维甲酸定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化

维甲酸定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化覃敏;黄林;李慕军;莫曾南

【摘要】目的初步探讨体外条件下定向诱导小鼠核移植胚胎干细胞分化为雄性生殖细胞的条件,建立有效诱导分化技术平台.方法分离BALB/c小鼠NT-ESCs样集落并鉴定.NT-ESCs消化后分4组:1)采用维甲酸诱导NT-EBs向雄性生殖细胞方向分化;2)未分化的NT-ESCs;3)分化培养前的NT-EBs;4)自主分化的NT-EBs;5)小鼠胚胎成纤维细胞.RT-PCR法检测各组Oct-4、VASA、Scp3、Sry、Tex14和β-actin的mRNA表达;免疫荧光染色法检测VASA、Scp3蛋白表达.结果 NT-ESCs 集落性生长,符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性.NT-EBs维甲酸诱导组Oct-4、VASA、Scp3、Sry、Tex14和β-actin均有表达,对照组为阴性;NT-EBs细胞诱导分化后Scp3荧光强度为(+);实验组VASA荧光强度(+)也优于对照组的(±).结论采用维甲酸诱导可促进核移植胚胎来源NT-ESCs分化为雄性生殖细胞.

【期刊名称】《基础医学与临床》

【年(卷),期】2014(034)011

【总页数】5页(P1458-1462)

【关键词】核移植;胚胎干细胞;雄性生殖细胞;诱导分化

【作者】覃敏;黄林;李慕军;莫曾南

【作者单位】广西医科大学第一附属医院人类精子库,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院人类精子库,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院人类精子库,广西南宁530021

【正文语种】中文

【中图分类】R617

男性不育症总发病率逐年升高，其中精子形态异常引起的不育或生殖力低下的占男方因素的30%～40%[1]。目前，能有效治疗男性不育症的方法是辅助生殖技术，但对于内源性生殖细胞缺如无精子症或精子畸形综合征患者, ART或药物治疗无效[2]。胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)可诱导分化为成体器官不同胚层的所有细胞, 因此诱导ESCs在体外分化为雄性生殖细胞，可以为生殖发生提供一个理想的平台[3]。而结合胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术，可在体外培育出与患者遗传特征完全相同的核移植胚胎干细胞(nuclear transfer embryonic stem cells，NT-ESCs)，为男性不育提供种子细胞的新来源。

NT-ESCs理论上可分化为各个组织, 但男性生殖细胞分化的研究尚少[4- 5]。本研究旨在探讨雄性生殖细胞定向诱导分化条件及分子生物学基础。

1.1 材料

雌性C57BL/6小鼠25 g，雌性BALB/c小鼠25 g[上海斯莱克动物有限公司,许可证号：SCXK(沪)2003- 000]。RA、LIF、H-DMEM、bFGF、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、丝裂霉素C等(Sigma公司)。cleavage medium、blastocyst

medium(Sage BioPharma公司)。

1.2 NT-ESCs的培养和鉴定

构建核移植胚胎并检测其DNA来源[6]。重构胚常规培养，挑取形态典型，未分化的NT-ESCs集落传代。经形态学、碱性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、类胚体实验、体内分化方法鉴定。

1.3 NT-EBs细胞诱导分化

培养3～4 d后的NT-EBs接种于铺有0.1%明胶的24孔板。加入含2 μmol /L

RA、1 000 U/mL LIF、20 ng/ mL 成纤维细胞生长因子、30 ng/mL 干细胞生长因子、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、0.1 mmol/L β巯基乙醇,2 mmol/ L谷氨酰胺的高糖DMEM培养液，诱导其向雄性生殖细胞分化，观察NT-EBs生长和形态变化。设4组对照组:1)未分化的NT-ESCs；2)分化培养前的NT-EBs；3)无共培养、自主分化的NT-EBs；4)小鼠胚胎成纤维细胞。

1.4 RT-PCR法检测诱导后雄性生殖细胞发育相关基因的表达

收集培养的NT-EBs提取总RNA反转录为cDNA。引物序列及退火温度见表1。PCR参数: 95 ℃预变性4 min, 94 ℃45 s, 55 ℃～67 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 35个循环,72 ℃10 min。产物电泳，结果以目的基因/β-actin条带密度比值表示(n=6)。

1.5 间接免疫荧光染色法检测VASA、Scp3蛋白的表达

共培养12 d后按间接免疫荧光法, 检测分化组和对照组NT-EBs的VASA、Scp3

蛋白表达，显微镜下观察并照相。判断标准：(-)无荧光；(±)极弱的可疑荧光；(+)荧光较弱，但清楚可见；(++)荧光明亮；(+++～++++)荧光闪亮。

1.6 统计学分析

采用 SPSS 13.0软件分析, 数据以均数±标准差表示, 方差齐性后选择q检验。

2.1 NT-ESCs的鉴定

NT-ESCs呈椭圆形或鸟巢状细胞集落，边缘清晰(图1)；AKP染色呈强阳性,集落

呈深蓝色 (图2A)；细胞具有20对染色体核型的结构 (图2B)；NT-ESCs悬浮培养能形成简单的NT-EBs，较为致密，形态规则 (图2C)；体内注射NT-ESCs可形成畸胎瘤,肿瘤包含源自3个胚层分化的衍生物(图2,D,E,F)。

2.2 NT-EBs体外诱导的生长观察

NT-EBs呈圆球状悬浮于ESCs培养液, 细胞透亮活性好, 大小比较均一，内部细胞致密, 边缘规则(图3A)。分化培养第4天部分细胞由梭形或杆状变为圆锥形，培养7和12 d的细胞增殖能力强，大而圆形细胞增多(图3C,D)。

2.3 RT-PCR检测雄性生殖细胞标志物的表达

诱导12 d后的NT-EBs能够表达雄性生殖细胞相关的特征基因(VASA、Scp3、Sry、Tex14)。与未分化NT-ESCs(0.68±0.03)相比，诱导后Oct4的mRNA相对表达量为0.31±0.06，呈下调趋势; Vasa, Scp3和Sry mRNA相对表达量为: 1.03±0.08、0.95±0.07、1.03±0.06，明显上调 (Plt;0.05)。在诱导前和自然分化的NT-EBs中几乎未能检测到Texl4的表达。小鼠胚胎成纤维细胞均不表达上述相关基因 (图4)。

2.4 NT-EBs细胞VASA和Scp3蛋白的表达

诱导后第12天即可见NT-EBs细胞表达VASA (+)和Scp3 (+)，细胞成簇分布，部分细胞呈现一字形排列；在自然分化对照组NT-EBs中, 未见Scp3阳性细胞，微弱表达VASA (±)(图5)。

多项研究提示，由ESCs获得精子的技术是可行的[5,7]，基于体细胞核移植技术与胚胎干细胞技术NT-ESCs向男性生殖细胞分化有可能同时解决移植物来源和免疫排斥这两大难题。本实验构建成功的小鼠NT-ESCs符合小鼠胚胎干细胞的一系列特性并具有多能性，这为进一步研究组织修复及再生提供了技术平台。

虽然ESCs已证实可诱导分化为雄性生殖细胞，但分化的效率非常低[8]。既往研究大多采用微环境对ESCs进行体外诱导，能使细胞在三维空间结构中进行移动并且与微环境相互作用。例如，用骨形态发生蛋白4BMP4、RA诱导[9- 10]，或将ESCs体外诱导为原始生殖细胞样细胞进而分化成雄性生殖细胞[11]。目前使用最多的方法是采用EB的形式，其含有3个胚层的细胞类型，提供了三胚层细胞间的相互接触模型。目前体外形成EB的微环境能够支持生殖细胞的发育，并能消除生殖细胞发育早期亲缘印迹[12]。在本实验中我们模拟体内微环境，并经RA诱导增殖，研究了胚胎干细胞的诱导分化情况。

本实验检测了4种NT-ESCs和雄性生殖细胞发育相关基因, Oct4为NT-ESCs特