简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理）感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
1、感受态细胞的概念所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。
被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
质粒转化大肠杆菌
2023-10-29
目录
• 质粒转化大肠杆菌概述 • 质粒转化大肠杆菌实验流程 • 质粒转化大肠杆菌影响因素 • 质粒转化大肠杆菌实验结果分析
目录
• 质粒转化大肠杆菌应用与前景 • 质粒转化大肠杆菌实验数据记录
与分析表格（示例）
01
质粒转化大肠杆菌概述
质粒定义与特点
质粒
质粒是一种裸露的、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环 状DNA分子。
转化效率评估
转化效率定义
转化效率是指外源DNA导入受体细胞并实现稳定遗传的频率。在大肠杆菌转化实验中，转化效率是指每微克质粒DNA能够 成功转化大肠杆菌的菌落数。
转化效率影响因素
转化效率受到多种因素的影响，如质粒DNA的浓度、受体菌的种类和状态、转化条件等。通过对这些因素的调控，可以优 化转化效率。
特点
质粒具有宿主细胞独立性，即质粒可以在宿主细胞内进行自我复制，并且不 会干扰宿主细胞的正常生命活动。此外，质粒还可以携带和表达外源基因， 被广泛地应用于基因克隆、基因表达等生物技术中。
大肠杆菌定义与特点
大肠杆菌
大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，属于革兰氏阴性菌。
特点
大肠杆菌具有繁殖快、易于培养、遗传背景清楚等优点，因此被广泛地应用于基因克隆、基因表达等生物技术 中。此外，大肠杆菌还是一种常见的食品污染源，容易引起食物中毒等疾病。
培养温度与时间
培养温度和时间不适宜可能导致细胞活力下降，影响转化效率。
质粒浓度与纯度
质粒浓度
质粒浓度过高可能导致细胞中毒，影响转化效率；质粒浓度过低则可能导致转化效率下降。
质粒纯度
质粒纯度不足可能导致其他杂质干扰转化过程，影响转化中，适宜的转化温度可 以提高转化效率。
质粒转化大肠杆菌
质粒的结构与功能
质粒是一种裸露的、独立于细菌染色 体外并具有自我复制能力的双链环状 DNA分子。
质粒在细菌中发挥着重要的遗传调控 作用，可以促进细菌的进化与适应环 境。
质粒携带特定的基因，赋予细菌某些 表型特征，如抗性、代谢性、致病性 等。
大肠杆菌的遗传特性
大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴 性细菌，具有多种遗传特性，如
抗性、代谢性、致病性等。
大肠杆菌的染色体和质粒共同构 成其基因组，调控其生命活动和
适应性。
大肠杆菌的基因组相对较小，易 于进行遗传操作和基因工程研究
。
转化过程的分子机制
转化过程是指将外源DNA分子导 入受体细胞，并使其获得新的遗
传特性的过程。
在大肠杆菌中，转化过程主要依 赖于细胞表面的受体蛋白与外源 DNA分子的结合，以及DNA分
质粒转化反应
将转化后的细胞在合适的选择培 养基上培养，筛选出转化子。
转化细胞的筛选与鉴定
转化细胞的筛选
在选择培养基上，通过观察菌落的生 长情况，筛选出含有目的质粒的转化 子。
转化细胞的鉴定
通过PCR、酶切等分子生物学方法对 转化子进行鉴定，验证目的质粒是否 成功转化到大肠杆菌中。
04
转化效率的影响因素及优化策 略
转化子基因表达水平的检测
基因表达水平的定量分析
通过qPCR、Western blot等技术手段，对转化子中的目的基因表达水平进行定 量分析，了解转化子中目的基因的表达情况。
基因表达谱的比较
将转化子与未转化子的基因表达谱进行比较，找出差异表达的基因，分析转化对 基因表达的影响。
转化子稳定性的评估
转化子的稳定性检测
感受态细胞制备
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3. 将菌液快速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作； 4. 吸收1.5ml培养好菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5. 4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6. 弃去上清，加入1500 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第5页
试验步骤
CaCl2感受态细胞制备试验步骤 电转化法制备大肠杆菌感受态细胞试验步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第6页
CaCl2感受态细胞制备试验步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5 或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2 . 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上猛烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；
热激法是利用冰凉CaCl2处理对数生长久细 胞, 能够诱导其产生短暂“感受态”, 易于摄取外源 DNA。转化效率为106 ～107转化子/µg DNA。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
第3页
试验仪器
1 . 超净工作台 2 . 低温离心机 3 . 恒温摇床 4 . 恒温培养箱 5 . -70 ℃ 冰箱 6 . 制冰机 7 . 移液器 50ul 、200ul 、1000ul
悬浮；
7. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 8. 弃去上清，加入750 l冰凉10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新
悬浮；
9. 4℃下3000g冷冻离心5分钟 10. 加入20 l冰凉10%甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11. 马上使用或快速置于-70ºC超低温保留。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
质粒转化大肠杆菌
对阳性克隆进行质粒 DNA提取和检测。
03
实验结果分析
阳性克隆的确认
筛选方法
通过在选择性培养基上培养转 化后的菌落，对可疑阳性克隆
进行初步筛选。
验证方法
对初步筛选出的阳性克隆进行菌落 PCR验证，确保阳性克隆中已成功 导入了外源DNA。
验证指标
通过观察PCR产物电泳图，判断阳 性克隆是否含有目的基因片段。
通过电转化仪进行电转化，将质粒DNA转入大肠杆菌 。
转化实验操作
调整电转化参数至合适值。 将转化后的细胞接种到筛选阳性克隆的培养皿中。
将制备好的感受态细胞与质粒DNA混合，进行电转化实 验。
通过离心和热激法将细胞恢复到正常状态。
筛选阳性克隆
通过菌落PCR或酶切 电泳等方法筛选阳性 克隆。
对质粒进行测序验证 ，确认插入片段的正 确性。
增加离心和洗涤步骤
在制备感受态细胞时，加入离心和洗涤步骤可以去除多余的 钙离子和其他杂质，提高感受态细胞的质量和转化效率。
使用更高效的感受态细胞
选择不同品系的感受态细胞
不同品系的感受态细胞具有不同的转化效率。因此，可以通过试验比较不同品系的感受态细胞的转化 效率，选择更高效的感受态细胞。
通过培养条件优化感受态细胞
通过调整培养基的成分、温度、时间等参数，可以优化感受态细胞的生长和状态，提高其转化效率。
THANKS
感谢观看
在生物安全柜中操作，确保实验过程的安全性。
实验操作规范
使用无菌技术，确保实验过程 的无菌性。
将大肠杆菌和质粒分别转化到 合适的培养基中，并进行培养 。
在转化过程中，需要使用感受 态细胞，以确保质粒能够成功 导入大肠杆菌中。
问题与解决策略
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
大肠杆菌中的垂直转移和水平转移机制
大肠杆菌中的垂直转移和水平转移机制大肠杆菌是一种广泛存在于人类和动物肠道中的细菌，它具有很强的传染性和适应性，是医学研究和食品安全等领域的重要对象。
大肠杆菌的基因转移技术在分子遗传学和微生物学研究中扮演着重要的角色。
论文将围绕大肠杆菌基因转移机制展开阐述，包括垂直转移和水平转移两个方面。
一、垂直转移垂直转移是指基因在繁殖、细胞分裂的过程中通过亲本传递给后代的过程，是大肠杆菌基因传递的一个基本方式。
垂直转移的机制是DNA复制和细胞分裂。
在DNA复制的过程中，基因的序列被完整复制，然后分别分配给新生细胞，保证每个细胞中都有一份完整的基因信息。
由此，一代细菌的基因信息与亲本基本相同，但在繁殖过程中，由于DNA突变或其他突发事件的影响，也会有个别基因出现变异。
二、水平转移水平转移是指细菌基因在非亲本间直接传递的过程。
大肠杆菌中最主要的水平转移机制是转化、共轭和噬菌体介导的转移。
1、转化转化是指自由DNA分子或DNA片段被细胞内产生的转化因子识别和摄取后，以一定频率并在无指导的情况下与宿主DNA进行杂交、重组和整合，从而产生新的遗传组合的过程。
大肠杆菌中转化的效率受到很多因素的影响，其中最主要的是DNA浓度、转化因子质量和表达以及外部环境条件的影响等。
2、共轭共轭是指两个具有不同的性别因子的细菌通过接触并通过“生殖”的方式进行基因互换的过程。
这个过程需要一个受体和一个捐助者，受体接收到捐赠者提供的质粒，然后经过重组和引导，两者的DNA合并成一个新的质粒，并被传递给下一个细胞。
共轭机制是大肠杆菌中最主要的水平转移方式之一，是广泛参与抗生素耐药基因传输的重要方式。
3、噬菌体介导的转移噬菌体是一种细菌噬菌寄生病毒，通过感染其寄主细菌并扩散，在这个过程中携带并传播这些细菌的DNA或整个基因组。
噬菌体介导的基因转移可以分为两种方式：一种是典型的噬菌体介导的转移，这种噬菌体基因被噬菌体侵入宿主以后，利用宿主胞上的生命机能将这个基因复制并产生新的噬菌体，然后释放之。
大肠杆菌转化实验(热击法)
大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。
1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入10μl连接产物（一般是全部连接产物）（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中90秒进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入900μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡30min到50min（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
质粒转化大肠杆菌
质粒具有宿主独立性，即可以在宿主细胞中稳定复制，且具有多态性，即不同质粒具有不同的遗传特征。
特于革兰氏阴性菌，具有鞭毛和菌毛等结构，是人类肠道中的正常菌群之一。
特点
大肠杆菌具有生长速度快、培养简单、遗传背景清楚等特点，因此被广泛应用于基因工程和生物研究中。
表达水平检测
基因表达分析
05
质粒转化大肠杆菌应用与前景
克隆鉴定
质粒转化大肠杆菌被广泛应用于基因克隆和鉴定研究中，因为大肠杆菌是基因表达效率较高的宿主菌之一，可以快速、准确地鉴定目的基因的功能和表达产物。
基因表达
通过将目的基因插入到质粒中，再将质粒转化到大肠杆菌中，可以实现目的基因的高效表达，为研究基因功能和生产重组蛋白药物等提供了有力支持。
培养基成分与添加剂
04
质粒转化大肠杆菌实验结果分析
转化效率定义
转化效率是指外源DNA导入受体细胞并实现稳定遗传的频率。在大肠杆菌转化实验中，转化效率是指每微克质粒DNA能够成功转化大肠杆菌的菌落数。
转化效率评估
影响因素
转化效率受到多种因素的影响，如质粒DNA的质量和浓度、受体菌的生理状态、转化条件等。
03
质粒转化大肠杆菌影响因素
感受态细胞制备方法
细胞生长状态
培养温度与时间
感受态细胞制备方法与条件
质粒浓度过高可能导致细胞死亡，降低转化效率；质粒浓度过低则可能导致转化效率下降。
质粒浓度
质粒纯度对转化效率也有影响，高纯度的质粒可以提高转化效率。
质粒纯度
质粒浓度与纯度
VS
大肠杆菌转化最适宜的温度为42°C左右，温度过高或过低都可能影响转化效率。
在含有抗生素的培养基中培养大肠杆菌，筛选出成功转入质粒的菌落。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验原理及步骤
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验仪器、材料、试剂
1、仪器：恒温摇床，恒温水浴锅，电热
恒温培养箱，无菌工作台，微
量移液枪。
2、材料：DH5α感受态细胞、质粒pGEX-4T2
3、试剂：LB液体及固体培养基、氨苄青霉
素Amp（50mg/ml）。
实验步骤
1、每100ul感受态细胞加入1ul质粒DNA， 同时做一个空白对照（由第一组完成） 。
Amp的平板上，直至液体被培养基全部吸收；
6、平板倒置，37 ℃，过夜培养。
时间。
4、悬浮细胞时动作要轻柔，以免造成菌
体破裂，影响转化。
思考题
1、影响感受态细胞转化效率的因素有哪
些？
内容二：质粒DNA的转化与转化体筛选
1
实验目的 实验原理
实验仪器、材料、试剂
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实验步骤
注意事项 思考题
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实验目的
了解转化的概念及其在分子生物学研究中
的意义。
学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞及筛 选重组子的方法。
1、仪器：高压灭菌锅、恒温水浴锅、台式
离心机、无菌操作台、微量移液
器、恒温摇床；
2、材料：菌种E.coli DH5α； 3、试剂：LB液体培养基、0.1M CaCl2。
实验步骤
1、将E.coli DH5α单菌落接种于3mlLB培 养液中，37℃震荡培养过夜。 2、取30μl液体培养液加入3mlLB液体培养 基中， 37℃下震荡培养，至光密度值 OD600在0.5~0.6之间（5×107 个/ml ）。
感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体
DNA分子导入受体细胞。
实验原理
用CaCl2处理大肠杆菌细胞使其处于感 受态后，通过热激处理可将质粒转化进入细 菌中。进入细菌细胞的质粒能够自主复制并 在宿主中实现其携带基因的转录、表达。
大肠杆菌转化实验(热击法)
大肠杆菌转移真验（热打法）之阳早格格创做大肠杆菌转移不妨：（1）将沉组DNA分子导进大肠杆菌受体细胞举止复造，删殖战表黑，以赢得脚段基果；（2）考证大肠杆菌体验态细胞效验；（3）用于分子死物教其余钻研.1本理：量粒DNA粘附正在细菌细胞表面，通过42°C短时间的热打处理，促进吸支DNA.而后正在非采用培植基中培植一代，待量粒上所戴的抗菌素基果表黑，便不妨正在含抗菌素的培植基中死少.2器材：旋涡混同器，微量移液与样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，单里微量离心管架，搞式恒温气浴（或者恒温火浴锅），造冰机，恒温摇床，培植皿（已铺佳固体LB-Amp），超洁处事台，酒粗灯，玻璃涂棒，恒温培植箱.3资料战试剂：量粒DNA，沉组DNA，培植基（没有加抗菌素），LB培植基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal.4真验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管拆进铝造饭盒（灭菌）、移液器吸头拆进相映的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal （M/V，用N,N-两甲基甲酰胺配）.5支配步调：（1）预先将恒温火浴的温度调到42℃.（2）从-70℃超矮温冰柜中与出一管（100μl）体验态菌，坐时用脚指加温融化后拔出冰上，冰浴5~10min.（3）加进10μl连交产品（普遍是局部连交产品）（DNA含量没有超出100ng），沉沉震荡后搁置冰上20min.（4）沉沉摇匀后拔出42℃火浴中90秒举止热戚克，而后赶快搁回冰中，静置3~5min.（5）正在超洁处事台中进与述各管中分别加进900μl LB培植基（没有含抗菌素）沉沉混匀，而后牢固到摇床的弹簧架上37℃震荡30min到50min（6）正在超洁处事台中与上述转移混同液100~300μl，分别滴到含符合抗菌素的固体LB仄板培植皿中，用酒粗灯烧过的玻璃涂布棒涂布匀称（注意：玻璃涂布棒上的酒粗燃烧后稍等片刻，待其热却后再涂）.（7）如果载体战宿主菌符合蓝黑斑筛选的话，滴完菌液后再正在仄板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒粗灯烧过的玻璃涂布棒涂布匀称.（8）正在涂佳的培植皿上搞上标记表记标帜，先搁置正在37℃恒温培植箱中30-60min曲到表面的液体皆渗透到培植基里后，再倒置过去搁进37℃恒温培植箱过夜.（9）正在被细菌传染的桌里上喷洒70%乙醇，揩搞桌里，写真验报告.（10）瞅察仄板上少出的菌降克隆，以菌降之间能互相分启为佳.注意红色菌斑.。
大肠杆菌转化实验(热击法)(PDF)
大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。
1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
实验十一大肠杆菌的转化
实验原理
通常的做法是在大肠杆菌对数生长的早中期， 在0度条件下用CaCl2处理细胞，并辅之以短时 间的热激。感受态细胞吸收DNA的极力尚未明 确。天然的转化体系与CaCl2诱发的转化体系有 一个很重要的差异：前者需要线性的DNA片段； 而后者更多的是吸收环状的DNA。这样我们可 以把外源基因连接在质粒DNA上导入到大肠杆 菌中。这样，外源DNA不需要与宿主染色体重 组，即可随着质粒独立的复制，并表达相应的 性状。
思考题
什么是转化？什么是转导？两 者有什么区别？ 在转化实验中。实验组和对照 平皿应有什么样的结果？如何 解释这个结果？
实验原理所谓转化是指细菌细胞从外界环境中吸收含有某些基因的dna片段从而表现出相应性状的现象
实验十一
大肠杆菌的转化
目的与要求
学习分子遗传学的基本操作。
了解质粒在遗传工程中的重要作用及转 化子的筛选方法。
实验原理
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
所谓转化是指细菌细胞从外界环境中吸 收含有某些基因的DNA片段，从而表现 出相应性状的现象。细菌细胞不是任何 状态下都能吸收外源DNA。它只有处于 一种易于接受外源DNA的状态——感受 态（competence）时才具备这种能力。 分子生物学研究中，利用最多的大肠杆 菌，感受态则必须通过物理的或化学的 方法进行诱导。
实验材料和用品
材料：大肠杆菌 质粒DNA（自己提取） 用品：不加氨卞的LB平板和加氨卞 （100ug/ml）的LB平板 超净工作台 恒温摇床 低温离心机 0.1mol/L CaCl2
实验步骤
分3天进行: 第一天制备感受态细胞;(14-16小时) 第二天完成转化; 第三天观察结果。（16小时）
大肠杆菌转化实验（热击法）
大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。
1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入10μl连接产物（一般是全部连接产物）（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中90秒进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入900μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡30min到50min（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
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简述大肠杆菌转化法的原理
大肠杆菌转化法是一种重要的基因工程技术，用于将外源DNA片段引导入大肠杆菌细胞中。
其原理如下：
1. 准备质粒DNA：外源DNA片段被克隆到一个环状DNA分子上，称为质粒。
质粒中通常包含一个选择性的抗生素抗性基因，用于筛选带有插入物的转化菌落。
2. 制备有效的感受态细胞：将大肠杆菌细胞在低温条件下处理，使其处于亚温感受夹状态。
这样可使细胞外膜孔增大，利于DNA片段进入细胞。
3. 转化：将质粒DNA与感受态细胞混合，并通过热激冷冻法或电穿孔法等方式，增加DNA片段进入细胞的效率。
这些DNA片段会进入大肠杆菌细胞的质粒或染色体。
4. 恢复和培养：将转化后的细菌在适宜条件下恢复生长，使其表达并复制质粒中的外源DNA片段。
5. 识别重组菌落：在含有相应抗生素的培养基上培养细菌，通过筛选获得带有外源DNA片段的重组菌落。
这些菌落会在培养基中形成可见的生长。
通过大肠杆菌转化法，科研人员可以将外源DNA片段导入到细胞中，从而实现基因的增加、改变或删除。
这是基因工程研究和应用中常用的手段，对于生物医
学、农业和工业领域都具有重要意义。