外源基因表达系统
piggybac基因诱导表达系统原理
piggybac基因诱导表达系统原理piggyBac基因诱导表达系统是一种广泛应用于生命科学研究领域的工具，可以实现外源基因的高效表达。
本文将介绍piggyBac基因诱导表达系统的原理，包括系统构建、基因转移和表达过程。
一、系统构建piggyBac基因诱导表达系统是基于转座子（transposon）的一种工具。
转座子是一种特殊的DNA序列，具有自主移动的能力，可以将自身从一个位置剪切并插入到另一个位置。
piggyBac转座子最早来源于昆虫的基因组，经过改造后用于基因转移。
piggyBac基因诱导表达系统由两部分组成：转座子和转座酶。
转座子是一个DNA序列，其中包含了外源基因的编码区域和转座酶识别和切割的序列。
转座酶是一种酶，具有剪切和粘合DNA的能力，可以将转座子插入到宿主细胞的基因组中。
二、基因转移piggyBac基因诱导表达系统的基因转移过程分为两个步骤：转座子的切割和粘合。
首先，转座酶识别转座子的两个特定序列，将转座子从载体DNA上剪切下来。
然后，转座酶将转座子插入到宿主细胞的基因组中的某个特定位置。
这个特定位置由转座子的序列决定，可以通过改变转座子的序列来选择不同的插入位点。
三、表达过程一旦转座子被插入到宿主细胞的基因组中，外源基因就可以在宿主细胞中进行表达。
转座子中的外源基因包含了启动子、编码区和终止子。
启动子可以驱动外源基因的转录，使其得到mRNA的合成。
编码区包含了外源基因的编码序列，可以被细胞转录为蛋白质。
终止子用于终止转录过程。
piggyBac基因诱导表达系统具有以下优点：1.高效性：piggyBac转座子可以在宿主细胞的基因组中稳定插入，从而确保外源基因的长期表达。
2.灵活性：通过改变转座子的序列，可以选择不同的插入位点，从而达到对目标基因的精确调控。
3.稳定性：piggyBac转座子的插入是稳定的，不易被剪切酶剪除或丢失。
总结起来，piggyBac基因诱导表达系统是一种高效、灵活和稳定的工具，可以实现外源基因在宿主细胞中的高水平表达。
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
第七章-外源基因的表达
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第一节 外源基因在原核细胞中的表达
1.原核生物基因表达的特点
与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点： （1）原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有三种）识别 原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 （2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。 （3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是 连续进行的。 （4）原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细 胞的转录后加工系统。 2（0215/4）/9 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对 2
202菌中的表达部位
（1）不同表达部位
克隆在大肠杆菌中的外源基因，它们的编码产物蛋白质，有 的是在细胞质中表达，有的是在细胞周质中表达，还有的则是 以分泌到细胞外的方式表达。
■细胞质中表达
大肠杆菌细胞质中表达的外源蛋白，大多是以包含体的形式 存在的。包含体是存在于细胞质中的一种由不溶性蛋白质聚集 折叠而成的晶体结构。
（1）非融合型表达蛋白载体pKK223-3
➢具有一个强的tac（trp-lac）启动子，这个启动子是由trp启 动子的-35区、lac UV5启动子的-10区、操纵基因及S-D序列 组成。
➢紧接着tac启动子的是一个取自pUC8的多位点接头，使之很
2容021易/4/9把目的基因定位在启动子和S-D序列之后。
的基因，而不能用基因组DNA。 （3）必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控 制外源基的表达。 （4）外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读 框架。 （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外 源基因的表达产物对宿主菌的伤害。
3.原核生物基因表达的调控序列
酵母表达(1)
酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。
酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。
本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。
原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。
通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。
1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。
2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。
3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。
2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。
3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。
4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。
应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。
2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。
3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。
4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。
5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
外源基因的表达
•Ⅱ型启动子
Ⅱ型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。
转录起始位点
TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它 启动子 与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。 基本区 其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置。 CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA 聚合酶的结合有关。 GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处， 与转录因子的结合有关。
s factor:
6.2.1.4 启动子的分离
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。 增强子的特性：
双向性。
重复序列。 增强子行使功能与所处的位置无关。
特异性。
增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
序列特异性
*启动子的特征 方向性 位置特性 种属特异性
6.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为 CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基 （A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启 动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的 重要因素。
6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
外源基因的原核表达
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常见的大肠杆菌表达系统
• PL和PR启动子表达系统：以λ噬菌体早期转录启 动子PL和PR构建的。在野生型λ噬菌体中，PL和 PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或 溶原循环。 λ噬菌体PE启动子控制的cl基因表达产
物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而其表达和在
细胞中的浓度取决于一系列宿主与噬菌体因子之 间的复杂平衡关系。通过细胞因子调节cl在细胞
与起始密码ATG之间的距离及碱基 的种类；防止核糖体结合位点附近 序列转录后形成发卡结构。
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表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标
基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之 间的距离和碱基组成处于一个适当的范围 内。
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核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻
1、原核生物：选择一个RNase缺失 的工程菌株。
2、真核生物：提高mRNA的正确加 工
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外源基因mRNA的有效翻译 为使外源基因有效翻译，在构建表
达体系时应考虑以下问题：
1、AUG为首选起始密码子 2、SD序列为与核糖体结合位点
3、SD序列与起始密码子之间的距离为 3～9个碱基 4、在翻译起始区周围的序列不易形成 明显的二级结构 5、选择合适的终止密码子
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尽量提高核糖体结合位点本身和附近 的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5’ 端形成的 “茎环” 结构的可 能性，也是构建表达质粒时需要注意 的事项。
择压力下保存于大肠杆菌细胞内 2、具有显性的转化筛选标记 3、转录可以调控，抑制时本底转录
简述基因工程中常用的表达系统及其优缺点
简述基因工程中常用的表达系统及其优缺点基因工程是一种在生物体内对其遗传物质（DNA）进行修饰的一种技术，包括基因插入、替换、转换等技术。
这些技术可以实现改变基因的大小、改变基因的结构、更改生物体的性状等。
表达系统是实现基因工程的重要技术手段，主要分为抗性表达系统和非抗性表达系统两大类。
抗性表达系统是一种自毒型表达系统，可以将外源基因表达于细胞内。
此种系统主要分为哺乳动物遗传载体系统(MCS)和细菌遗传载体系统(BCS)，是基因编辑技术的主要载体。
MCS可以实现灭活特定基因的功能，BCS可以将外源基因表达于细胞内，使其能够表达特定基因。
而抗性表达系统的优点在于可以控制外源基因的表达，而对基因突变及其调控有重要意义。
但缺点是，它只能实现有限的基因操作，不能实现复杂的基因编辑技术。
非抗性表达系统由质粒、表达调控元件和外源基因组成。
它的优点是可以实现高效的外源基因表达，同时还可以实现复杂的基因编辑技术。
但缺点是对基因表达有较高的要求，且在许多情况下，非抗性表达系统的表达效率更低。
通过比较可知，抗性表达系统主要用于灭活特定基因，而非抗性表达系统则可以实现高效和复杂的基因编辑技术。
因此，在根据实际应用场景选择正确的表达系统时，应充分考虑其优缺点，才能够有效地实现基因工程。
基因工程技术是一种改变或改善生物体性状的有效手段，像MCS、BCS等抗性表达系统可以灭活特定基因的功能，而质粒、表达调控元件和外源基因构成的非抗性表达系统则可以实现高效的外源基因表达和复杂的基因编辑技术。
抗性表达系统可以控制外源基因的表达，但只能实现有限的基因操作；而非抗性表达系统虽然可以实现复杂的基因编辑技术，但受到基因表达的要求较高，且表达效率也更低。
因此，在基因工程技术中，正确选择表达系统以及充分考虑其优势和劣势是至关重要的。
综上所述，表达系统在基因工程中起着重要的作用，可以实现高效的基因表达和复杂的基因编辑技术。
MCS和BCS抗性表达系统可以灭活特定基因，而非抗性表达系统则可以实现复杂的基因编辑技术。
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。
以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。
质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。
2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。
这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。
3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。
选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。
4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。
这一步通常涉及DNA 连接酶。
5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。
质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。
6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。
这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。
7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。
8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。
这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。
9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。
这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。
整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。
这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。
简述基因工程中常用的表达系统及其优缺点
简述基因工程中常用的表达系统及其优缺点基因工程是现代生命科学的主要分支之一，这门学科的发展主要是基于分子生物学的基础知识，致力于研究操纵和编辑生物体的遗传物质，以实现一定的目的。
基因工程在农业、医疗、军事、安全和环境保护等诸多领域的应用，已经给人类带来了许多好处。
基因工程中使用的表达系统主要有质粒、细菌表达系统、动物细胞表达系统和植物细胞表达系统。
它们各自具有独特的优缺点，可以满足不同的基因工程应用。
一、质粒表达系统质粒表达系统是基因工程中最常用的表达系统之一，它可以在宿主细胞中对外源基因进行稳定表达。
传统的质粒表达系统由一个含有增强子的外源基因组成，这些增强子可以有效地增强基因的表达，使基因的表达水平有所提高。
优点是这种表达系统的准备工作容易、成本低，表达效率较高，但是缺点也很明显，宿主细胞往往会产生抗性，导致基因表达受到抑制，这也是这种表达系统的主要缺点。
二、细菌表达系统细菌表达系统是一种非常常用的表达系统，主要是利用细菌的表达机制来表达外源基因。
优点在于它可以有效地表达基因，并且表达的成本也比较低，而且它的可制备性也很高，在细菌中表达的成本也比较低，但是也有缺点，如细菌中表达的基因通常缺乏活性，使得基因不能有效地表达。
三、动物细胞表达系统动物细胞表达系统是基因工程中最常用的表达系统之一，主要是利用动物细胞的代谢机制，将外源基因植入动物细胞中，再使其表达出目标基因t。
这种表达系统的优点有：(1)物细胞可以制备细胞因子，从而使表达的基因更具有活性；(2)动物细胞具有复杂的细胞调控机制，可以有效地表达基因；(3)动物细胞可以比较容易地进行克隆，这也是这种表达系统最有价值的地方。
但是，动物细胞表达系统也存在一些缺点，比如宿主细胞抗性增加，基因表达受到抑制；高细胞表达成本，细胞的获得和细胞的维护成本都很高；动物细胞的移植技术较弱，缺乏稳定的移植技术。
四、植物细胞表达系统植物细胞表达系统是基因工程中最近发展起来的表达系统，主要是利用植物细胞的代谢机制来表达外源基因。
第七八章-外源基因的表达及其优化策略20201112
略 稳定性 翻 译 的
培养基 环境因素对 受体菌生长 的影响
终止
诱导时间和
密码子
诱导剂量
的选择
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
一 、真核生物基因表达与调控的特点
一 、真核生物基因表达与调控的特点
二 、真核生物基因表达载体的组成特征
基因组DNA的存在形式可影响基因表达 原核DNA序列
转录与翻译不偶联
启动子
调控是多层次的 具有组织和细胞类型特异性
增强子 终止子 内含子 选择标记基因，
对信号分子反应不同
PloyA加尾信号
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
二、真核生物基因表达载体的组成特征
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
根据启动子的功能和作用方式不同，真核基因的表达载体 的启动子可以分为几种类型，每一种类型的优缺点是什么？ 三、真核表达的受体系统 按照宿主细胞的不同，常用外源基因的真核受体系统可大 致分为酵母、职务、昆虫和哺乳动物等受体系统。 每种受体的系统的特征如下表：
原核生物基因表达一般以操纵子为单位 启动子特征：作用要强；必须表现最低水平的基础转录活性；启动
子具有简便和廉价的可诱导性
原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原 特征：SD序列与起始密码子的间距对翻译起始效率影响较大；
核生物的启动子，催化所有RNA的合成 mRNA-rRNA的互补区域越长，基因翻译的概率越大；SD序列与起始
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
四 、合适分离纯化介质的选择 1 、分离纯化蛋白质的材料 理想的蛋白质分离纯化应具有以下几个方面的性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率；在分离纯化过程中不 会造成目标蛋白的变性；化学性能和机械性能稳定，重 复性好；价格低廉，成本低。
第十章外源基因表达和基因工程药物
（二）顺式作用原件（启动子、增强子和沉默子） 直接影响基因表达活性 （三）转录因子的调控 （四）真核生物在转录后仍可控制mRNA的结构和 功能，其在转录后层次不同于原核生物
目标蛋白性质
是否需要糖基化
三维结构复杂程度
是
否
简单结构
真核表达 系统
原核表达 系统
复杂的三维结构
• 目的：针对难以或无法从自然界直接提取、 分离、纯化所获得的，或制造成本、产量 规模等受限制的，或利用化学方法无法合 成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物， 利用细胞或组织或器官或生命体的复制、 转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、 修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生 物分子，并从中将表达产物分离纯化至预 期程度，最终加工成药品。
测序；表达图谱 4. 法医—犯罪现场标本分析 5. 肿瘤—各种肿瘤检测 6. 其他……
二、目的基因与表达载体的重组
• 重组载体的构建：对目的基因和载体DNA 进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接 形成完整有复制能力的重组体。
（一）载体
• 对于外源基因的表达，第二个问题就是选 择合适的表达载体并将目的基因重组至表 达载体上。
第十章外源基因表达与基 因工程药物
第一节 概 述
• 外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控 系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白 质的过程。
• 具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码 外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通 过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞 的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系 统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的 蛋白质。
• 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键 在于：选择合适的重组位点、剪切位点； 以及剪切后适当的条件将目的基因和载体 DNA分子连接获得重组分子。
基因工程-外源基因在酵母菌中的表达
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
外源基因表达系统
➢再将中间的一段切除，留下两端有活性的部 分，即21aa酸残基的A链和30aa的B链
➢两条链由两个二硫键连接成有生物活性的胰 岛素。
3、蛋白质的化学修饰
➢简单的化学修饰： 将乙酰基、甲基、磷酸基、羟基等小基
团加到氨基酸侧链上，或者加到氨基端或羧 基端 ➢不同蛋白质可以有完全相同的修饰 ➢相同的蛋白质可以有完全不同的修饰 ➢磷酸化在基因表达中具有重要的调控作用
• 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行 翻译后的加工和修饰，从而表达出有生物 活性的外源蛋白
• 营养要求低，生长快，培养基廉价，便于 工业化生产
• 可高密度发酵培养.
• 表达量高，数百mg/L以上水平 • 表达的蛋白既可存在于细胞，又可分泌到
胞外。由于甲醇酵母自身分泌的蛋白（背 景蛋白）非常少，十分有利于纯化。
• 例1：表达白细胞介素－2，表达产物无需 复性处理，即具有生物活性。产率达 50mg/L。
• 例2：表达人表皮生长因子（EGF），产率 达1g/L以上。 澳大利亚盛产羊毛，每年需要大批的剪羊 毛的技工，由于EGF可引起羊毛从根部自 行脱落，故每只羊注射5mgEGF，在1月后 可用手直接抓下羊毛。
利用梭菌属嗜热菌株 由纤维素生产乙醇
第三节 昆虫细胞表达系统
昆虫属于动物界节肢动物门昆虫纲， 其发育过程以变态而著称。
昆虫是地球上分布最广、数量最多的 动物，有上百万种。
用于表达外源基因的多为家蚕系统。
昆虫表达系统
昆虫是高等真核生物,能进行翻译后加 工和修饰. 昆虫细胞常用于真核蛋白质的生 产.其生长速度快,不需要CO2培养箱,易于悬 浮培养,可用于大规模表达蛋白质.
外源基因表达的基本流程
外源基因表达的基本流程包括以下几个关键步骤：克隆：1.1.选择合适的限制性内切酶将外源基因从其原始DNA中切割出来。
2.将切割后的外源基因插入到表达载体（如质粒、病毒载体等）的多克隆位点，确保正确的阅读框和若为分泌型蛋白还需考虑信号肽序列的一致性。
重组载体构建：1.通过连接酶的作用将外源基因与线性化的载体连接起来形成重组DNA分子。
2.验证重组体是否成功构建，通常采用PCR、酶切分析或测序技术。
2.转化：1.将重组载体导入宿主细胞，常见宿主有大肠杆菌、酵母菌或其他哺乳动物细胞系。
2.转化方法可以是电穿孔法、热激法、PEG介导法或者原生质体融合法等。
3.筛选与鉴定：1.在含有合适选择标记（如抗生素抗性基因）的培养基上筛选转化成功的细胞。
2.进一步通过PCR验证、Southern blotting 或 Westernblotting等方法确认外源基因是否已整合入宿主染色体并正确表达。
4.诱导表达（对于可调控表达系统）：1.如果使用的是诱导型表达系统，会在适当时间加入诱导剂（如IPTG对 lac 操纵子的诱导），促使外源基因开始转录和翻译。
5.表达产物检测与纯化：1.表达出的蛋白质可以通过SDS-PAGE、Western blotting等方法进行定性和定量分析。
2.对于需要进一步应用的重组蛋白，还需要通过亲和层析、离子交换层析等多种纯化策略得到高纯度的目的蛋白。
功能鉴定：1.最后，对外源基因编码的蛋白质进行生物学功能的测定，以证明其活性和用途，比如在药物研发、疫苗生产或遗传疾病治疗中的应用。
外源基因表达机制
B）构建重组异源蛋白表达系统 将SD序列和启动子安装在外源基因的5’端 ATG碱基前的正确位置，使外源基因高效表达序 列正确的天然蛋白． C）构建分泌型异源蛋白表达系统 将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因 拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直 接进入到培养基中． 优点：增大表达蛋白的稳定性大大简化后续 的分离纯化步骤．
原核生物启动子
转录起始位点。多数细菌启动子转录起始区序列为 CAT． Pribnow框。在距转录起始位点上游6bp处存在一个六联 体保守序列： TATAAT ，由于中间的碱基位于转录的起始 点上游的 10bp 处，又称为 -10 序列区。少数 Pribnow 框 中间碱基的位置在-9-18之间变化。 Sextama 框。在转录启动区的另一个六联体保守序列位 于距转录起 始位点上游 35bp 处，通常称为 -35 区，该 保守序列为TTGACA，它是 RNA聚合酶的识别位点。 间隔区。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基 组成对启动子的功能并不十分重要。但间隔序列的长 度却是影响启动子功能．
5 绝缘子
* 绝缘子（insulator）：在真核生物基因组中， 既是基因表达的调控元件，也是一种边界元 件．在果蝇和鸡的基因组中已发现多个绝缘子， 它能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启 动子起增强或抑制作用．
* 果蝇中绝缘子SCS和SCS’分别位于果蝇多线染色 体87A7座位hsp70基因两侧的核酸酶高度敏感 区，它们是一种具有顺式调控作用的边界元件， 能使其界定的染色体结构域上的基因免受区域 外两端正调控和负调控信号的影响．
Ⅲ型启动子。 * 内启动子:转录起始位点的下游，如tRNA和5sRNA 的启动子。 * 外启动子:转录起始位点的上游，如脊椎动物U6 核小RNA和7SK RNA启动子，其结构类似于真核生 物Ⅱ型启动子。
基因工程-第9章-外源基因的表达
故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，
Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。
-35区，位于转录起始位点上游35bp处， 故称-35区，一般由10个碱基组成。一般认为， -35区是RNA聚合酶σ亚基的识别与结合位点。 当σ亚基附着在-35区后，便带动RNA聚合酶 的核心酶(core enzyme，无σ亚基的RNA聚合 酶)沿DNA链向转录起始方向滑动至Pribnow盒， 并与之接触，而一旦它们相互结合之后，σ亚
转录终止子，目的是为了稳定载体系统。因
为上游强的tac启动子控制的转录必须由强终
止子抑制，才不至于干扰与载体本身稳定性 有关的基因 表达。
2.分泌型克隆表达载体pIN Ⅲ系统
这个载体系统是以pBR322为基础构建的。
它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即
Ipp(脂蛋白基因)启动子。ห้องสมุดไป่ตู้启动子的下游装
1. 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶
结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表 达不可缺少的重要调控序列。没有启动子， 基因就不能转录。
原核生物启动子是由两段彼此分开且又 高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成 极为重要。
Pribnow盒，位于转录起始位点上游5～
10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，
点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／
C的区域，G／C富含区域又具有回文对称结 构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环
结构，并且具有与A/T富含区对应的一串U。
4．衰减子
衰减子(attenuator)是指在某些前导序列中 带有控制蛋白质合成速率的调节区。在原核 生物中，一条mRNA分子常常编码数种不同的 多肽链。这种多顺反子mRNA的头一条多肽链 合成的起始点，同RNA分子的5’-P末端间的距 离可达数百个核苷酸。这段位于编码区之前 的 不 转 译 的 mRNA 区 段 ， 叫 做 前 导 序 列 (1eader)。此外，在mRNA的3'-OH末端，以及 在多顺反子mRNA中含有的长达数百个碱基的 顺反子间序列(intercistranic-sequence)，即间隔 序列 (spacer)，也发现有不转译的序列。
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2015-4-性的过程，有时非常困难。活性
蛋白质的终产量低。
• 形成包涵体的外源蛋白质，一般没有生物活性。
• 细胞质还原的环境不利于形成二硫键
• N-末端存在甲硫氨酸，蛋白质真实性受影响
• 蛋白质种类多，纯化工作量比较大。
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②周质中表达 • 周质（periplasm)—大肠杆菌一类格兰氏 阴性细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞
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常用的大肠杆菌启动子
• Plac
• Ptrp
来源于乳糖操纵子
来源于色氨酸操纵子
• PL
• PrecA
来源于λ噬菌体早期操纵子
来源于recA基因
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启动子的可控性
目前使用的大肠杆菌启动子，一般含 有与阻遏蛋白特异性结合的序列，因此由 这些启动子介导的外源基因在大肠杆菌细 胞内通常是痕量表达的。例如在不含乳糖 的培养基内， Plac 启动子处于阻遏状态，
3、蛋白质的化学修饰
简单的化学修饰： 将乙酰基、甲基、磷酸基、羟基等小基 团加到氨基酸侧链上，或者加到氨基端或羧 基端 不同蛋白质可以有完全相同的修饰 相同的蛋白质可以有完全不同的修饰 磷酸化在基因表达中具有重要的调控作用
结构
• 表达于细胞质中的蛋白，借助信号肽穿过
细胞内膜到达周质
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优点： • 蛋白种类少，易纯化 • 酶解程度低 • 促进二硫键的形成和蛋白质的折叠 • 蛋白质N-端真实性 缺点： • 转运的效率不稳定
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③ 表达产物分泌到细胞外 • 诱导大肠杆菌细胞分泌外源蛋白质 • 利用信号肽； • 融合蛋白配体； • 透化剂；
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酵母菌的种类
• 酵母菌（Yeast） 有56个属500多个种组成。 如果说大肠杆菌是最成熟的原核表达系统， 则酵母菌是最成熟的真核表达系统。 常用的有： 酵母属（如酿酒酵母） 毕赤酵母属（如巴斯德毕赤酵母属） 裂殖酵母属（如非洲酒裂殖酵母）
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一.啤酒酵母
• 啤酒酵母又名面包酵母，被称为真核生物
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此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物组
成的廉价培养基进行发酵，内含微量的色
氨酸，欲使外源基因表达时，可加入富含
色氨酸的胰蛋白胨进行诱导。
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原核表达存在的问题 翻译后的加工修饰 真核细胞的某些蛋白质翻译合成后，还 需要加工和修饰，如糖基化，但大肠杆菌 细胞无此功能。 细菌蛋白酶的存在 细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割
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短小芽孢杆菌表达蛋白质
• 例1：表达白细胞介素－2，表达产物无需 复性处理，即具有生物活性。产率达 50mg/L。 • 例2：表达人表皮生长因子（EGF），产率 达1g/L以上。 澳大利亚盛产羊毛，每年需要大批的剪羊 毛的技工，由于EGF可引起羊毛从根部自 行脱落，故每只羊注射5mgEGF，在1月后 可用手直接抓下羊毛。
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温度诱导
PL启动子 将工程菌先置于300Ｃ进行培养， 在此温度范围内，由大肠杆菌合成的CI 857阻遏蛋白与PL 的操纵子区域结合，关 闭外源基因的转录。当工程菌培养到合适 的生长阶段，（一般为对数生长中期）时， 迅速将培养温度提高到42 0Ｃ，此时CI 857 失活，从操纵子上脱落下来， PL启动子遂 启动外源基因转录。
，这一序列称为信号序列 。
常见的信号序列由10～40个氨基酸残基
组成，N端为带正电荷的氨基酸残基，中间为
疏水的核心区，而C端由小分子氨基酸残基组
成（加工区），可被信号肽酶识别并裂解。
•
信号假说：分泌型蛋白质的定向输送，就是
靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）
识别并特异结合，然后再通过SRP与膜上的对
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蛋白质合成后的靶向输送
•蛋白质的靶向输送(protein targeting)
蛋白质合成后需要经过复杂机制，定
向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部 位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。
• 信号序列(signal sequence) 所有靶向输送的蛋白质结构中存在分 选信号，主要为N末端特异氨基酸序列， 可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位
牛溶菌酶； 乙肝表面抗原； 链激酶； 人肿瘤坏死因子； 人表皮生长因子； 人组织纤溶酶原活化剂； 破伤风毒素片段C；
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乳酸克鲁维酵母 牛凝乳酶；人白细胞介素1β ； α －半乳糖苷酶 多型汉逊酵母 乙肝表面抗原 葡萄糖淀粉酶 α －半乳糖苷酶
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第三节 昆虫细胞表达系统
二.甲醇酵母表达体系
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1.甲醇酵母的生物学特点
• 甲醇酵母是一种甲基营养型酵母.在缺乏碳
源如葡萄糖\甘油时,能利用甲醇作为唯一的
碳源;生长温度28-30C。
如巴斯德毕赤酵母就是常用的表达系统。
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2.甲醇酵母表达系统的优点
• 具有强有力的乙醇氧化酶基因（AOX1）启 动子，可严格调控外源蛋白的表达 • 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行 翻译后的加工和修饰，从而表达出有生物 活性的外源蛋白 • 营养要求低，生长快，培养基廉价，便于 工业化生产 • 可高密度发酵培养.
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杆状病毒载体的构建
以pUC质粒为基础构建，提供Amp抗性；
多角体蛋白编码基因的启动子；
多克隆位点位于该启动子的下游；
家蚕丝心蛋白编码基因启动子：被认为是自
然界最强的启动子，但由其介导的外源基
因高效表达对宿主细胞的生理过程有干扰。
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二.昆虫细胞宿主 • 常用的宿主为sf9和sf21。 来源于草地夜蛾的卵巢细胞。
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家蚕表达系统
• 家蚕属于鳞翅目家蚕科，人类饲养家蚕已
有5000余年历史。我国是家蚕业的发祥地， 自古以来农桑并茂，丝绸之路名扬天下。 我国的生丝产量占世界总产量的70％，丝 绸业的年产值达700亿元。
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我国科学家于2003年率先完成家蚕基
因组框架图，覆盖率和精确度分别达到
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第四节 哺乳类细胞表达系统
优点：哺乳动物细胞可加工修饰表达的蛋白质，
包括二硫键的形成、糖基化、磷酸化、寡聚体
的形成、蛋白酶的定点切割产生具有天然活性
的蛋白质
缺点：细胞生长缓慢，培养周期长；
生产成本高；
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2．蛋白质切割
• 末端切割 膜蛋白、分泌蛋白：在氨基端具有一段信号 肽。信号肽必须切除多肽链才具有功能。 脊椎动物前胰岛素原长 105aa ，首先切除氨 基端的24aa，成为前体胰岛素 再将中间的一段切除，留下两端有活性的部 分，即21aa酸残基的A链和30aa的B链 两条链由两个二硫键连接成有生物活性的胰 岛素。
95.54和99.95，是我国科学家向人类社会 贡献的第三大基因组研究成果。
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• 家蚕的特点是丝素蛋白的高效表达。蚕丝
的主要成分是丝素蛋白。在家蚕的丝素蛋 白合成期，每个细胞每秒合成数万个丝素 分子。
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杆状病毒载体
• 杆状病毒是含有包膜的双链DNA病毒，宿 主为无脊椎动物。主要感染昆虫，包括鳞 翅目、膜翅目、鞘翅目、毛翅目等。 杆状病毒表达载体可分为两大类： 1.表达单个外源基因 2.表达多个外源基因
第七章
外源基因表达系统
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1
基因工程所用的宿主菌,皆经过人工改造
原因是
野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统, 会切割未经修饰的外源DNA.
经过改造的宿主菌一般具备下列特点 限制系统缺陷型:不切割外源DNA. 重组缺陷型 :避免外源DNA与宿主DNA的重组. 转化亲和型:改变细胞壁的通透性,提高转化效率.
接蛋白（DP， 即SRP受体）结合后→开放膜 蛋白通道→分泌性蛋白穿过膜→膜外侧面信 号肽酶切断信号肽加工区。
信号肽的一级结构
优点：
• • • • 酶解作用低 纯化方便 增进蛋白折叠 N-端的结构真实
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分泌表达形式的缺点：
相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋 白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很 难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源 基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比 包涵体方式低很多。
外源基因极少表达。
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8
• 当重组大肠杆菌生长到某一阶段，向培养
物中加入乳糖或IPTG（异丙基硫代半乳糖
苷 isopropylthiogalactoside，IPTG),它
们特异性的与阻遏蛋白结合，使之从操纵
子上脱落下来，启动子打开并启动外源基 因转录。（化学诱导）
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• 表达量高，数百mg/L以上水平
• 表达的蛋白既可存在于细胞，又可分泌到 胞外。由于甲醇酵母自身分泌的蛋白（背 景蛋白）非常少，十分有利于纯化。
• 糖基化程度低。
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多型汉逊酵母表达系统
• 已用于表达乙肝表面抗原
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3.应用举例
毕赤酵母
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化学诱导与温度诱导在实验室 规模比较容易做到，（发酵罐1～5
升）。但在工业化生产时（发酵罐
数十升～数百升乃至数千升），生
产成本很高。
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