重金属对植物叶片抗氧化酶活性影响实验

重金属对植物叶片抗氧化酶活性影响实验

寂静的环科

原理

重金属对植物的伤害与自由基的产生有关。自由基是指含有未配对电子的原子、原子团或特殊状态的分子，其中以氧自由基（oxygen free radical，OFR）对生物体的危害最大。OFR包括超氧阴离子自由基（O2-）、羟自由基（·OH）等。自由基是生物体的正常代谢产物，由于生物体存在防御系统，所以正常情况下危害不大。

生物体主要通过抗氧化酶系统防御自由基损伤，此酶系统包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）等。当重金属污染时，重金属的积累直接破坏了防御系统中酶的活性（徐勤松，2001），降低了防御酶清除自由基的功能，加剧了膜脂过氧化作用，造成细胞器不可逆损伤，破坏了植物的正常生命活动的结构基础。在重金属的胁迫下植物体内积累

H2O2，而H2O2的过量积累使植物体内的抗氧化酶系统和非酶系统发生紊乱，从而导致植物对重金属的抗性机制不再起作用，表现出毒害症状甚至死亡。所以，本实验通过对比测定分析空白土壤样品和重金属砷污染土壤样品中植物叶片中的抗氧化酶（过氧化氢酶CAT和超氧化物歧化酶SOD）的变化来反映重金属砷对植物叶片中抗氧化酶活性的影响。采用微孔板分光光度计测定这两种酶的活性。即H2O2在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶（CAT）能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

实验材料与药品

1、实验材料

研钵，10ml离心管，容量瓶（1000、100ml），10ml试管，离心机，紫外分光光度计，恒温水浴锅，天平、石英比色皿，移液管（5ml、1ml、200ul）、移液枪头（5ml、1ml）、一次性防护手套、一次性防护口罩、医用剪刀、100毫升烧杯、50毫升烧杯、称量纸、石英砂、橡胶手套、CAT试剂盒、滤纸等。

2、实验试剂

（1）生理盐水：0.9%氯化钠溶液

（2）CAT试剂盒组成与配制：(100T/96样)

试剂一：液体100ml×1瓶，4℃保存6个月。

试剂二：底物液体10ml×1瓶，4℃保存6个月。

试剂三：显色粉剂×1瓶，4℃保存6个月。加双蒸水至100ml 溶解，4℃保存1个月。（如果底部有不溶粉末沉淀，直

接取上清使用，不影响测定结果）

试剂四：液体10ml×1瓶，4℃保存6个月。天冷时会凝固，临用前37℃水浴至透明方可使用。

（3）标准蛋白质溶液：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100ml，吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml即可。4℃下保存备用。

（4）考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml纯乙醇中，加入100ml85%（w/v）的磷酸，再用蒸馏水定

容至1000ml，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。

3、实验仪器

分光光度计、恒温水浴锅、天平、高速冷冻离心机。

实验方法与步骤

1、组织匀浆液的制备

准确称取组织重量，按重量（g）:体积（ml）=1:9的比例加入

9

倍体积的生理盐水，冰水浴条件下，制备成10%的组织匀浆，2500转/分离心10分钟，取上清，再用生理盐水稀释成最佳取样浓度，待测。

2、操作表

混匀，37℃准确反应1分钟（60秒）

混匀，波长405nm，光径0.5cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

3、组织中CAT活力的计算

（1）、定义：每毫克组织蛋白每秒钟分解1µmol 的H2O2的量为一个活力单位。 （2）、计算公式：

1

()271*60(/)

(/)

CAT OD OD U mgprot mgprot ml =-⨯⨯

÷

⨯组织匀浆中活力

待测样本蛋白浓度对照值测定值取样量 注：* 271为斜率的倒数 4、测定蛋白质 （1）原理

考马斯亮蓝G –250 （Coomassie brilliant blue ，G-250 ）法是利用蛋白质–染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465 nm 变成595 nm ，通过测定595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1 h ，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。

（2）标准曲线的绘制

取6支试管，标号后，按下表加入试剂，混合均匀后，向管中加入5ml G-250溶液，摇匀，并放置2min 后，以0号试管为空白调零，在595nm 下比色测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以A 为纵坐标，绘制标准曲线。

试剂

管号

1 2 3 4 5 标准蛋白

（ml ）

0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水（ml ） 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0 蛋白质含量

（ml ）

20

40

60

80

100

（3）样品测定

①样品提取：称取鲜样0.1g ，用5ml 蒸馏水研磨成匀浆后，3000r/min 离心10min ，上清液备用。

②测定：吸取样品提取液1.0ml 放入试管中，加4ml 蒸馏水，稀释后抽取1ml 稀释液，每个样品重复2次，加入5ml 考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置2min 后，以1ml 蒸馏水+5mlG-250空白调零，再595nm 波长下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查的蛋白质含量。

③结果处理：

样品中蛋白质的含量（mg/g ）=1000⨯⨯⨯F S T

W V V C

式中： C ——查标准曲线值；

VT ——提取液总体积（ml ）； WF ——样品险种（g ）； VS ——测定时加样量（ml ）。