基因工程实习指导书-0801081

基因工程实习指导书

适用专业：生物技术周数：2周

学分：2 编写人：陈英审定人：

1实习目的

植物遗传转化(genetic transformation)是指将外源基因导入植物细胞，获得转基因植物的技术。自1983年第一株转基因烟草问世以来，二十多年来，转基因技术已得到长足的发展。

植物遗传转化方法是植物遗传转化的重要环节，迄今为止已建立了多种植物遗传转化体系和转基因技术。归纳起来，包括农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电击法、显微注射法等，其中农杆菌介导法是目前双子叶植物转基因最常用的方法。通过本实习，学生进一步学习植物遗传转化的基本原理，了解植物遗传转化与检测的流程，掌握多种以根癌农杆菌位介导的植物遗传转化方法和技术。

2实习内容

实验一拟南芥花序浸润转化

拟南芥是自花授粉植物，具有高度纯合、植株小、生长周期短（从发芽到开花不超过6周）、结籽多和生活能力强的优势。用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。所以拟南芥是进行遗传学研究的极好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。

一、实验目的

通过本实验，进一步学习农杆菌介导植物遗传转化的基本原理，掌握拟南芥花序浸润法遗传转化的流程。

二、实验原理

农杆菌介导的基因转化利用的是一种能够实现DNA转移和整合的天然系统，即根癌农杆菌的

Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒。Ti质粒经过改造，使之带有T-DNA的左右边界序列，左右边界序列间是多克隆位点，便于目的基因的插入。将构建好的质粒转入农杆菌，然后再转入植物，目的基因通过T-DNA序列与植物受体细胞染色体DNA同源序列进行同源重组而整合。通过选择标记筛选及分子检测，既可获得转基因植株。

三、实验材料

拟南芥

四、仪器设备

1）剪刀、培养皿、三角烧瓶（高压灭菌，烘干）

2）50ml离心管、2ml离心管、1ml枪头、200μl枪头（高压灭菌，烘干）

3）超净工作台、摇床、离心机。

五、实验步骤

1. 拟南芥种植：把种子悬浮在0.05% 琼脂糖中，黑暗中，4℃，放置3天，打破休眠。这一步可以使得种子萌发一致，并且提高萌发率。每一个培养盆中放置4-5个种子。

2. 如果有条件在短日照条件下生长3-4周（8小时光照，16小时黑暗），然后将他们转移到长日照下诱导开花。播种的前两周加盖保鲜膜保持高湿度。

3. 当拟南芥花序生长到2-3厘米，剪掉花序的头部，可以使得更多的花絮冲莲座叶的基部生长，在这之后6-8天可以进行转化。转化之前移除已经产生的长角果，可以增加转化效率，并且减少首次筛选时的污染情况。

4. 准备含有要转化基因的农杆菌EHA105(pBI121)，从stock中划平板，挑取单克隆，在5-ml液体LB培养基中（含有50mg/L Km和50mg/L Str），28℃生长24小时。

5. 1:100或1:200扩大培养，40ml LB（含有两种抗生素）。28℃生长16-24小时，细胞生长到静止状态（OD600=1.5-2.0）。

6. 4000g室温离心10min，收集菌体，使用40ml新鲜配制的5%（wt/vol）蔗糖溶液重悬菌体。离心和重悬在50ml管中完成。

7. 在上述溶液中加入8μl Silwet L-77（0.02% (vol/vol)），立即混匀，可以进行下一步dip。

8. 每一个花序浸泡1min，不要忽略生长在莲座叶基部的花序，浸泡完的植株侧倒放置在托盘中，然后使用保鲜膜包裹托盘。黑暗，室温，保持湿度放置24小时。

9.去掉保鲜膜，将拟南芥放回培养箱，正常生长1个月，此间需要水分较多，不要忘记浇水。之后停止浇水，等待长角果成熟。

10. 使用筛子收集种子，最好使用滤纸包裹种子而不是管子存放种子（很难取出）。4℃在培养皿中存放。

六、溶液配制

LB培养基1L

NaCL 10g

Peptone 10g

Yeast extract 5g

实验二使用潮霉素B 对拟南芥T1代种子进行筛选

植物遗传转化的目的就是将外源基因整合到受体树种的基因组中并使之有效地表达，因此涉及的基因有两类：一类被称作为报告基因(reporter gene)或称为标记基因(marker gene)，另一类就是有一定经济价植的目的基因。

选择标记的功能是在选择压力下把转化体选择出来。为了这个目的，要在培养基中加入选择剂，产生选择压力，导致未转化细胞不能生长，发育。含有标记基因的细胞，对选择剂具有抗性，能够正常生长。

常用的标记基因：新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）——卡那霉素；潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）——潮霉素；抗除草剂基因（Bar)——双丙氨磷。

一、实验目的

学习利用标记基因筛选转化体的原理和技术，掌握筛选转化体的流程与技术。

二、实验原理

将所收获的T0代植株采用floral-dip进行转化后的T1代种子播种于含有相应抗生素（视载体中的筛选标记基因而定）的培养基上，进行萌发。转化体由于已转入了筛选标记基因，并得以表达，从而解除了该抗生素对植物体产生的胁迫，植株可正常生长，而非转化体却因选择压力而逐渐死亡。

三、实验材料

拟南芥T1代种子

四、仪器设备

1）培养皿、三角烧瓶（高压灭菌，烘干）

2）10ml离心管、2ml离心管、1ml枪头、200μl枪头（高压灭菌，烘干）

3）超净工作台、培养箱、离心机。

五、实验步骤

1.T0代植株采用floral-dip进行转化后，收取T1代种子。

2.将T1代种子放入1.5mL EP管中，约放入到管底接合部1/2处（约需要9cm培养皿2个），

使用Milli-Q清洗种子，在4℃中放置3天。

3.加入70%乙醇1 ml，混匀30s

4.静置15s，用枪将乙醇吸去

5.加入1mL 0.1% HgCl2+0.1% Triton X-100，涡旋3min

6.静置15s，用枪吸去上清

7.使用灭菌水，清洗4次，每次静置，吸走上清

8.加入灭过菌的0.05%agarose（琼脂糖）3mL，涡旋，使种子重悬，使用剪头的蓝枪头，将种

子分别打到含有或不含有抗生素的Basic Agar medium平板上，晃动平板，使种子尽量分散。

9.Parafilm封好培养皿，在光照培养箱中16h光照培养，10d观察结果，阳性T1代seedlings

应该明显比非转化植株大。

六、溶液配制

Basic Agar medium平板

① KNO3 1g 溶解到10mL去离子水中，1.5mL管分装，-20℃保存

② 100mL 去离子水，加入琼脂粉0.8g，KNO3溶液100μL，pH自然，高压灭菌

③微波炉中融化，加入Hygromycin 20mg/L，cefotaxime 100mg/L，倒平板。

实验三gus基因在烟草中的瞬时表达

转基因植物的分子检测是鉴定转基因植物的重要手段。目前转基因植物的鉴定方法有很多种，要根据不同的转化系统和转化技术，选择合适的检测方法，通常采用PCR技术、Southern杂交，Northern杂交，GUS与BAR生化检测，蛋白质分析技术等方法。