维甲酸定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化
全反式维甲酸对小鼠胚胎不同阶段神经干细胞诱导作用研究
文章 编 号 ： ０ ０ ３ ７ ２ １ ） ２ １ Ｏ ４ １ ０ —２ ６ （ ０ ０ ０ 一Ｏ ４ —Ｏ
全 反式 维 甲酸对 小 鼠胚 胎 不 同阶段 神 经 干 细胞诱 导作 用 研 究
李延 兰 刘 慧娟 。 丰 慧根 ， ， ．
（ ． 乡 医 学 院 生命 科 学 技 术 系 ， １新 河南 新 乡 ４ ３ ０ ；． 东 大 学 医 学 院组 织胚 胎 学 教 研 室 ， ５０ ３ ２ 山 济南 ２ ０ １ ） ５０ ２
成 神 经 元 的 效 应 ， 对 胚 胎 不 同 阶 段神 经干 细 胞 的诱 导 作 用 有 所不 同． 并
关键 词 ： 全反式维 甲酸 ； 神经干细胞 ； 神经元 ； 分化
中图分类 号 ： ８３ Ｑ １
文 献标 志码 ： Ａ
近年来 ， 随着对神 经干细 胞研究 的深 入 ， 在神经 系统 疾病 中替 代 治疗 的应 用 前 景越 来越 受 到重 视． 其 哺 乳 动物脑 内的神 经干 细胞具 有多 向分化 和 自我 更 新 的能 力［ ２， ｉ ］ 在合 适 的 条件 下 ， 在体 外大 量 增殖 ， 代 － 可 替 治 疗需要 神经 干细胞 定 向分 化成 特定 的 目的细 胞． 由于神经 干细胞 定 向分化调 控具有 广 阔的应用 前景 ， 以 所 为 国 内外神 经科 学界所 瞩 目． 目前仍 面临很多技 术 障碍 ， 中如何 提高 ＮＳ ｓ 向分 化率是 此项 治疗 技 术 但 其 Ｃ 定 必 须解决 的关键 问题 之一． 经干 细胞 向神 经元 分化还 是 向神 经胶 质 细胞 分化 受各 种 内外 因素 复杂 的调 控 神 作用， 主要 包括 内在 因素 （ 控 因子 ） 调 和外 在 因素（ 细胞 因子 、 环境 ） 研 究发现 ， 微 ． 在体 内 ， 着时 间的推移 ， 随 神 经 干细胞对 刺激 因子 的反应 会变化 ， 这种 变化将 影响神 经 干细 胞 分化 为神 经元 的数量 ． 就是 说 ， 也 由于神 经 干 细胞所处 的阶段 不 同 ， 产生 不 同的 内在 的分化 程序 ， 在相 同环 境 中 的定 向分化 效果 也 是 不 同的． 全反 式 维 甲酸 （ｌｔａ ｓ ｅｉｏｃａｉ， ａｌ ｒｎ－ ｔ ｉ ｃ ＡＴＲ 以下简称 维 甲酸 ， — ｒ ｎ — ｄ Ａ） 是一 种作 用很 强 的分化 诱 导剂 ＿ ， 调控 多 种组 织 和 ３在 ］
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景
群， 首次成功分离 出人胚胎干细胞系。同年 ，ｈ ｍ ｂｏ 等 Ｓａ ｌｔ 以 ｔ
Ｓ Ｏ作为饲养层首次建立 了人胚胎生殖细胞 ￣ Ｇ ） Ｔ Ｅ Ｃ系。一般 情 况下 ．可将 胚胎干细胞 和胚胎生殖 细胞统 称为胚 胎干细
ｉｇｐｏｅ ， Ｒ Ｂ ） ｎ ｒｔｉ Ｃ Ａ Ｐ形成 复合物 ， ｎ 然后 复合物进 入细胞 核 内 ，
有 ｐ 磷酸甘油 、 一 维生素 ｃｖ ）地塞米松 、 （ｃ 、 维生素 Ｋ （Ｋ ） ３Ｖ ３以 及 ２ ５ 羟基维 生素 Ｄ ，－ ３等化学试剂 ．也 能诱 导 Ｅ ｓ细胞 定向 分化为特定类型细胞 。 １ 细胞 因子诱导法 ． ２ Ｅ Ｓ细胞在培养 过程 中对许多细胞 因子具 有很强 的依赖 性 。增加或撤销一种或几种细胞因子可影响 Ｅ Ｓ细胞 的增 殖
无限增殖、 自我更新和 多向分化 的特性。理论上可以诱导分化 为机体 中 ２ ０多种细胞 ， ０ 可作为细胞移植 、 组织替代， 甚至器官克 隆的细胞供体 ， 为将来治疗人类诸 多难治性疾病提供 细胞来 源。本文 简述 了胚胎 干细胞的诱导分化 方法、 定向分化 的一些 细胞
种 类 以及 应 用前 景 。
最常用的诱导方法一般包括 以下 四种 ：化学试剂诱 导法 、 细 胞因子诱导法 、 培养诱导法 以及转基因诱导法等 。 共
１１ 化学试剂诱导法 ．
发育等生理过程 。 实验证 明 Ｆ Ｆ ２处理 Ｅ 有 Ｇ一 ｓ细胞后 ， 致使核
内 ２种转录因子 （ ｋ ２ 、－ ｎ ） 达增 强 ， Ｎ ｘ ． ｄ Ｈａｄ 表 ５ 促进 Ｅ 细胞 向 ｓ
Ｓ ｉｎ ｅ＆ Ｔｅ ｈ ｏｏ ｙＶｉ ｏ ｃｅ ｃ ｃ ｎ ｌｇ ｓ ｎ ｉ
２１ ０２年 ８月第 ２ 期 ３
科 技 视 界
干细胞定向分化的实验技巧
干细胞定向分化的实验技巧干细胞是具有自我更新和分化为多种细胞类型潜能的细胞群体。
干细胞定向分化是指将未分化的干细胞诱导分化为特定细胞类型的过程。
这项技术在医学研究和临床应用中具有巨大的潜力，可以用于组织工程、再生医学和疾病治疗等领域。
在干细胞定向分化的实验中，一些关键的技巧和方法是必不可少的。
本文将介绍一些常用的干细胞定向分化实验技巧。
1. 干细胞培养和扩增在进行干细胞定向分化实验之前，首先需要培养和扩增干细胞。
常用的干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞（iPS细胞）。
在培养过程中，需要提供适当的培养基和生长因子来维持干细胞的自我更新和增殖能力。
在扩增时要注意细胞的密度控制，以避免细胞在过度拥挤的环境中产生自发分化。
2. 诱导分化因子的选择和优化干细胞定向分化的关键是选择合适的诱导分化因子。
对于每种分化类型，诱导因子的选择和浓度需要进行优化。
通常，这些诱导因子可以是细胞因子、转录因子或化学物质。
例如，要将干细胞定向分化为神经细胞，可以添加神经生长因子等相关因子。
在优化过程中，可以通过调整因子的浓度、处理时间和培养条件来实现更有效的定向分化。
3. 细胞外基质的使用细胞外基质（ECM）是一种提供细胞黏附和信号传导的支持物质。
在干细胞定向分化实验中，使用细胞外基质可以模拟体内的微环境，促进特定细胞类型的定向分化。
常用的细胞外基质包括胶原蛋白、纤维蛋白和海藻酸。
选择合适的细胞外基质可以提高定向分化的效率和特异性。
4. 流式细胞术分析流式细胞术是一种常用的细胞分析方法，可以用来检测和分离不同细胞类型。
在干细胞定向分化实验中，可以利用流式细胞术来检测和定量特定细胞表面标记物的表达。
通过标记特定蛋白或分子，可以确定定向分化的效率和细胞类型的纯度。
流式细胞术还可以用于分离和纯化特定细胞群体，以进一步进行后续实验。
5. 功能性分析在干细胞定向分化实验中，除了表面标记物的表达外，还需要进行功能性分析来验证定向分化的效果。
胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展
胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展
刘革修;张洹
【期刊名称】《第二军医大学学报》
【年(卷),期】2003(24)5
【摘要】最近研究表明胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)在体内外均可以发育分化出神经组织细胞,这对于了解神经发育的机制和研究神经组织退化性或者脑组织损伤性疾病的治疗具有重要的意义。
本文就胚胎干细胞定向分化为神经组织细胞及其基因表达特点作一综述。
【总页数】4页(P514-517)
【关键词】胚胎干细胞;定向分化;神经细胞;研究进展
【作者】刘革修;张洹
【作者单位】暨南大学医学院血液病研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R329.2;Q813
【相关文献】
1.全反式维甲酸诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的研究进展 [J], 陈盛;何念海
2.胚胎干细胞定向诱导分化为神经细胞的方法研究进展 [J], 陈海萍;黄晓琳;陈红
3.胚胎干细胞体外定向诱导分化为神经细胞的方法 [J], 尹华伟;郑国栋;闫家阁
4.淫羊藿素诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为神经细胞 [J], 朱丹雁;张翔南;杜悦;
陈燕;王志强;楼宜嘉
5.小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展 [J], 陆建峰;宋后燕
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胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展
胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展（姓名：李翔单位：宁夏师范学院化学与化学工程学院11级科学教育班）摘要：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞,具有多向分化潜能和自我更新的特性。
胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞,可为细胞移植提供无免疫原性的材料,为难以治愈的疾病的细胞移植治疗提供可能。
本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用。
关键词：胚胎干细胞;定向诱导分化;分化潜能;自我更新胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从早期胚胎(桑椹胚、囊胚)或原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。
ES细胞具有多向分化潜能,可分化形成外胚层、中胚层和内胚层细胞的谱系干细胞,再成长为不同的神经、造血、肌肉,骨骼等各种细胞基于其特性,目前普遍认为,ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育,基因表达调控,药物的筛选和致畸实验及作为组织细胞移植治疗,克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。
1998年,T homson和Gearhart2个研究组分别从人ICM和PGCS建立了人类ES细胞系,在国际上引起了轰动。
Science杂志将人类ES细胞研究成果评为1999年世界十大科技进展之首,美国《时代》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首,并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域,由此掀起了ES细胞研究的高潮。
1体外诱导ES细胞的原理在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。
在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。
从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异。
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元
小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。
方法将小鼠胚胎干细胞以“无血清”方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。
结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。
结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。
[Abstract] ObjectiveTo investigate the possibilities of in vitro culture and differentiation of mouse embryonic stem cell to GABAergic neurons. MethodsMouse embryonic stem cells were cultured and induced into GABAergic neurons in serum-free cultural condition. Immunofluorescence,reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and flow cytometer assay were used to identify the properties of the differentiated cells. ResultsIn the later period of differentiation of embryonic stem cells into neurons,immunofluorescence showed that GABAergic neurons existed,RT-PCR results confirmed the important regulatory genes Viaat,Gad1 and Gad2 gene expression due to the correct differentiation of GABAergic neurons and flow cytometry analysis showed the GABA-positive cells accounted for about(11.49±6.86)% of the total cell number. ConclusionMouse embryonic stem cells can be induced into GABAergic neurons in vitro in serum-free cultural condition,providing a new source of nerve graft.[Key words]Embryonic stem cell; Induce; Differentiate; GABA干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究方兴未艾,且取得了一定成果,但由于其多取材于胚脑的神经干细胞,为日后临床应用埋下了伦理道德问题之患,并且受到供体来源短缺的限制[1]。
干细胞的分化与定向诱导技巧
干细胞的分化与定向诱导技巧干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的一类基础细胞。
在医学领域，干细胞具有广阔的应用前景，可以用于组织重建、疾病治疗以及新药研发等方面。
干细胞的分化与定向诱导是实现这些应用的关键步骤，本文将介绍干细胞分化的基本原理和常用的定向诱导技巧。
干细胞分化的基本原理是指通过调控细胞内外环境来引导干细胞向特定细胞类型分化的过程。
在自发分化过程中，干细胞通过自身的遗传调控和信号传导路径来实现分化。
而定向诱导技巧则是通过外部介入，利用特定的因子和技术手段来控制干细胞的分化方向，使其转变为目标细胞类型。
在干细胞分化的过程中，存在内源性和外源性两种分化信号。
内源性信号是指体内存在的调控因子，如基因表达调控和细胞信号通路等。
外源性信号则是指通过外部途径引入的调控因子，如特定细胞因子和生化材料等。
这些信号可以单独或联合作用，通过激活或抑制细胞内特定信号通路，从而实现干细胞向特定细胞类型的转变。
定向诱导技巧主要包括生化诱导和物理诱导两种方法。
生化诱导是利用生物化学因子来诱导干细胞的分化。
常见的生化诱导因子包括生长因子、转录因子和化学物质。
生长因子可以通过激活特定信号通路促进细胞增殖和分化，转录因子则可以通过与DNA结合来控制基因表达，进而诱导细胞分化。
化学物质则可以改变细胞内的环境，如酶抑制剂和分化诱导剂等。
生化诱导的优势在于可以精确地调控分化的时间和程度，但其不足之处在于需要优化诱导因子的浓度和时间，以及需要解决因子稳定性和细胞毒性等问题。
物理诱导是利用物理力学原理来诱导干细胞的分化。
常见的物理诱导方法包括微环境模拟和力学刺激。
微环境模拟是通过模拟细胞自然生长环境，如细胞外基质、细胞间隙和培养基等，来提供合适的生长条件和机械性刺激，从而引导干细胞的分化。
力学刺激是通过应用机械压力、牵拉力或剪切力等来调节细胞内外环境，从而影响干细胞的分化。
物理诱导的优势在于可以模拟细胞自然生长环境，更好地保持细胞功能和生化特性，但其不足之处在于需要优化刺激力的强度和时间，以及需要解决刺激对细胞的毒性和特异性等问题。
《2024年小鼠新型胚胎干细胞系的建立》范文
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESC）的研究一直是生物学和医学领域的重要课题。
这些细胞具有自我更新和多潜能的特性，为再生医学、疾病模型、药物筛选等多个领域提供了巨大的研究潜力。
近年来，随着对小鼠胚胎干细胞研究的深入，新型小鼠胚胎干细胞系的建立显得尤为重要。
本文旨在详细介绍小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程、方法和应用前景。
二、材料与方法1. 材料准备（1）实验动物：选择合适的小鼠品系作为供体，确保其遗传背景清晰。
（2）实验试剂：包括培养基、生长因子、抗生素等。
（3）实验设备：显微镜、培养箱、离心机等。
2. 方法（1）胚胎获取：从小鼠中获得早期胚胎。
（2）胚胎培养：将胚胎置于特定培养基中，加入生长因子，进行体外培养。
（3）干细胞诱导：通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
（4）干细胞系建立：经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
三、实验过程与结果1. 胚胎获取与培养通过超数排卵和人工授精等方法，从小鼠中获得早期胚胎。
将胚胎置于含有适当营养成分和生长因子的培养基中，置于适宜温度和湿度的培养箱中培养。
2. 干细胞诱导与分化通过特定方法诱导胚胎内细胞团向胚胎干细胞方向分化。
这一过程需要严格控制培养条件和时间，以确保干细胞的成功诱导和分化。
3. 干细胞系的建立与鉴定经过筛选和扩增，建立稳定的小鼠胚胎干细胞系。
通过细胞形态观察、生长曲线绘制、基因表达分析等方法，对干细胞系进行鉴定和评估。
四、讨论与分析1. 小鼠新型胚胎干细胞系的特点与优势新型小鼠胚胎干细胞系具有较高的分化潜能、稳定的遗传背景和良好的扩增能力等特点。
与以往的小鼠胚胎干细胞系相比，新型干细胞系在研究过程中具有更高的可靠性和实用性。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的应用前景（1）再生医学：小鼠新型胚胎干细胞系可用于研究细胞分化和组织再生，为再生医学提供新的治疗策略。
（2）疾病模型：通过基因编辑技术，可以构建特定疾病的小鼠模型，为疾病研究和药物筛选提供有力工具。
猪诱导多能干细胞可定向分化为前脑GABA能神经元前体
doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2021.06.03
J South Med Univ, 2021, 41(6): 820-827
猪诱导多能干细胞可定向分化为前脑 GABA 能神经元前体
朱 缓 1，孙婷婷 2，王圆圆 2，王 铁 2，马彩云 2，王春景 2，刘长青 2，郭 俣 1 蚌埠医学院 1检验医学院，2生命科学学院，安徽 蚌埠 233000
摘A 能神经元前体的方法体系。方法 猪 iPSCs 诱导分化为 GABA 能神经元前体遵循两个阶段，第 1 阶段，猪 iPSCs 悬浮培养，第 3 天时形成类胚体，采用神经诱导培养基 NIM（SB431542、 DMH1、FGF2）继续诱导，第 12 天分化为原始神经上皮细胞。第 2 阶段，使用含 Pur、B27 的 NIM 培养基悬浮培养形成神经球，至 第 21 天时形成 GABA 能神经元前体。CM-DiI 标记后，定向移植帕金森（PD）模型大鼠黑质纹状体，检测其在宿主脑内存活、迁 移及分化状况。结果 猪 iPSCs 在饲养层细胞上稳定传代，表达多能性标记 OCT4、Nanog、SSEA1 和 TRA-160，并且核型分析显 示没有其他物种来源细胞污染。第 12 天经诱导分化获得原始神经上皮细胞能够形成玫瑰花环结构，并表达其表面标记物 （PAX6、SOX2 和 Nestin）与神经微管蛋白标志物 Tuj1。第 21 天诱导细胞高表达 GABA 能神经元前体的表面特异性抗原 NKX2.1 和前脑标志物 FOXG1。移植 8 周后，体内可分化为 GABA 能神经元与多巴胺能神经元，明显改善 PD 大鼠运动行为。 结论 结合无血清培养基筛选法逐步定向诱导猪 iPSCs 高效分化为前脑 GABA 能神经元前体，移植后能够显著改善 PD 大鼠的 运动功能障碍，为诱导 GABA 能神经元前体移植治疗神经损伤疾病奠定基础。 关键词：诱导多能干细胞，猪；细胞分化；原始神经上皮细胞；GABA 能神经元前体；帕金森模型大鼠
名词解释之发育生物学
克隆：将体细胞核移植到去核卵细胞中，通过细胞培养，胚胎移植等技术培养新个体细胞工程：是用人工方法对细胞成分进行加减和更替而获得所需的功能细胞顶体反应：是精卵接触时，精子受卵周的胶膜或透明带诱导发生顶体胞吐，释放蛋白水解酶的过程。
胚泡（囊胚）：第四天桑葚胚继续增加，卵裂球达100个左右，细胞间出现腔隙，腔内充满液体，胚呈囊泡状。
胚胎诱导：在胚胎发育中，一部分细胞对其邻近的另一部分细胞产生影响，并决定其分化方向的作用。
定向分化：诱导胚胎干细胞定向分化为某种特殊类型的细胞内细胞群：是在胚泡腔一端的大约由30个细胞组成的细胞群次级神经：指外胚层细胞下陷进入胚层形成实心细胞索，接着再产生空洞形成神经管。
图式形成：胚胎细胞形成不同组织、器官、构成有序空间结构的过程透明带：在初级卵泡早期，卵母细胞和卵泡细胞之间出现一层含糖蛋白的嗜酸性膜。
1、多细胞个体发育的两大功能：一是产生细胞多样性并使各种细胞在本世代有机体中有严格的时空特异性；二是保证世代交替和生命的连续。
2、脊椎动物的精子发生在曲精小管中进行；减数分裂完成时，细胞质分裂是不完全的，形成生精皮（合胞体）3.原肠作用的细胞迁移的主要方式有外包，内陷，内卷，分层，内移和集中延伸。
4．初级神经胚形成是由脊索中胚层诱导上面覆盖的外胚层细胞分裂，内陷并与表皮质脱离形成中空的神经管。
5、人的胚胎发育过程中，后端神经管区域在27天时如不能合拢，则产生脊髓裂；若前端神经管区域不能合成，则胚儿前脑发育被停止，产生致死的无脑畸形，这些神经管闭合缺陷症约50%可由孕妇补充叶酸加以避免。
6、血管形成的两个过程包括由血岛形成血管；血管的出芽生长。
7、胚胎诱导的感受性特性有时间特异性、区域特异性、种间特异性、受遗传控制。
8．雌性哺乳动物的生殖道由缪勒氏管的分化而来，发育为输卵管、子宫、子宫颈和上阴道，而乌氏夫氏管退化。
9、果蝇的性别是通过X/A的比率来决定的，分母为常染色体数，分子为 X 染色体数。
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用
［， ７ 黄金明， 熊
杰， 柳尧波， ２０ ． Ｍ 等． ０５ Ｌ Ｐ法鉴定奶牛早期胚胎 Ａ
性别 的效果研究 ． 家畜生态学报 ， （ ） ２ 一 ２ ２ １ ： ２ ６ Ｏ
［］ ８ 岳志芹 ， 梁成珠 ， 吕 朋 ， ２０ ． Ｍ 技术及其在水生动物 等． ０６ Ｌ Ｐ Ａ
疫病诊 断中的应用．检验检疫学 ， （ ）７ ７ ◇ １ ５： ６ ０－ ４
胞和胚 胎生殖 细胞。一般将 两者 统称 为胚 胎干 细胞 。 胚胎 干细胞具 有 多 向分化 潜能 和 自我更 新 的特性 ， 可 以分化形成人 和动 物个体 各种类 型 的细胞 ， 至 分化 甚
断方法 ， 在未来或许可 以成 为可替代 Ｐ Ｒ的基 因扩增 Ｃ 技术 ， 广泛应用 于医疗 、 品、 食 环境 、 农牧业 等适合 开展
（２） Ｅ ３ １ ：６
验设计 的要求 非常高 ， 需要设计 的引物 比一般 的 Ｐ Ｒ Ｃ 要多且 结构复 杂 ， 还要 考虑靶序 列片段 以及茎 一环 结 构等因素 ， 在检测高度变异的病原体时 ， 实验设 计上 比 较困难 ； Ｌ ＭＰ扩增 的靶序列 长度需要控 制在 ３０ ｐ ② Ａ ０ ｂ 以下【 ③ 由于 Ｌ ＭＰ法 有很 高 的灵 敏 性 和特 异性 ， 副； Ａ 因此 在实验过程 中很 容 易受 到其他 Ｄ Ａ 的污染 出现 Ｎ 假 阳性 ； Ｌ ＭＰ的扩增产 物不能够 用于 测序 、 隆和 ④ Ａ 克 表达 。（ Ｌ ＭＰ技术不 能在一次反应 中同时检测 两个 ￣ Ａ ） 或多个 病原 体 ， 这也是无 法同 Ｐ Ｒ相媲美 的。 Ｃ
细胞分化为红 系造血 细胞 、 大细胞 和粒 细胞 ， 白细 肥 而
胞介素 一６ Ｉ （Ｌ一６ 可使胚胎干细胞 向红系造 血细胞 分 ）
押新高考卷 细胞工程(含解析)-备战2024年高考生物临考题号押题(新高考通用)(1)
备战2024年高考生物临考题号押题（新高考通用）押单项选择题细胞工程考向01 植物细胞工程1.（2024·浙江·高考真题）山药在生长过程中易受病毒侵害导致品质和产量下降。
采用组织培养技术得到脱毒苗，可恢复其原有的优质高产特性，流程如图。
下列操作不可行的是（ ）外植体→愈伤组织→丛生芽→试管苗 A ．选择芽尖作为外植体可减少病毒感染一、植物组织培养技术1.细胞工程的概念2.植物组织培养技术(1)过程(如菊花的组织培养)培养基须保持适当的温度、(2)植物激素在植物组织培养中的作用3.植物细胞的全能性生长素/细胞分裂素植物组织的发育方向高有利于根的分化，抑制芽的形成 低有利于芽的分化，抑制根的形成 适中促进愈伤组织的形成简记为：“高”根，“低”芽，“中”愈伤栽培稻甲产量高、品质好，野生稻乙种植一次可连续收获多年，提醒①光照：在愈伤组织诱导阶段，对有些植物来说，避光培养有利于细胞脱分化形成愈伤组织。
当愈伤组织再分化出芽和叶时，一定要有光照，有利于叶片内叶绿素的合成。
②植物组织培养中所需的碳源一般为蔗糖，原因是蔗糖既可提供充足的碳源，又可维持相对适中的渗透压。
二、植物体细胞杂交技术及植物细胞工程的应用1.植物体细胞杂交技术无性生殖(1)概念与原理(2)过程其中之一是将秸秆碎化后作为食用菌的栽培基质。
(3)意义在打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种等方面展示出独特的优势2.植物细胞工程的应用(1)植物繁殖的新途径①快速繁殖：高效、快速地实现种苗的大量繁殖，保持优良品种的遗传特性。
②作物脱毒：利用植物顶端分生区附近(如茎尖)进行组织培养获得脱毒苗。
(2)作物新品种的培育(3)细胞产物的工厂化生产①次生代谢物次生代谢不是生物生长所必需的，一般在项目单倍体育种突变体的利用原理染色体变异和植物细胞的全能性突变和植物细胞的全能性优点明显缩短育种年限产生突变，大幅度改良某些性状过程杂交→花药离体培养→单倍体植株―――――→人工诱导染色体加倍纯合二倍体植株(以二倍体为例)成胚状体等结构C．提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根D．用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异11．（2021·福建·高考真题）科研人员利用植物体细胞杂交技术培育矮牵牛新品种，技术流程示意图如下。
高中生物高频考点及答案36 细胞工程
考点规范练36细胞工程一、选择题1.为解决大面积烧伤患者的植皮难题,科学家研制出了人造皮肤,研制过程中需要将人的皮肤细胞置于培养瓶中进行培养。
配制培养基时除加入必需的已知成分外,还必须加入天然成分,细胞方可正常生长和增殖。
下列叙述正确的是()A.在动物细胞培养液中加入抗生素,就可以为细胞培养提供无菌条件B.细胞培养过程中只需不断通入O2,就能保证细胞正常生命活动C.加入的天然成分是血清,用来补充细胞生长和增殖所需的物质D.经培养可得到由多层细胞构成的人造皮肤,能直接用于移植2.下图表示四倍体兰花叶片植物组织培养的过程。
下列相关叙述错误的是()四倍体兰花叶片愈伤组织芽、根等兰花植株A.通过消毒和无菌操作避免①②过程发生杂菌污染B.此兰花的花药经离体培养所得的植株为二倍体C.细胞全能性表达的前提是①过程,体现在②③过程D.需生长调节物质调控①②过程细胞的分裂和分化3.(不定项选择题)下列关于动物细胞工程和胚胎工程的叙述,错误的是()A.乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养B.细胞核移植在同种动物、同种组织的细胞之间进行C.采用胚胎分割技术产生同卵多胚的数量是有限的D.培养早期胚胎的培养液中含维生素、激素等多种能源物质4.(不定项选择题)下图表示改造哺乳动物遗传特性的3种途径。
下列相关叙述错误的是()A.获得动物1的受体细胞通常是受精卵B.动物2体内各体细胞的基因种类相同C.获得动物3的重构胚不具有全能性D.上述动物的获得均需运用胚胎移植技术二、非选择题5.我国菊花主要有杭菊、怀菊、贡菊等品种,是药食兼优的代表性植物。
研究发现,杭菊具有明显的抗炎作用,怀菊具有良好的抗病毒作用(但是抗炎作用很弱)。
回答下列问题。
(1)欲培育兼有明显抗炎、抗病毒疗效的菊花新品种,用杭菊和怀菊杂交的方法是做不到的,原因是。
(2)基因工程方法为培育上述新品种提供了可能性,在实施基因工程过程中,最关键的步骤是。
受体细胞的选择直接关系到实验的成功与否以及新生植株的品质,我们一般选取未开花的幼枝的芽尖,理由有、。
胚胎干细胞的分化研究
的是 全 反式 维 甲酸 （ ｄ ）酷 细 胞 同时 或 先 后 分 化 出 不 同娄 Ａ ． 型的 细 胞 。这 反映 丁 酷 细 胞不 受 约 束 的 自我 无 序 发 育 ． 实际 应用 意 义不 大 。 目前 主 要 是 从 培 养 方 式 的 改 进 、 化诱 导 剂 分 的选 择 和针 对不 周 的终 末 靶 细胞 方 面 着 手 ． 究 酷 细 胞 的 定 研 向分 化 。
１ ２ １ 分 化 诱 导
胚胎干 细胞（ ｂ ｊ 哪］ 咖 ｃ 卧 ｃｌ， Ｓ细胞） 由哺乳 动物 ｅ Ｅ ｓ ｌ 是 早期肛胎分离克隆 的一 类未分 化二倍体 细 胞， 具有 自我 更新 和全 能分 化 的 潜 能。 由着 床 前 囊 胚 搠 内 细 胞 团 （ｎｅ ｅ ｉ ｒｃｌ ｎ ｌ ｒａ ， ＇和早期胚胎原始生殖 嵴的胚 胎生殖 细胞（ 椰 ｉ ｎｓ １ １ ｓ ０， ） 刚 ｃ 罾 ｌ．Ｇ ） ｍ ｃ ｌ Ｂ 均可 建立 肛胎 干细 胞 系。 自 ｌ８ 年 英 国科 ｅｓ ９１ 学家 Ｅ ａ 从小鼠囊胚期的 Ｉ ｖｍ Ｏｄ首先建 成 Ｅ Ｓ细胞 系后． 们 人 叉分别从 Ｉ Ｏｄ或 晦 分 离 克 隆 了包 括 猪 牛 、 、 羊 、 免 绵 山 羊、 水貂 、 鼠及恒 河碾 等在 内的各 种哺乳类 动物 和 ＾的 Ｅ 仓 Ｓ 细胞 系 ｑ］ ｓ 胞在 适宜条 件 下保持 未分 化状 态并 能无 。Ｅ 细 限扩 增， 为应 用研究 提供 无限的 细胞来源 。Ｅ 可 ｓ细胞在遗传 上具 可操 作性． 即导入 异源基 因 、 报告 基 因或 标志基 因、 诱导
维甲酸诱导小鼠胚胎干细胞向神经样干细胞分化
【 要】 目 摘 的 探讨维甲酸（ Ａ 诱导体外培养的小鼠胚胎干细胞（Ｓ ） Ｒ ） Ｅ Ｃ 向神经样干细胞定向分化。方法
在无 白血病抑制因子（ Ｉ） Ｌ Ｆ 存在的条件下 ， 将体外培养的 Ｅ Ｃ悬浮培养 ４ ， Ｓ 天 形成 拟胚 体（ Ｂ ， Ｅ ）再经 Ｒ Ａ诱导 ４天后 进 行 细 胞 冰 冻 切 片 ， 免 疫 细胞 化 学 染 色计 数 生 殖特 异 性 基 因 Ｏ ｔ 行 ｃ ４和 神经 干细 胞 特 异 性 标 志 物 Ｎ ｓｉ 表 达 百 分 一 ｅｔ ｎ的 率 。 结果 经诱 导 的 Ｅ Ｃ呈 现 Ｏ ｔ Ｓ ｃ ４阳性 细 胞 百 分 率 为 ６ ． ４ ， Ｎｅｔ 一 ７ ３ 而 ｓｎ阳性 细胞 百 分 率 为 ３ ． ２ 。结 论 体 ｉ ６ ５ 外培养 的小 鼠 Ｅ Ｃ经 Ｒ Ｓ Ａ诱导后有部分细胞定向诱导分化为神经样干细胞 。
・
２ ・ ４
ＳＣ ＵＡ Ｏ ＲＮ Ｌ Ｏ Ａ ＯＭＹ Ｖ Ｌ ６ Ｎ ４ ２０ Ｉ Ｈ ＮＪ Ｕ Ａ ＦＡＮ Ｔ Ｏ ．１ Ｏ． ０ ８
论著
维 甲酸 诱 导 小 鼠胚 胎 干 细 胞 向神 经 样 干 细 胞 分 化
杨 慧娟 ，黄桂琴 ，李琴 ，王延 华
（ 明 医学 院神 经科 学研 究 所 ，云 南 昆 明 ６０ ３ ） 昆 ５ ０ １
［ ｅＷｏｄ ］ Ｒ ｔ ｏｃａｉ；Ｅ ｙｏ ｉ ｓｅ ｃ ｌ ；Ｎ ｕｏ ａ ｓｅ ｃｌ ；Ｉ Ｋ ｙ ｒｓ ｅｉ ｉ ｃ ｎ ｄ ｍｂ ｒｎｃ ｔ ｍ ｅｌ ｓ ｅ ｒｎ ｌ ｔｍ ｅｌ ｍｍｕ ｏｙｏ ｈ ｍｉ ｒ ； ｓ ｎ ｃｔｃ ｅ ｓ ｙ ｔ
Ｏｃ 一 ｔ４： Ｎｅ ｔｎ ｓｉ
【 关键词】 维甲酸； 胚胎干细胞；神经样干细胞； 免疫细胞化学；Ｏ ｔ ；Ｎ ｓｎ ｃ４ ｅｉ ｔ 【 中图分 类号１ Ｒ ２ ． ３１ ５ 【 文献标 识码】 Ａ
人胚胎干细胞体外定向诱导分化胰岛细胞移植治疗非肥胖联合免疫缺陷糖尿病小鼠
人胚胎干细胞体外定向诱导分化胰岛细胞移植治疗非肥胖联合免疫缺陷糖尿病小鼠华秀峰;孙强;王延伟;丛晋;刘芙君;孟晓梅;李华峰;靳少华;王海燕;李建远【摘要】目的探讨人胚胎干细胞(hESs)体外定向诱导分化胰岛细胞移植治疗非肥胖联合免疫缺陷(NOD/SCID)糖尿病小鼠的可行性.方法体外分四阶段诱导hESs 定向分化为胰岛细胞:第一阶段,予以活化素A(activin A)、渥曼青霉素(wortmannin)诱导分化形成定型内胚层;第二阶段,予以全反式维甲酸(RA)、NOGGIN、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导胰腺细胞定向分化;第三阶段,予以表皮生长因子(EGF)扩增胰腺祖细胞;第四阶段,予以尼克酰胺(nicotinamide)、唾液素4(exendin-4)、bFGF及骨形成蛋白(BMP4)促进胰岛细胞成熟;观察诱导各阶段细胞形态变化、免疫荧光鉴定胰十二指肠同源异型盒基因(PDX-1)、胰高糖素、胰岛素、C肽、葡萄糖转运子2(Glut-2)的表达;四阶段分化成熟的胰岛细胞体外检测胰岛素释放反应并植入链脲菌素(STZ)诱导形成的NOD/SCID糖尿病小鼠一侧附睾脂肪垫内,观察血糖变化.结果诱导第四阶段14天时hESs出现胰高糖素荧光表达;20天时细胞出现PDX-1和C肽共表达;22天形成的成熟胰岛细胞出现Glut-2和胰岛素的阳性表达;流式鉴定胰岛素阳性细胞占17.1%,C肽阳性细胞占3.8%;体外检测有葡萄糖刺激的胰岛素释放反应.分化成熟胰岛细胞约(3~5)×106植入NOD/SCID糖尿病小鼠体内可以逆转其高血糖至少8周.结论体外定向诱导hESs 分化形成的胰岛细胞植入NOD/SCID糖尿病小鼠附睾脂肪垫内可以逆转其高血糖.%Objective To investigate whether pancreatic progenitors differentiated from human embryonic stem (hES) cells could correct hyperglycemia in non-obese diabetic(NOD)/severe combined immunodeficient(SCID) mice or not. Methods Pancreatic islets derived from hES cells line YT1 accordingto the optimized four-stage differentiation protocol in a chemical-defined culture system were observed. In the first stage.activin A and wortmannin were utilized to induce definitive endoderm formation. In the second stage, the differentiated endoderm cells were treated with all-trans retinoicacid(RA), NOGGIN and basic fibroblast growth factor(bFGF) to induce pancreatic specialization. In the third stage,pancreatic progenitors were induced by epidermal growth factor(EGF)-regulated expansion. Finally,in the fourth stage, a cocktail of factors was utilized to induce mature insulin-producing cells. The differentiated human pancreatic islet cells of (3-5) × 106 were then transplanted into one of the epididymal fat pads(EFP) of NOD/SCID mice. Graft survival and function were measured by blood glucose levels. Results The differentiated hES cells obtained by the four-stage approach comprised nearly 17. 1% insulin-positive cells and 3. 8% C-peptide positive as assayed by flow cytometry analysis, which released insulin/C-peptide in response to glucose stimuli in a manner comparableto that of adult human islets. Most of these insulin-producing cells co-expressed mature β cell-specific markers such as PDX1 , insulin , C-peptide and glucagon. After implantation into EFP of NOD/SCID mice, hES cell-derived pancreatic islets corrected hyperglycemia for an least eight weeks. Conclusion Human terminal differentiation pancreatic islet cells can correct hyperglycemia in NOD/SCID mice.【期刊名称】《临床荟萃》【年(卷),期】2013(028)006【总页数】6页(P650-654,封2)【关键词】胚胎干细胞;细胞分化;胰岛细胞;胰岛素;C肽【作者】华秀峰;孙强;王延伟;丛晋;刘芙君;孟晓梅;李华峰;靳少华;王海燕;李建远【作者单位】烟台毓璜顶医院内分泌科,山东省干细胞工程技术研究中心,山东,烟台,264000;解放军海军烟台医院,骨科,山东,烟台,264000;烟台毓璜顶医院中心实验室,山东省干细胞工程技术研究中心,山东,烟台,264000;解放军海军烟台医院,骨科,山东,烟台,264000;烟台毓璜顶医院中心实验室,山东省干细胞工程技术研究中心,山东,烟台,264000;烟台毓璜顶医院内分泌科,山东省干细胞工程技术研究中心,山东,烟台,264000;烟台毓璜顶医院内分泌科,山东省干细胞工程技术研究中心,山东,烟台,264000;烟台毓璜顶医院中心实验室,山东省干细胞工程技术研究中心,山东,烟台,264000;烟台毓璜顶医院中心实验室,山东省干细胞工程技术研究中心,山东,烟台,264000;烟台毓璜顶医院中心实验室,山东省干细胞工程技术研究中心,山东,烟台,264000【正文语种】中文【中图分类】R363流行病学调查显示,近年来我国糖尿病患病率逐渐升高。
移植维甲酸诱导的人胚神经干细胞在受损大鼠脊髓内的分化及作用
移植维甲酸诱导的人胚神经干细胞在受损大鼠脊髓内的分化及作用蒋震伟;惠国桢;许文辉;张建平;陆华;蒋云召;卞林;苗宗宁【期刊名称】《江苏医药》【年(卷),期】2004(30)5【摘要】目的将维甲酸(RA)诱导的人胚神经干细胞移植入受损的大鼠脊髓内,观察大鼠后肢运动功能的变化及细胞的分化情况.方法实验大鼠30只遭受脊髓中度损伤后7天作移植治疗,实验组分两组:一组移植经维甲酸诱导后的细胞,另一组移植未诱导的细胞;对照组注射等量PBS液.每周一次观察大鼠后肢运动情况,移植后4周,应用免疫组化技术检测移植细胞在大鼠脊髓内的生存和分化情况.结果实验组大鼠脊髓内见许多移植细胞存在,部分可分化出神经元样细胞,其后肢运动功能优于对照组.其中维甲酸诱导组能分化出神经元样细胞,其促进脊髓功能恢复的能力较另一组更强.结论维甲酸预处理的神经干细胞在体内能替代缺失的神经细胞,促进受损的脊髓功能恢复,在脊髓损伤的临床治疗中具有潜在的应用价值.【总页数】3页(P321-323)【作者】蒋震伟;惠国桢;许文辉;张建平;陆华;蒋云召;卞林;苗宗宁【作者单位】214200,宜兴市人民医院;苏州大学附属第一医院;214200,宜兴市人民医院;214200,宜兴市人民医院;无锡市第三人民医院;无锡市第三人民医院;苏州大学附属第一医院;无锡市第三人民医院【正文语种】中文【中图分类】R4【相关文献】1.人胚神经干细胞在大鼠脊髓内的分化研究 [J], 蒋震伟;许文辉;惠国祯;张建平;蒋云召;卞林2.大鼠脑损伤对移植人胚神经干细胞存活和分化的影响 [J], 张泽舜;万虹;历俊华;翟晶;韩富;王忠诚3.全反式维甲酸诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用 [J], 盛汉松;张弩;林逢春;周辉;林坚;尹波4.维甲酸诱导胚胎大鼠脑海马神经干细胞向神经元的分化 [J], 曹中伟;陈剑秋;曾倩;秦书俭5.褪黑素与全反式维甲酸共同作用对大鼠脊髓神经干细胞分化的影响 [J], 龚凯;罗卓荆;禹晓东;褚尤标因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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维甲酸定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化覃敏;黄林;李慕军;莫曾南【摘要】目的初步探讨体外条件下定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞分化为雄性生殖细胞的条件,建立有效诱导分化技术平台.方法分离BALB/c小鼠NT-ESCs样集落并鉴定.NT-ESCs消化后分4组:1)采用维甲酸诱导NT-EBs向雄性生殖细胞方向分化;2)未分化的NT-ESCs;3)分化培养前的NT-EBs;4)自主分化的NT-EBs;5)小鼠胚胎成纤维细胞.RT-PCR法检测各组Oct-4、VASA、Scp3、Sry、Tex14和β-actin的mRNA表达;免疫荧光染色法检测VASA、Scp3蛋白表达.结果 NT-ESCs 集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性.NT-EBs维甲酸诱导组Oct-4、VASA、Scp3、Sry、Tex14和β-actin均有表达,对照组为阴性;NT-EBs细胞诱导分化后Scp3荧光强度为(+);实验组VASA荧光强度(+)也优于对照组的(±).结论采用维甲酸诱导可促进核移植胚胎来源NT-ESCs分化为雄性生殖细胞.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2014(034)011【总页数】5页(P1458-1462)【关键词】核移植;胚胎干细胞;雄性生殖细胞;诱导分化【作者】覃敏;黄林;李慕军;莫曾南【作者单位】广西医科大学第一附属医院人类精子库,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院人类精子库,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院人类精子库,广西南宁530021【正文语种】中文【中图分类】R617男性不育症总发病率逐年升高，其中精子形态异常引起的不育或生殖力低下的占男方因素的30%～40%[1]。
目前，能有效治疗男性不育症的方法是辅助生殖技术，但对于内源性生殖细胞缺如无精子症或精子畸形综合征患者, ART或药物治疗无效[2]。
胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)可诱导分化为成体器官不同胚层的所有细胞, 因此诱导ESCs在体外分化为雄性生殖细胞，可以为生殖发生提供一个理想的平台[3]。
而结合胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术，可在体外培育出与患者遗传特征完全相同的核移植胚胎干细胞(nuclear transfer embryonic stem cells，NT-ESCs)，为男性不育提供种子细胞的新来源。
NT-ESCs理论上可分化为各个组织, 但男性生殖细胞分化的研究尚少[4- 5]。
本研究旨在探讨雄性生殖细胞定向诱导分化条件及分子生物学基础。
1.1 材料雌性C57BL/6小鼠25 g，雌性BALB/c小鼠25 g[上海斯莱克动物有限公司,许可证号：SCXK(沪)2003- 000]。
RA、LIF、H-DMEM、bFGF、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、丝裂霉素C等(Sigma公司)。
cleavage medium、blastocystmedium(Sage BioPharma公司)。
1.2 NT-ESCs的培养和鉴定构建核移植胚胎并检测其DNA来源[6]。
重构胚常规培养，挑取形态典型，未分化的NT-ESCs集落传代。
经形态学、碱性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、类胚体实验、体内分化方法鉴定。
1.3 NT-EBs细胞诱导分化培养3～4 d后的NT-EBs接种于铺有0.1%明胶的24孔板。
加入含2 μmol /LRA、1 000 U/mL LIF、20 ng/ mL 成纤维细胞生长因子、30 ng/mL 干细胞生长因子、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、0.1 mmol/L β巯基乙醇,2 mmol/ L谷氨酰胺的高糖DMEM培养液，诱导其向雄性生殖细胞分化，观察NT-EBs生长和形态变化。
设4组对照组:1)未分化的NT-ESCs；2)分化培养前的NT-EBs；3)无共培养、自主分化的NT-EBs；4)小鼠胚胎成纤维细胞。
1.4 RT-PCR法检测诱导后雄性生殖细胞发育相关基因的表达收集培养的NT-EBs提取总RNA反转录为cDNA。
引物序列及退火温度见表1。
PCR参数: 95 ℃预变性4 min, 94 ℃45 s, 55 ℃～67 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环,72 ℃10 min。
产物电泳，结果以目的基因/β-actin条带密度比值表示(n=6)。
1.5 间接免疫荧光染色法检测VASA、Scp3蛋白的表达共培养12 d后按间接免疫荧光法, 检测分化组和对照组NT-EBs的VASA、Scp3蛋白表达，显微镜下观察并照相。
判断标准：(-)无荧光；(±)极弱的可疑荧光；(+)荧光较弱，但清楚可见；(++)荧光明亮；(+++～++++)荧光闪亮。
1.6 统计学分析采用 SPSS 13.0软件分析, 数据以均数±标准差表示, 方差齐性后选择q检验。
2.1 NT-ESCs的鉴定NT-ESCs呈椭圆形或鸟巢状细胞集落，边缘清晰(图1)；AKP染色呈强阳性,集落呈深蓝色 (图2A)；细胞具有20对染色体核型的结构 (图2B)；NT-ESCs悬浮培养能形成简单的NT-EBs，较为致密，形态规则 (图2C)；体内注射NT-ESCs可形成畸胎瘤,肿瘤包含源自3个胚层分化的衍生物(图2,D,E,F)。
2.2 NT-EBs体外诱导的生长观察NT-EBs呈圆球状悬浮于ESCs培养液, 细胞透亮活性好, 大小比较均一，内部细胞致密, 边缘规则(图3A)。
分化培养第4天部分细胞由梭形或杆状变为圆锥形，培养7和12 d的细胞增殖能力强，大而圆形细胞增多(图3C,D)。
2.3 RT-PCR检测雄性生殖细胞标志物的表达诱导12 d后的NT-EBs能够表达雄性生殖细胞相关的特征基因(VASA、Scp3、Sry、Tex14)。
与未分化NT-ESCs(0.68±0.03)相比，诱导后Oct4的mRNA相对表达量为0.31±0.06，呈下调趋势; Vasa, Scp3和Sry mRNA相对表达量为: 1.03±0.08、0.95±0.07、1.03±0.06，明显上调 (Plt;0.05)。
在诱导前和自然分化的NT-EBs中几乎未能检测到Texl4的表达。
小鼠胚胎成纤维细胞均不表达上述相关基因 (图4)。
2.4 NT-EBs细胞VASA和Scp3蛋白的表达诱导后第12天即可见NT-EBs细胞表达VASA (+)和Scp3 (+)，细胞成簇分布，部分细胞呈现一字形排列；在自然分化对照组NT-EBs中, 未见Scp3阳性细胞，微弱表达VASA (±)(图5)。
多项研究提示，由ESCs获得精子的技术是可行的[5,7]，基于体细胞核移植技术与胚胎干细胞技术NT-ESCs向男性生殖细胞分化有可能同时解决移植物来源和免疫排斥这两大难题。
本实验构建成功的小鼠NT-ESCs符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性并具有多能性，这为进一步研究组织修复及再生提供了技术平台。
虽然ESCs已证实可诱导分化为雄性生殖细胞，但分化的效率非常低[8]。
既往研究大多采用微环境对ESCs进行体外诱导，能使细胞在三维空间结构中进行移动并且与微环境相互作用。
例如，用骨形态发生蛋白4BMP4、RA诱导[9- 10]，或将ESCs体外诱导为原始生殖细胞样细胞进而分化成雄性生殖细胞[11]。
目前使用最多的方法是采用EB的形式，其含有3个胚层的细胞类型，提供了三胚层细胞间的相互接触模型。
目前体外形成EB的微环境能够支持生殖细胞的发育，并能消除生殖细胞发育早期亲缘印迹[12]。
在本实验中我们模拟体内微环境，并经RA诱导增殖，研究了胚胎干细胞的诱导分化情况。
本实验检测了4种NT-ESCs和雄性生殖细胞发育相关基因, Oct4为NT-ESCs特异性基因；VASA、Scp3、Sry和Tex14这4个基因为生殖系统特异性表达基因，特别在精子发生中起着重要作用。
经诱导后，NT-ESCs的Oct4表达减弱，VASA、Scp3、Sry和Tex14基因逐渐开始表达，说明RA可促进NT-ESCs表达雄性生殖细胞发育相关基因。
同时, 诱导后的NT-ESCs表达雄性生殖细胞标志蛋白VASA和Scp3，与报道类似[13]。
以上结果提示RA可诱导NT-ESCs向雄性生殖细胞分化，NT-ESCs具备向中胚层细胞分化的潜能。
但是，本研究分化后的细胞虽表现出雄性生殖细胞的相关蛋白，仅仅是一种前祖细胞，而非一种特定的生殖细胞。
目前，NT-ESCs技术仍具有优势，核移植技术已可生成人类胚胎干细胞，这一成果具有里程碑意义[14]。
因此，进一步精确、规范、增殖和鉴定分化中所涉及到的重要蛋白质的生化性质，筛选出影响诱导分化的关键因素，对NT-ESCs的定向诱导分化不仅在理论上且在实践中均具有重要的现实意义。
【相关文献】[1] Moskovtsev SI, Mullen JB, Lecker I, et al. Frequency and severity of sperm DNA damage in patients with confirmed cases of male infertility of different aetiologies[J]. Reprod Biomed Online, 2010,20:759- 763.[2] Larson KL, de Jonge CJ, BarnesAM, et al. Sperm chromatin structure assay parametersas of failed pregnancy following assisted reproductive techniques[J].Hum R eprod,2000,15: 1717- 1722.[3] Fadel HE.Developments in stem cell research and therapeutic cloning: Islamic ethical positions, a review[J].Bioethics,2012,26:128- 135.[4] Jung EM, Son HY, Jeung MK, et al. Epigenetic signatures of somatic cell nuclear transfer-derived embryonic stem cells[J].nt J Mol Med,2011,28:697- 704.[5] Nayernia K, J Nolte, HW Michelmann, et al. 1n vitro differentiated embryonic stem cells give rise to male gametes that can generate offspring mice[J]. Dev Cell,2006,11:125- 132. [6] 覃敏，何敏，宣强，等. 近交系小鼠体细胞核移植囊胚的微卫星DNA鉴定[J]. 基础医学与临床,2009,29:924- 928.[7] Yu Z, Ji P, Cao J, et al. Dazl promotes germ cell differentiation from embryonic stem cells[J]. J Mol Cell Biol, 2009, 1: 93- 103.[8] Yamano N, Kimura T, Watanabe-Kushima S, et al. Metastable primordial germ cell-like state induced from mouse embryonic stem cells by AKT activation[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,392:311- 316.[9] Toyooka Y, Tsunekawa N, Akasu R, et al. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci,2003,100:11457- 11462.[10] Chen W, Jia W, Wang K, et al.Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,418:571- 577.[11] Greber B, Wu U, Bememann C，et al. Conserved and divergent roles of FUF signaling in mouse epiblast stem cells and human embryonic stem cells[J]. Cell Stem Ce11,2010,8: 215- 226.[12] Geijsen N, Horoschak M, Kim K, et al. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells[J]. Nature,2004,427:106- 107.[13] Celso Silva,Jennifer R. Wood, et al. Expression Profile of Male Germ Cell-Associated Genes in Mouse Embryonic Stem Cell Cultures Treated with All-Trans Retinoic Acid and Testosterone[J].Mol Reprod Dev,2009,76: 11- 21.[14] Tachibana M, Amato P, Sparman M, et al. Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer[J].Cell,2013,153:1228- 1238.。