蛋白质表达经验
质谱分析蛋白表达差异
百泰派克生物科技
质谱分析蛋白表达差异
质谱分析蛋白表达差异是利用质谱技术研究蛋白表达差异。
研究蛋白质表达差异，可以帮助我们认识生命活动的本质。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白表达差异分析服务。
蛋白表达差异
蛋白质是由基因转录后翻译形成的，是生物体中一类重要的生物大分子。
蛋白质除了参与生物体细胞和组织的组成，还可以在生物体中发挥广泛的功能，例如催化代谢反应、参与DNA复制、对刺激（如病原体）作出反应，以及将分子从一个位置运输到另一个位置等等。
蛋白表达差异，指的是蛋白质在表达水平上的变化，它可以发生在细胞在不同功能状态、不同细胞周期，或者是在不同条件或药物刺激等情况下。
研究蛋白质表达差异，可以帮助我们认识生命活动的本质，更有助于帮助我们研究疾病的早期诊断、疾病的病程，和检测药物对疾病的疗效等等。
质谱分析蛋白表达差异
质谱分析蛋白表达差异是利用质谱技术对蛋白表达差异进行研究。
质谱技术通过检测不同样品中蛋白质的差异表达，来实现样品中蛋白表达差异的分析。
借助生物信息学技术，还可以对有表达差异的蛋白进行分析，例如基于质谱数据可以对差异表达的蛋白质进行统计分析，如韦恩图和火山图，通过韦恩图可以看出两个差异样品之间的共有的和特有的差异表达蛋白数量，通过火山图（Volcano Plot）可以查看蛋白在两个不同样品中表达水平的差异，以及差异的统计学显著性。
WB操作步骤及经验
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O 至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL 调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
[指南]蛋白质浓度的测定方法总结
![[指南]蛋白质浓度的测定方法总结](https://img.taocdn.com/s3/m/9b0f826e30b765ce0508763231126edb6f1a7664.png)
一、蛋白浓度的直接测定（UV法）这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。
选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。
蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。
从而显得结果很不稳定。
蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。
紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
（1）简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor（2）精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D其中d为测定OD值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数二．紫外吸收法测定蛋白质含量0【实验目的】01. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。
02. 掌握紫外分光光度计的操作方法。
0【实验原理】0大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。
0紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。
0【实验材料】01.实验器材0试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。
02.实验试剂0(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。
0(2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。
0【实验操作】01. 绘制标准曲线0取7支试管按下列各表加入各试剂：0二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。
生物工程工作年度总结
生物工程工作年度总结引言在过去的一年里，我作为一名生物工程师，经历了许多挑战和机会。
我在这篇总结中将回顾我的工作成果、遇到的困难以及我为下一年制定的目标。
工作成果在过去的一年里，我参与了一个关于生物燃料开发的大型研究项目。
该项目旨在利用生物工程技术将废弃材料转化为可再生能源。
在这个项目中，我负责了基因工程和代谢工程的任务。
通过对特定微生物的基因组进行改造，我们成功地提高了其对废弃材料的降解能力和产气性能。
同时，通过优化代谢网络，我们提高了生物燃料合成的效率。
除了研究项目，我还参与了一家生物技术公司的实习项目。
在这个实习中，我参与了一项新药研发项目。
我的主要任务是构建具有特定蛋白质表达的表达宿主菌株，并优化其产量和纯度。
通过改进培养条件和优化表达载体，我们成功地提高了目标蛋白质的产量并降低了副产物的生成。
遇到的困难在工作过程中，我也面临了一些困难和挑战。
其中最大的挑战是在基因工程中的难以预测性。
尽管我们使用了多种生物信息学工具进行设计和模拟，但我们仍然无法完全预测蛋白质表达和代谢途径的效果。
因此，我们需要进行大量的试错和优化，以找到最适合的条件和系统。
此外，在项目中的合作和沟通也是一个挑战。
因为项目中有多个团队和合作伙伴，我们需要确保信息的流动和沟通的及时性。
有时，不同团队之间的意见和目标也可能存在分歧，这需要我们进行有效的沟通和协调，以确保项目进展顺利。
下一年的目标基于过去一年的经验和教训，我已经制定了下一年的目标。
首先，我希望继续深入研究基因工程和代谢工程领域，并进一步提高对生物信息学工具的应用。
我计划参加相关的培训和学术研讨会，与同行们交流经验和新的研究进展。
其次，我打算提前准备并制定项目的实施计划。
在过去的一年中，我意识到一个明确的目标和详细的计划对于项目的成功非常重要。
因此，我将在项目开始之前进行充分的背景研究和计划制定，确保项目的顺利进行。
此外，我还希望提高自己的团队合作和沟通能力。
在工作中，团队合作是至关重要的。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
7
12% SDS-PAGE
CBB Stain
Silver Stain
蛋白质双向凝胶电泳
荧光差异双向电泳
目录
1 蛋白质组研究概述 2 双向电泳样品制备 3 双向电泳操作解析 4 荧光差异双向电泳 5 染色及差异分析
生物样品分类
细菌
植物
真菌 其它
动物
生物分类
亚细胞 细胞
体液 其它
组织
形态分类
生物样品分类
¾Lysis C (1033 spots)：8M尿素、 4%CHAPS、25mMDTT、0.5% CA (pH=46.5)
¾ Lysis D (2226 spots)：5M尿素、 2M硫 脲、 2%CHAPS、2%SB3-10、20mMDTT、 5mM TCEP、0.5% CA (pH=4-6.5)、0.5% CA (pH=3-10)
¾ 比较蛋白质组学：
9 动物疾病的发病机制 9 植物抗逆的分子机理 9 生物标志物发掘
¾ 蛋白质互作组学 ¾ 蛋白质翻译后修饰
蛋白质组学研究常用技术
凝胶
双向凝胶电泳(2-DE) 荧光差异双向电泳(DIGE)
非凝胶
二维色谱(2D-HPLC) 毛细管电泳(HPCE)
一级质谱(MS-PMF) 串联质谱(MS/MS) 部分序列比对(Sequence Query)
¾ Lowary法：碱性条件蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物，
该复合物将磷钼酸-磷钨酸还原后显色 9 优点：灵敏度20-250ug 9 缺点：费时、干扰物质多(Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基 化物、酚类、柠檬酸等)，标准曲线的直线关系不严格
蛋白上样量
¾ 胶条pH范围：范围越窄，上样量越大 ¾ 胶条长度：胶条越长，上样量越大 ¾ 染色方法：灵敏度越低，上样量越大 ¾ 有效蛋白比：比例越低，上样量越大
G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿
G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
蛋白质纯化经验贴
从纯化到星辰---CSH蛋白质纯化课侧记Royluo本文献给YL引子2000年5月6日，我一个人在合肥三孝口书店闲诳,希望买点参考书带出国去。
我注意到有一本翻译过来的书，书名叫做《蛋白质纯化与鉴定实验指南》。
这本书很奇怪，里面列出了很多具体实验的步骤和解释。
我很快意识到，这本书实际上是冷泉港实验室开设的一门《蛋白质纯化与鉴定》实验课的教材。
这本书深深的吸引了我，因为里面记录的实验十分经典，涵盖了蛋白质纯化中可能用到的大部分手段，并且对实验细节有十分详尽的解释。
我对这本书爱不释手，于是就买了下来, 而且当时就动了上这门课的念头。
这是一个很模糊的想法，没有想到的是，五年以后这个想法竟然实现了。
这一系列文章是我对这次上课经历的全面总结，一部分是八卦，一部分是流水账般的记叙，还有一些是从这课程学到的tricks, 最后也掺杂着自己过去做蛋白质纯化的心得。
想到哪说到哪，文字挺松散的，见笑了。
我来解释一下标题。
课程结束之后，每一个学员都有一份证书，印着Per Pura Ad Astra 几个大字。
这是拉丁语，直译就是“从纯化到星辰”。
原始的谚语是,Per Aspera Ad Astra, 意思是through suffering torenown。
所以“从纯化到星辰”实际的意思是，做好蛋白质纯化，以后就容易出人头地。
呵呵。
（二）同学和老师冷泉港的《蛋白质纯化与鉴定》培训班历史相当悠久，从1989年开始每年都开课，到今年是第十六次。
每年都是四月初开始，持续两个星期。
值得一提的是，冷泉港有相当多的培训班和会议，是一个科学家交流和学习的中心。
这是冷泉港享有盛名的最主要原因。
2004年底, 我下定决心上这门课，于是递交了申请。
二月份的时候的到消息，我被录取了，并且还有1000刀的tuition waiver。
可我还是高兴不起来，因为还得解决1600刀(学费一共2600刀)。
老板人很nice,但是他实在没钱了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解决了，去年的退税就这样全搭进去了, 欲哭无泪啊。
细菌裂解-蛋白质表达的关键性步骤说明
细菌裂解-蛋白质表达的关键性步骤说明关于包涵体蛋白质的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括包括：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。
此次介绍菌体的破碎相关知识。
菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
CHO-S细胞蛋白表达操作规程
CHO-S细胞转染操作规程ExpiCHO™ Expression Medium不会抑制转染，因此转染时无需更换培养基。
一、实验材料：1、ExpiCHO-S™ cells cultured in ExpiCHO™ Expression Medium。
2、无菌、无苯酚、无氯化钠，主要是超螺旋结构的含目的基因的质粒。
N0te：推荐使用《PureLink™ HiPure Plasmid Ki t 》试剂盒抽提质粒。
为了保证无菌，可以使用0.22um的过滤器过滤质粒。
3、抗体表达阳性对照质粒（100 µL of the 1 mg/mL，由试剂盒提供）4、ExpiFectamine™ CHO Reagent（4℃冷藏使用，使用前无需预热）5、OptiPRO™ SFM complexation medium（4℃冷藏使用，使用前无需预热）6、ExpiCHO™ Expression Medium（使用前预热至37℃）Note:转染过程中不能添加抗生素，否则会影响转染效率。
7、Polycarbonate, disposable, sterile Erlenmeyer flasks。
8、37℃，8%CO2，可空气加湿的摇床。
9、测定活细胞密度和百分比的试剂和仪器。
（牛鲍计数板、台盼蓝染液）二、转染注意事项：1、新复苏的细胞在转染之前至少要传2代以上。
2、所有针对细胞的操作要严格无菌、动作轻柔，避免剧烈的震荡或移液，细胞的健康状态对最大程度的提高转染效率至关重要。
3、如果不使用ExpiFectamine™ CHO Reagent转染高密度的ExpiCHO-S™ 细胞，转染效率将会大幅度降低。
4、ExpiFectamine™ CHO Reagent使用之前柔和颠倒4-5次，确保试剂充分混匀。
5、质粒DNA与ExpiFectamine™ CHO Reagent的混合可在室温下进行，使用4℃冷藏试剂。
6、一旦ExpiFectamine™ CHO/DNA复合物形成，应立刻将该复合物加到细胞悬液中，5分钟之内不影响转染效率，但不能超过10分钟。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。
2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。
等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。
通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。
这个阶段的电流较低。
3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。
4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。
通常使用SDS-凝胶。
该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。
这个阶段的电流较高。
5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。
然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。
解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。
2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。
这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。
3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。
较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。
4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。
这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。
蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。
通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。
这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。
蛋白质结晶过程优化原理与实践经验分享
蛋白质结晶过程优化原理与实践经验分享蛋白质结晶是一种重要的分离纯化技术，广泛应用于生物医药领域。
在蛋白质结晶过程中，优化结晶条件对于获得高质量的晶体和提高结晶产率至关重要。
本文将讨论蛋白质结晶过程的优化原理，并分享实践经验。
蛋白质结晶的优化原理主要包括溶液制备、结晶条件、核心晶种筛选和结晶监测等方面。
首先，溶液制备是蛋白质结晶过程中的关键步骤之一。
良好的溶液制备可以提高蛋白质结晶的成功率和晶体质量。
通常，溶液的pH值、离子强度、缓冲剂类型和浓度等参数会影响蛋白质溶解度和结晶过程。
因此，合理选择合适的缓冲系统和盐类调节离子强度，调整溶液的pH值和浓度是必要的。
此外，添加辅助剂如聚乙二醇（PEG）、聚丙烯酸（PPA）等可以进一步优化溶液条件。
结晶条件是蛋白质结晶优化的另一个重要方面。
温度、结晶时间、搅拌方式等条件都会对结晶过程产生影响。
一般而言，控制温度在适宜的范围内有助于提高晶体质量和产率。
此外，合适的搅拌方式可以促进溶液中蛋白质分子的遇合，有利于晶核形成和生长。
核心晶种的筛选是优化蛋白质结晶过程中的另一重要步骤。
良好的晶种可以提供高质量的晶体并加速晶体生长。
通常，晶种的选取需要考虑多个因素，如晶体形态、尺寸、生长速度等。
通过尝试不同的晶种和生长条件，可以找到最适合特定蛋白质结晶的核心晶种。
结晶过程的监测是确保结晶过程优化的关键环节。
结晶监测可以通过多种方法实现，如显微镜观察、衍射分析、测量溶液浓度等。
特别是X射线衍射技术，可以提供蛋白质晶体的高分辨率结构信息，有助于判断晶体质量和评估优化效果。
除了以上的优化原理，实践经验也是优化蛋白质结晶过程的关键因素。
在实践中，结晶试验序列的设计、样品预处理和操作技巧都可以影响结晶的结果。
建立合适的试验方案、准确记录实验条件和观察结果，并进行系统的总结和反思，是提高结晶成功率和获得高质量晶体的有效途径。
在实际操作中，有一些实践经验可以分享。
首先，合适的溶液调配和准备是关键。
wb实验心得总结
wb实验心得总结1.引言1.1 概述概述本篇长文旨在总结和归纳我在进行WB实验过程中所获得的经验和体会。
通过本次实验，我有机会深入了解和运用WB技术，并通过实际操作来验证其效果和应用价值。
本文将首先介绍WB实验的背景和相关理论知识，然后详细介绍实验的具体过程和操作步骤。
在实验过程中，我通过调整不同的参数和方法，成功改善了图像的白平衡效果，并增强了图像的色彩准确性和视觉效果。
实验结果表明，WB 技术具有实际应用的潜力，在各种场景下都能有效解决因光照条件不同而导致的图像色彩失真问题。
通过本次实验，我不仅掌握了WB技术的基本原理和实现方法，还学习了如何正确地选择和校准白平衡参考物，以及如何灵活运用WB算法来满足不同场景的需求。
同时，我也意识到了WB技术在图像处理和计算机视觉领域的重要性，它对于提高图像质量以及提供更真实、准确的视觉感受有着至关重要的作用。
在整个实验过程中，我遇到了一些困难和挑战。
通过实践和不断的探索，我逐渐掌握了解决这些问题的技巧和方法。
同时，我也认识到了自身的不足之处，比如对于不同光照条件下的图像处理策略还需要进一步的学习和研究。
综上所述，本文将围绕WB实验展开，详细介绍实验的背景、过程和结果，并总结我在实验中的心得体会。
通过这次实验，我对于WB技术有了更深入的理解和认识，并获得了宝贵的经验和知识。
希望本文能够对读者们对于WB技术的学习和应用提供一定的参考和帮助。
1.2文章结构1.2 文章结构本文主要通过以下几个部分来总结wb实验的心得体会。
首先，将会进行背景介绍，介绍wb实验的相关背景知识和研究领域的前沿进展。
然后，详细描述实验的整个过程，包括实验设计、数据收集和分析方法等。
接着，针对实验结果进行总结，分析实验结果的意义和可行性，并提出实验中的不足之处以及改进的建议。
最后，对整个实验过程进行反思，总结实验带来的心得和体会，探讨实验对个人学习和研究的意义和价值。
为了更好地阐释wb实验的心得和体会，本文在正文的基础上结合实际的实验数据和结果进行分析和讨论。
蛋白质测定实验心得体会
蛋白质测定实验心得体会蛋白质测定实验心得体会蛋白质是构成细胞主要成分之一，参与了细胞的多种功能活动，在生物学研究和临床诊断中起着重要的作用。
为了准确测定样品中蛋白质的含量，我参与了蛋白质测定实验。
通过这次实验，我学到了很多理论知识，并且积累了实验操作的经验。
在这篇心得体会中，我将总结总结这次实验的主要内容和学到的经验。
首先，在这次实验中，我学习了蛋白质测定的理论知识。
蛋白质测定的方法有很多种，常用的有比色法、滴定法和光谱法等。
在实验中，我们使用了比色法（布拉德福法）来测定样品中蛋白质的含量。
这种方法是根据蛋白质与染色剂之间的化学反应，通过测定溶液中染色剂的吸光度来计算蛋白质的浓度。
通过学习这个理论知识，我对蛋白质测定的原理有了更深入的了解。
其次，在实验操作中，我积累了很多实验技巧和经验。
首先是样品的制备。
我们知道，在蛋白质测定实验中，样品的制备非常重要。
在实验室中，我们将样品溶解在合适的溶液中，经过超声处理、离心和过滤等步骤，将样品中的蛋白质从其他物质中分离出来。
在这个过程中，我学会了如何制备稀释溶液、调整样品的pH值和选择合适的离心和过滤条件。
另外，在样品制备过程中，我们还要注意避免污染和样品损失，这需要仔细操作和严格遵守实验规程。
其次，在染色剂的选择和反应条件的优化方面，我也积累了一些经验。
在实验中，我们使用了Bradford染色剂，这种染色剂对蛋白质具有较好的选择性和敏感性。
为了优化反应条件，我们要调整染色剂的浓度、样品的用量和反应时间等参数。
通过不断尝试和调整，我们可以找到最佳的反应条件，从而提高实验的准确性和可重复性。
最后，在数据处理和结果分析方面，我也有了一些心得。
在实验中，我们根据吸光度与蛋白质浓度之间的标准曲线，计算出样品中蛋白质的含量。
在这个过程中，我们要注意选择合适的线性范围和标准曲线的拟合度，避免数据误差和结果偏差。
另外，在实验结果的解读过程中，我们要注意考虑其他因素的影响，比如样品的纯度、结构和其他可能的干扰物质。
G418筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
化学生物专业实习报告5篇
化学生物专业实习报告(2)化学生物专业实习报告(2)精选5篇（一）实习报告（2）实习单位：化学生物研究所实习日期：20XX年X月X日至20XX年X月X日实习地点：XX市XX区XX路XX号一、实习简介化学生物研究所是一家专注于化学生物学研究的机构，致力于利用化学方法研究生物学系统中的各种生物分子的结构、功能和相互作用，以及相关的生物过程和生物学程序。
本次实习主要了解和参与了该研究所的一项关于药物筛选的项目。
二、实习内容1. 熟悉实验室设备和操作规程。
在实习开始前，负责老师向我介绍了实验室的各个设备以及安全操作规程。
我了解到了实验室的安全措施和实验室设备的使用方法。
2. 参与实验项目的进行。
本次实习主要参与了一项关于药物筛选的项目。
该项目旨在通过对大量药物分子进行筛选，筛选出对特定靶点具有高选择性和活性的化合物，用于开发新型治疗药物。
我参与了实验室的分子库筛选工作，通过使用高通量筛选技术，对不同药物分子与靶点之间的相互作用进行评估和筛选。
3. 数据分析和文献查阅。
在实习过程中，我还参与了对实验数据的分析。
通过对实验结果的统计学分析和比较，评估了不同药物分子对于靶点的活性和选择性。
同时，也进行了相关的文献查阅，了解了该项目在同行领域的研究进展和相关成果。
4. 实验室管理和实验记录。
在实习期间，我了解到了实验室的管理和实验记录的重要性，并参与了实验记录和数据统计。
三、实习收获1. 系统了解了化学生物学研究的基本原理和方法。
通过实习，我深入了解了化学生物学研究的基本原理和方法。
学习了目前常用的药物筛选技术和分析方法，对化学生物学领域的研究有了更加全面的认识。
2. 增强了实验操作技能。
在实习中，我熟悉了实验室的常用设备，并掌握了一些重要的实验操作技巧。
通过反复实践，提高了实验的准确性和效率。
3. 学习了团队合作和沟通能力。
在实习中，我与实验室的其他成员共同合作，进行领域内的学术讨论和实验方案的设计，提高了团队合作和沟通能力。
有关蛋白质的实验技术及实验心得集锦
有关蛋白质的实验技术及实验心得集锦一、证明蛋白与蛋白的直接作用用immunoprecipitation只能证明两蛋白之间有作用,但不能证明直接还是间接吧.Comment 1:Y east 2-hybrid Or FRETComment 2:yeast two-hybrid can't be used to definitely say protein A and protein B are directly interacted. To say two proteins are directly interacted, there are a lot of things you should take care.(1) yeast 2-hybrid was used to screen candit protein that may interact with yoru protein. A of of artificial positive exist. because : both in yeast 2-hybrid and mammalian 2-hybrid, you have overexpressed something to such an abundant extent. some RNA binding proteins bind bnd RNAs as a bridge.(2)so, you need GST-pull down, Co-IP to further test the binding, However, during GST-pull donw, co-IP, if you are usinge lysate from cells, you may have created a condition to bring together two proteins that locates in different places in cells, such as one in Nuc, the other in Cyt.(3)so, you need staining of endogenous protiens to show they are colocalized.(4) If the FRET case, you also meet a problem that these two proteins may locate in different places in cells. And may have different concentrations as u have used in FRET.So, it is not that simple to test whether two proteins can interact directly or nothowever, one thing should alwasy keep in mind. Y ou have test them in different assays, you have right controls. and most important this interaction is important for their physiological funtions.Comment 3:2-hybrid won't solve the problem. u have to do in vitro binding using in vitro translated protein. in such system only interested proteins are present in the buffer.Comment 4:good comment. your standard is very high. but usually you can do couple of assays and hope all give you the same positive results. then you'll feel more comfortable to conclude that you find the interaction you're looking for. for endogenous staining now people are looking for 3-D re-construction to verify true co-localization.Comment 5:呵呵，这些都不是绝对的证据。
蛋白不表达的原因总结
做蛋白表达实验的时候，有时候实验会觉得参考实验方法和克隆的蛋白基因序列完全没有问题，蛋白电泳就是没有结果。
就个人经验总结和一些网络资源汇总了下蛋白不表达的原因。
1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别;另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
下图所示：3.密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高!这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用(确认有表达，以此来提高表达量)，而不能雪中送炭(没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效)。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
蛋白质纯化经验
蛋 蛋白 白纯 纯化 化经 经验 验指指南 生 生物 物秀 秀搜 搜集 集整 整理 理并 并免 免费 费提 提供 供, ,向 向原 原作 作者 者致 致敬敬 h h t t t t p p : :/ // /w w w w w w . .b b b b i i o o o o . .c c oo m原创：Chromatography weixingui@ ，推荐书籍：《蛋白纯化与实验鉴定指南》、《生物工程下游技术》、《酶工程》、《酶制剂工业》1) 我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了 GST 亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。
请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。
细胞破碎 后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用 GST 做亲和层析，但效率只有 50～60％左右。
洗脱完融合蛋白不需要助溶剂，但这样的条件下切割完后目的蛋白 会沉淀，我用 0.5％CHAPS 助溶可勉强溶解部分，目的蛋白疏水性比较强。
既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性，这样溶解就会好得多，此外你 也直接加 2%的 PEG 这样也降低极性，同时保护你的蛋白，你再做纯化就可以了，我以 前遇到这样的蛋白是用 10%的乙醇加 35%的 PEG5000，这样的情况下蛋白还是活性回 收率很高，我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好，你失去活性你可以监测一下提 取，纯化，酶切到底哪里失去了活性，这样更容易解决你的问题。
还有注意缓冲液 PH 值， 看看改变它对溶解度有没有影响。
蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点，这也 是个办法。
2) 请问楼主有没有合成过配体为FMN 的亲和胶？亲和的填料合成过 20 来种,你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看 FMN 可偶联的有限, 倒是FAD 有活泼的氨基好偶联,何况它们几乎是同一个辅酶,你是不是考虑把FAD 连上去. 当然 FMN 的结构上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化 或别的活化的介质都不大好,因此我觉得这个没有什么问题.此外如果是以FMN 为辅酶的,那我还可以建议 你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的结 构和 FMN 的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶.如果它可以你就不需要合成填料 了,有现成的.我已经给你发了相关一些偶联的材料，请查收，现在一般要自己合成亲和填料，有很多 公司都提供活化好的介质，自己偶联就可以，其中比较常用的有溴化氰琼脂糖凝胶，环氧琼脂糖凝胶，氨基琼脂糖凝胶，羧基琼脂糖凝胶，活化酯琼脂糖凝胶，以及巯基琼脂 糖凝胶等，但是如果是小分子的配基最好选择有 310 碳作为手臂的活化介质为好，此外 也曾经有文献报导固定辅酶时，偶联位置不同，选择性有差别，因此你可以选择自己适 合的活化介质。
wb表达量计算方法
wb表达量计算方法WB表达量计算方法是一种用于衡量特定基因在Western Blot（WB）实验中表达水平的方法。
WB是一种常用的免疫学实验技术，用于检测和定量研究特定蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
表达量计算方法的准确性直接影响到研究人员对目标蛋白表达水平的认识和结果的解释。
因此，正确选择和应用表达量计算方法是进行WB实验的必要步骤。
【主体部分】一、纯色标测量法（Densitometry method）纯色标测量法是WB表达量计算中最常用的方法之一，该方法使用光密度测定的原理来评估蛋白质的表达。
以下是该方法的步骤：1. 样品制备：收集WB实验的结果图像，并确保图像质量良好，无明显的偏移或阴影。
2. 色标选择：在WB实验中添加色标，色标是已知表达水平的蛋白质。
建议选择一个表达水平与目标蛋白相近的色标。
3. 统计光密度：使用图像处理软件（如ImageJ）打开WB图像，并选择色标和目标蛋白的区域。
通过测量色标和目标蛋白质位置处的光密度值。
4. 计算表达量：将目标蛋白的光密度值与色标的光密度值进行比较，使用相对含量法计算表达量。
相对含量= 目标蛋白光密度值/ 色标光密度值。
二、荧光强度测量法（Fluorescence intensity method）荧光强度测量法是用于测量WB实验中蛋白质表达的另一种常用方法，该方法利用荧光分子的特性来定量目标蛋白的表达。
以下是该方法的步骤：1. 样品制备：收集WB实验的结果图像，并确保图像质量良好，无明显的偏移或阴影。
2. 荧光染料选择：在WB实验中使用荧光染料标记目标蛋白，确保染料选择与实验设备兼容并有高荧光强度。
3. 测量荧光：使用荧光分析仪读取WB图像，并选择荧光信号区域计算荧光强度值。
4. 计算表达量：将目标蛋白的荧光强度值与色标的荧光强度值进行比较，使用相对含量法计算表达量。
相对含量= 目标蛋白荧光强度值/ 色标荧光强度值。
【举例说明】以一组WB实验为例来说明以上两种表达量计算方法的应用，假设实验目的是研究Ras 蛋白在不同时间点的表达。
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如何做原核表达之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。
Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。
已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。
Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。
pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。
T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。
T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。
它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA 的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。
并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。
在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。
T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。
噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。
从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。
如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。
根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。
一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。
为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S 转移酶（glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substance A, NusA）。
2. 转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。
3. 插入一个定位到周质空间的信号序列。
不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。
如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以选择用NdeⅠ直接从起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。
在重组技术上，Novagen除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式：Ligation-Independent cloning，简称LIC。
采用LIC方法的pET载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。
在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。
通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。
一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。
而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和repE元件与parABC 共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。
当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。
pETcoco 载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。
在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步抑制，质粒可以更稳定地存在。
Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改造，它们大致分为以下几个种类：1. 蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包括有B834, BL21, BLR, Origami™ B, Rosetta™和Tuner™。
因此在纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。
BL21(DE3)是应用最多的表达的表达菌株。
另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。
它的缺失，可以保证质粒的稳定。
2. 保证所有细胞以同样量进行表达Tuner™株及它的衍生株（Origami™ B和Rosetta™）是BL21菌株的lacY1缺失突变型，在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。
Lac渗透酶的突变使进入每个细胞的IPTG量都是一致的，这样使蛋白表达浓度可以随着IPTG 浓度而改变。
通过对IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。
一般说来，低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。
3.二硫键形成与溶解性增强二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，Origami，Origami B和Rosetta-gami™。
在这些菌株中表达蛋白，可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。
4. 稀有密码子的补给不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。
Rosetta™是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。
它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。
Rosetta系列是来自BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。
5. 硒蛋氨酸标记B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。
它在高度特异活性35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。
我们常用的培养基有LB、TB、M9、M9ZB，LB因为其成本低廉所以应用最为广泛，而Novagen有提供特殊的培养基Overnight Express™ Auto induction System。
使用这种培养基不需要按照传统方法先培养一段时间再加IPTG进行诱导，它可以直接进行过夜培养。
在这种培养基中含有痕量金属，可以满足合成蛋白时对金属的需求。
同时提供除了各种氨基酸，这其中蛋氨酸是另外加入的。
这样培养基可以满足细菌生长的各种需求，使细菌密度更高；可以自动诱导无需自己加IPTG；使蛋白更加容易溶于培养基中；并且如果需要的话，可以对蛋氨酸进行硒标记。
同时Novagen还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1 DNA 、pETDuet™-1 DNA 、pRSFDuet-1 DNA。
这些载体含有两个不同多克隆位点，可以插入两个外源蛋白基因，利用单独的T7 启动子, 乳糖操纵子和核糖体结合位点进行表达。
载体转化进入合适的菌株中最多可以同时表达8个外源蛋白。
人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。
在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质——胰岛素。
随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。
而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。
原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。
虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题，当有了其它多种表达系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白的首选。
在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手，觉得十分有意思。
但是根据笔者自己的经验以及耳闻目睹的一些经历告诉我：做表达？那是谋事在人，成事在天。
有时候你把克隆做出来了，双酶切鉴定没问题，测序没问题，可是就是看不到表达带。
原因当然可以分析，实验也是可以改进，但是窜改一下戈尔泰的话：“成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。
”在实验遇到瓶颈的时候要如何进行分析，找到问题的症结是我们的实验关键所在。
在准备进行原核表达的时候需要考虑的因素很多，市面上可供选择的载体、菌株也很多，要如何进行正确的选择，找到适合自己的载体是十分重要的。
所以，现在要对目前常用的一些载体进行介绍，让我们对其相关产品及其表达原理进行了解，以方便实验设计。
首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag 检测等等。
选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。
主要归结在表达载体的选择上。
表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。
通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。
但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。
复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。
pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。
通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。
如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。
筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。
四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。
抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。
在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。
今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢？大家“随便倒掉”已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？从以前的一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。