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。最好避光保存，5小时内用完。取1mL上述步骤配置好的DPPH溶液，加0.5mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）稀释后，使其吸光度为0.6-1.0之间。若吸光度过大，则继续加溶剂；若吸光度过小，则补加DPPH固体或者原始溶液。

1.2 样品液的配置

样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选甲醇、95乙醇或无水乙醇（尽量与DPPH溶液所用溶剂相同），如不溶可用DMSO。

1.3 预试

取DPPH溶液1.0 mL，加0.5mL相应有机溶剂后，往其中加少量样品液。加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。如果反应缓慢可在37℃烘箱中放置半个小时。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到500 μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则500 μL为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL。

A0值：取DPPH溶液1.0 mL到比色皿中，加对应有机溶剂0.5 mL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0须在0.8-1.0之间）。

A值：取（500-x）μL 有机溶剂到比色皿中，加样品液x μL （x是根据1.3预试结果确定样品液的用量），再加DPPH溶液1.0 mL，混合使反应液总体积为1.5 mL。测A值。

【如】某样品的用量梯度为100 μL、200 μL、300 μL 、400 μL、500 μL，则加样如下：

样品液95乙醇（或无水乙醇）DPPH测试液总体积

0μL 100μL 500 μL

400 μL

1.0 mL

1.0 mL

1.5 mL

1.5 mL

200μL300 μL 1.0 mL 1.5 mL 300μL200 μL 1.0 mL 1.5 mL 400μL100 μL 1.0 mL 1.5 mL 500μL0 μL 1.0 mL 1.5 mL 1.4 最终测量

每测一个用量需要测三个平行数据。

1.5 DPPH•清除率（抑制率）的计算