小鼠脾脏单个核细胞分离

密度梯度离心法
聚蔗糖—泛影葡胺 Ficoll-Hypaque: 1.088±0.001
LC, M :1.088 RBC, 粒细胞：>1.092






在1ml小鼠脾脏细胞悬液混匀，然后用滴管沿盛有 2ml淋巴 细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。 将该试管置水平式离心机中离心（1800rpm）15分钟。 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细 胞），吸出界面层细胞，移入另一试管内。 在该细胞收集管内加入生理盐水，用滴管轻轻上下冲洗混 匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉 淀细胞充分摇匀，再用生理盐水离心洗涤1次。 用0.3ml生理盐水（约6滴）将沉淀细胞稀释，摇匀。 取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分 混匀，用计数板在显微镜下计数，计算单个核细胞浓度 （个/ml）。 检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一 试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100~200个单 个核细胞中着色的死细胞数
白细胞
单个核
单核(巨噬) 淋巴 嗜酸
多形核(PMN)
嗜碱
嗜中
组织单核
B
T
免疫细胞检测

细胞数量检测
淋巴细胞的采集和分离 总数检测


亚群检测
外周血单个核细胞的分离

密度梯度离心法
聚蔗糖—泛影葡胺 Ficoll-Hypaque: 1.077±0.001
LC, M :1.075—1.090 RBC, 粒细胞：1.092
淋巴细胞浓度（个/ml） 四个大方格细胞总数 /4×10×2×103

计算细胞活力（%） 活细胞数/细胞总数×100%
思考题：

用Ficoll-Hypaque分离液分离淋巴细胞的原 理是什么？所分离得到的细胞都是淋巴细 胞吗？
免疫学方法：双抗夹心法 分子生物学方法：RT-PCR, 原位杂交， Northern blotting
待检样品（细胞上清）
按不同稀 释度加入
指示细胞（CTLL-2）
37º C，16-20小时
加入3HTdR（1-5Ci） 37º C，4-6小时 收集细胞
测定
白 细 胞 介 素 2 的 测 定 示 意 图
-
特异性 敏感性
优点
缺点
细胞生物 低 学方法 免疫学方 高 法
分子生物 高 学方法
高
可确定活 性
易操作， 可大量检 测 既可定量 又可定位
繁琐费时 不能确定是 否有活性
不能反映浓 度和活性
Hale Waihona Puke Baidu
较高
高
小鼠脾单个核细胞的分离—密度梯度离心法

原理 根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗 粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同 的分布位置。利用此原理可设计一定密度的液体 界面，将各种不同密度的细胞通过离心沉降而达 到使其彼此分离的目的。已知小鼠淋巴细胞和单 核细胞的密度大约在1.088之间，而红细胞与粒细 胞 的 密 度 均 大 于 1.088 。 因 此 ， 若 用 密 度 为 1.088±0.001 的分离液则可通过密度梯度离心方 法，在分离液界面上收集单个核细胞。

T:表达CD2(SRBC受体） B:不表达CD2
免疫细胞功能检测

淋巴细胞转化试验

细胞毒试验
细胞因子检测 溶血空斑实验


T
PHA, ConA,PWM
或Ag
形态学观察Lc 与淋巴母细胞 的比值
3H-TdR掺入法测cpm值
细胞因子检测

细胞生物学方法: CK细胞敏感株