二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。
根癌农杆菌含有Ti 质粒。
发根农杆菌含有Ri 质粒。
根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T-DNA 以外Vir 区的基因。
染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。
原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：（1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。
T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。
农杆菌介导转化法的概述
农杆菌介导转化法的概述自从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。
植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。
[1]目前，应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。
由于基因枪轰击的随机性，容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点，而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定，是最常用的转基因技术[2]。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化法在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。
本文对农杆菌介导转化法进行综述。
1 关于农杆菌农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。
1.1根癌农杆菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤，即诱发冠瘿瘤；Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子，大小约200-250kb。
依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同，根癌农杆菌可分为4种类型：章鱼碱型（Octopine）、胭脂碱型（Nopaline）、农杆碱型（Agropine）和琥珀碱型（Succinamopine）。
原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区：1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region)：不同来源的菌株，T-DNA的长度在12~24 kb，它是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关．T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列．其中14 bp 是完全保守的，分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组．左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的，只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要。
农杆菌介导遗传转化原理
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（ Agrobacterium tumefaciens ）和发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes ）。
根癌农杆菌含有 Ti 质粒。
发根农杆菌含有 Ri 质粒。
根癌农杆菌的 Ti 质粒和发根农杆菌 Ri 质粒都具有一段转移 DNA （transfer DNA ，又称 T-DNA），在农杆菌侵染植物时， T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于 T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和 Ri 质粒上可插入大到甚至 150kb 的外源基因，因此， Ti 质粒和 Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和 Ti 质粒上 T-DNA 以外 Vir 区的基因。
染色体基因包括 chvA 、chvB 、att 、pscA 、chvD 以及 chvB 。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低 pH 和磷酸饥饿情况下提高 VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与 VirA 蛋白共同对 virG 起激活作用。
原始的 Ti 质粒根据其功能的不同，可分为 4 个区：（ 1） T-DNA 区：是在农杆菌侵染细胞时，从 Ti 质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段 DNA ，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与 T-DNA 本身的转移与整合无关。
T-DNA 上最重要的是两端的2个边界（LB和RB），它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在， T-DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA 的右边界在 T-DNA 的整合中对于靶 DNA 位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于 T-DNA 以外的 1 个 30~40 kb 的区域内，该区段编码的基因但对 T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为 Ti 质粒编码毒性基因（vir）。
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素1.农杆菌感染：农杆菌通过其特有的类纤毛附着剂蛋白(T4SS)结构与植物细胞进行初步接触和附着。
2. 感染信号传递：在与植物细胞接触后，农杆菌释放并传递一系列感染信号，包括有效异常淋巴细胞(QvrAB)的诱导、拟南芥(Ca2+)离子内涵物的释放、脑心肌炎物质(AHL)的转运和细胞壁酶的活化等。
3.感染信号诱导细胞凋亡：感染信号的诱导会引起植物细胞凋亡，从而产生切伤的部位或孔洞，在这些切伤或孔洞中形成转化DNA理论允许进入的环境。
4.DNA传递：农杆菌通过T4SS释放线性转化DNA，并借助激发剂打开DNA链，并且该辅助剂经常与T-DNA共同转移到植物细胞总群落中。
5. 植物细胞再生：经过切伤或孔洞进入植物细胞的转化DNA在细胞质中被转录，转录本通过RNA splicing进一步处理并通过核孔复合物进入细胞核。
在细胞核中，转录本通过与受体蛋白结合而在柏氏体中形成mRNA。
mRNA会进一步被转录为蛋白质，这些蛋白质会促进植物细胞再生。
1.植物物种：不同植物物种对于农杆菌的感染和转化效率具有差异。
有些植物对农杆菌的感染和转化具有天然的耐受性或敏感性。
2.植物组织类型：不同植物的不同组织对于农杆菌的感染和转化效率也有所差异。
例如，幼嫩的愈伤组织对于农杆菌的感染和转化效率通常较高。
3.农杆菌菌株：不同菌株具有不同的亲和力和感染能力。
有些农杆菌菌株能够高效地感染和转化植物细胞，而有些菌株效率较低。
4.结构改造：农杆菌通过改造表面酶结构以增加其细胞壁附着能力，从而提高农杆菌感染和转化效率。
5.切伤或孔洞大小：适当的切伤或孔洞大小能够促进农杆菌介导植物转化的效率。
切伤或孔洞过小会限制转化DNA进入细胞，而切伤或孔洞过大则会增加细菌感染的难度。
总之，农杆菌介导植物转化是一种复杂的生物学过程，其效率受到多个因素的影响。
进一步研究和优化这些因素可以提高农杆菌介导植物转化的效率，为植物遗传工程提供更多的可能性。
影响农杆菌介导的植物转基因的因素
影响农杆菌介导的植物转基因的因素张福丽;李季平;高丹;张慧芳;李成伟【摘要】农杆菌介导法是植物转基因研究中应用最多的方法,具有转化成本低、效率高、可转移较长基因片段等特点.多种因素影响此遗传转化过程中的转化率,包括外植体类型、植物基因型、外植体的处理、菌株和质粒载体类型、预培养以及培养基成份等方面.%Agrobacterium-medialed technique is a kind of methods in transgenic research used mostly for plants, and having some advantages, such as the low transformation cost, the high efficiency, being able to transfer longer gene fragments. Many factors influence transformation efficiency in the transformation process, including explant type, plant genotype, explant processing, type of bacterial strain and plasmid carrier, preculture medium composition and so on.【期刊名称】《生命科学研究》【年(卷),期】2011(015)005【总页数】6页(P449-454)【关键词】农杆菌;植物;转基因;转化率;影响因素【作者】张福丽;李季平;高丹;张慧芳;李成伟【作者单位】周口师范学院生命科学系植物遗传与分子育种重点实验室,中国河南周口 466001;周口师范学院生命科学系植物遗传与分子育种重点实验室,中国河南周口 466001;周口师范学院生命科学系植物遗传与分子育种重点实验室,中国河南周口 466001;周口师范学院生命科学系植物遗传与分子育种重点实验室,中国河南周口 466001;周口师范学院生命科学系植物遗传与分子育种重点实验室,中国河南周口 466001【正文语种】中文【中图分类】Q812植物基因工程研究始于20世纪70年代,它是将在体外定向重组的特定外源基因导入到受体植物内,并能够稳定遗传,使其获得新的遗传性状.发展至今,植物基因工程已成为植物遗传育种以及质量性状改良的有效途径之一.在这个过程中,用于遗传转化的方法很多,但应用最多、最广泛的是农杆菌介导法,此方法具有效率高、成本低、可转移较长基因片段等优点.目前,所得到转基因植株中有85%都是通过农杆菌介导法而得到的.但是,农杆菌介导的植物遗传转化中转化率仍然是一个需要解决的问题,有一些理化和生理因素影响着转化率和T-DNA进入植物细胞,主要有菌株、质粒、组培环境、培养基、外植体类型以及植物基因型等.不同的植物,有利于T-DNA转移的条件是不同的[1],通过优化其中的某个或某些因素,可以大大提高转化率.本文就影响农杆菌介导遗传转化的因素进行了分析,以期为提高农杆菌介导的植物转基因的转化率提供科学方法.根癌农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌,能够诱导大部分双子叶植物及部分单子叶植物产生冠瘿瘤,其上的Ti质粒决定着肿瘤的诱导产生,天然的Ti质粒上由T-DNA 区、毒性区(Virulenceregion,Vir区)、Con区及 Ori区四部分组成.TDNA区两端为25 bp的左右边界重复序列.TDNA区内的生长素合成基因、细胞分裂素合成基因和冠瘿碱合成基因,对冠瘿瘤的形成起着关键作用.在转化的早期阶段会有大量的蛋白质参与,涉及几个分子机制.当植物受到伤害,农杆菌与植物细胞相互识别后,诱导Vir基因,Vir基因编码的多肽类物质就会附着在T-DNA上,促进TDNA的转移和整合进植物染色体中,同时保护DNA免受植物细胞中核酸酶的影响.T-DNA区在Vir区蛋白的作用下,分别在左右边界产生切口,将T-DNA插入到植物的染色体中.Vir 区基因表达产物对整个转化过程起决定性作用.已发现有10余种Vir区的基因表达产物参与T-DNA的转移[2].Ti质粒至少由6个能被信号分子诱导的操纵子组成,这些信号分子主要是一些小的酚醛物质、特定种类的单糖等[3].农杆菌介导的植物转化以农杆菌与外植体相互识别和附着为开始,以整合入基因组中的T-DNA得以表达为终止.农杆菌介导的植物基因转化过程,是农杆菌和受体植物相互作用的过程[4],这就要求受体对农杆菌的侵染比较敏感.受体对转化的影响主要体现在植物基因型、外植体类型及外植体的处理等方面.不同生理状况的外植体对农杆菌的敏感性不同.大豆较幼嫩的愈伤较长期培养的愈伤对农杆菌敏感[5].这是因为一方面幼嫩的外植体具有较强的细胞分化能力,对于双子叶植物,这种能力对于T-DNA转移和整合是必须的[6];另一方面,外植体的培养过程中会分泌一些抑制细胞分化的物质,并使细胞结构发生变化,这些都不利于农杆菌和植物细胞的相互作用.外植体类型对转化的影响也表现在器官的不同上.当分别用鹰嘴豆的胚轴、上胚轴和茎作为外植体进行转化时,以上胚轴的转化率最高[7].另外,外植体年龄也影响着农杆菌转化的成功与否.一般认为,幼嫩的生长旺盛的组织对农杆菌更敏感,被感染后,伤口附近的细胞较易脱分化形成较多的感受态细胞[8].在用意大利黑麦草的愈伤进行转化时,9日龄的愈伤表现了较高的转化率,超过9 d,外植体在共培养后就会褐化和死亡[9].而有些植物则表现出与之不同的现象,用7～50 d的愈伤作为外植体时,随着外植体年龄增长,GUS基因的瞬时表达量增加[10].在外植体的年龄方面,同一植物的不同品种对转化的影响仍有差异.研究粳稻的遗传转化时,来自成熟胚的胚性愈伤因具有高的细胞分化能力而被认为是农杆菌侵染时的最佳外植体[11].而对于籼稻而言,新分离的非成熟胚是转化时的最佳外植体[12].也有人研究了外植体大小对转化效率的影响.来自大豆非成熟胚的子叶节小于4 mm时,选择过程中没有或有很少的胚胎发生,7～8 mm的外植体与5～6 mm的转化率最高,当外植体大于9 mm时,转化率最低,这可能是因为来自较大外植体的感受态细胞对农杆菌、2,4-D和选择剂不敏感[13].虽然通过农杆菌介导法得到了大量的转基因植物,但是农杆菌对不同基因型植物的侵染能力不同.不同物种的植物对农杆菌的敏感性不同,甚至同类植物的不同品种之间差别也很大.有的物种(如烟草)转化效率可高达90%,而大多数物种(特别是一些主要农作物品种)的转化效率还普遍很低[14].基因型的特异性与植物细胞的生理特性有关,这包括细胞受伤后的生理反应、细胞内源激素的浓度以及细胞结构等 [7].在谷类作物的遗传转化中,水稻的基因型依赖性最低,目前为止已成功得到了包括Japonica、Indica和Javonica水稻在内的超过40个基因型的转化植株,而在其它主要的谷类作物中,仅有少数典型基因型得以成功转化[15].基因型的差别主要是因为植物体内抑制系统的存在阻止了植物对农杆菌的感受.如在玉米幼苗根部分泌的主要有机物质MDIBOA抑制剂,尤其抑制Vir基因的诱导表达[16],而农杆菌侵染这些不易转化的外植体的能力是由VirA决定的[17].植物感受到农杆菌和外源基因后,就会启动自身的防御系统阻止转化的进程和外源基因的表达.有研究表明,拟南芥cep1突变体因本身表达与防御有关的基因,对农杆菌的侵染较为顽固[18].农杆菌侵染后,参与T-DNA整合的蛋白也影响着转化的成功与否.如拟南芥KU80蛋白,KU80突变体植株不宜于使T-DNA整合进植物体细胞,而KU80过表达植株对农杆菌的侵染较敏感,并使植物细胞保护DNA免受伤害的能力得以增强[19];拟南芥VIP1蛋白与寄主细胞的H2A组蛋白形成同聚物和相互作用的能力对肿瘤发生,以致稳定的基因转化是必须的[20].外植体的处理主要是指外植体的损伤处理、抗氧化及干燥等方面的处理.通常认为,植物外植体损伤处理后,可以提高转化效率.这主要是因为外植体受伤后,可以使农杆菌更易于接近植物细胞,或者是损伤刺激了诱导Vir基因表达的酚类物质(如乙酰丁香酮)的分泌[21],并使细胞的转化能力增强[22].实际中,对外植体作损伤预处理时,不同植物的外植体有不同的表现.人为制造伤口,可以使豌豆(Lathyrus sativus L.)的转化率达到36%,而没有受伤的外植体的转化率仅为8%[23].有些植物受伤处理及伤害诱导的细胞分裂不是转化所必需的 [24,25],未受伤的外植体转化率最高[26].超声波处理可使受体材料表皮和深层造成微损伤.当把鹰嘴豆的外植体与农杆菌一起进行超声波处理后,可以提高转化率[27].氧化作用也影响植物的转化率.当把花生的胚轴在转化前用PVP(减少酚类化合物的氧化作用)和1/2MSi(1/2MS基本培养基中加入1 g/L肌醇,不加糖)(去除外植体受伤后分泌的酚类化合物)溶液冲洗,用1/2MSi冲洗1 h(分3次,每次20 min)能提高转化率;当冲洗时间再延长时,转化率开始下降;不用冲洗处理时,得不到转化植株[28].干燥和抗坏死处理影响T-DNA的转移和转化[29].在农杆菌侵染之前或侵染之后是否将外植体进行干燥是影响谷类作物转化率的一个重要因素[30].但是Perl等的研究表明,防止葡萄外植体坏死的各种抗氧化剂对转化率没有影响[31].外源转化供体对植物转基因的影响主要体现在:农杆菌菌株类型、质粒载体类型、预培养和培养基成份等方面.农杆菌侵染植物外植体时,农杆菌的吸附数目与菌株类型有关,同一菌株对不同种外植体的侵染能力也不同.农杆菌EHA101较C58能更好地促进外源基因进入植物细胞[32].LBA4404适于豆科植物中的 Cajanus cajan[33]、Cicer arietinum[34,35]、Lathyrus sativus[36],而EHA105在印度黄檀(Dalbergia sissoo)[37]、大豆(Glycine max)[38]和木豆(Cajanus cajan)[39]中的转化是有效的.在对花生和苹果的转化中,菌株EHA101较C58更能促进基因的转化[40,41].载体质粒类型也对农杆菌介导的植物转化率有影响.以鹰嘴豆ICCC37上胚轴为外植体,分别用载体质粒pB1121、pHS102和pHs101进行转化,其中以pHS102载体的转化率最高,其次是pB1121和pHs101[7].转化水稻时,pRKJ108较pJDW53具有高的转化频率[42],这可能是因为pRKJ108具有MAR序列 (matrix attachment regions),能够降低基因沉默和位置效应,提高低拷贝转化株的转化频率[43,44].预培养是指在对外植体进行侵染之前,在含有外源激素的、适合外植体再生的培养基上培养一段时间.预培养对遗传转化有以下几方面的作用:一是促进细胞分裂,一般来说处于分裂状态的细胞更容易整合外源DNA,因而有可能提高外源基因的瞬时表达和转化率[45,46],同时可以减轻农杆菌对外植体的伤害[47];另外还有利于侵染接种的外植体与培养基平整接触,以利于充分吸收营养和提高筛选效率[48,49].不同植物对预培养的反应不同.预培养可以提高木豆的转化率[50].在花生的遗传转化中,外植体是否经过预培养对转化没有影响[51].而有些植物进行转化时,经过预培养后,转化率反而会下降,不经预培养转化率最高[52].这可能是由于经过预培养后,损伤得以愈合,而损伤诱导酚类物质(如:乙酰丁香酮)的产生,这些信号分子可以诱导Vir基因的表达和使T-DNA发生转移[6].农杆菌介导的植物转基因还受激素、培养基成份和培养条件的影响.降低预培养基中钙的含量可以促进农杆菌的侵染.Montoro等的研究发现,橡胶树愈伤组织在无CaCl2的培养基上预培养一段时间后,可以提高转化效率[53].在固体培养阶段添加硝酸银以及用羧苄青霉素代替头孢噻肟钠可以提高Hi-II胚的转化率[54].再生培养基中附加AgNO3可促进芽原基的产生和伸长;没有AgNO3时,芽原基逆向发育成非器官性的愈伤组织,从而难以分化成芽[55,56].当把培养未成熟胚的N6培养基换成MS培养基时,玉米自交系B104、B114和Ky21的转化率都得到了提高[57].在共培养基中加入半胱氨酸可以提高大豆子叶节的转化率[58].侵染培养基中添加表面活性剂(如:Tween-20、普朗尼克酸F-68)有利于农杆菌吸附在外植体的表面,易于T-DNA转移[59],提高转化率.培养基中激素的种类和浓度也影响转化率.在对大豆的遗传转化中,毒莠定诱导的愈伤较用2,4-D诱导的愈伤具有较高的GUS瞬时表达率[10].用2,4-D诱导愈伤或在共培养基中添加2,4-D能提高水稻和小麦的转化率[1,60].但也有研究表明,共培养基中因添加2,4-D降低了水稻中GUS表达的比率[61].对于培养基中激素的浓度而言,高浓度激素诱导的愈伤更易于被农杆菌侵染.高浓度激素莠毒定诱导的香蒲愈伤较低浓度诱导的愈伤具有高的GUS表达率[10].选择培养基中加入AgNO3可以提高油菜的转化率[62].农杆菌介导的植物转基因受多种因素的影响,想要建立一个高效的遗传转化体系,需要针对特定植物种类和特定组织,从以上方面对各个因素进行优化,以使农杆菌介导的转化方法在更多的植物中得以高效、成功地应用.【相关文献】[1]WU 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农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素
农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素农杆菌介导植物转化是一种常用的基因转化技术，利用农杆菌转化DNA进入植物细胞，使其表达目的基因。
在这个过程中，农杆菌的外源DNA会被单胞菌分泌物（Vir）基因编码的蛋白质工具分子T-DNA结合酶（VirD2）切割成目标T-DNA片段，然后T-DNA和Vir蛋白质工具分子挤进被切开的植物细胞，最终整合入植物细胞的染色体中。
1.农杆菌菌株：农杆菌菌株的选择对转化效率有重要影响。
通常选择具有较高转化效率的农杆菌菌株，如LBA4404、GV3101等。
不同的菌株对于不同的植物种类和品种可能有不同的适应性，因此需要根据具体情况进行选择。
2.感受性植物：不同植物对农杆菌介导植物转化的感受性各不相同，高度感受性的植物容易进行转化。
除了感受性外，植物的再生能力也是影响转化效率的因素之一、通常来说，拥有较高再生能力的植物对转化更加容易。
3.T-DNA载体：T-DNA载体是构建农杆菌介导植物转化载体的关键。
在农杆菌介导植物转化过程中，目标基因的载体必须经过农杆菌系统与植物细胞进行相应的介导，进而整合到植物细胞基因组中。
选择合适的T-DNA载体进行构建，可以提高转化效率。
此外，T-DNA载体中导入基因的拷贝数、插入位点的选择等也会对转化效率产生影响。
4.辅助物质：除了基础的转化体系以外，辅助物质也是影响转化效率的一个重要因素。
辅助物质主要包括感受性缓解物质、抗生素等。
感受性缓解物质主要用于保护不同类型的植物细胞免受农杆菌侵染造成的伤害，提高细胞存活率；抗生素主要用于抑制农杆菌菌落的生长，避免菌落过度生长对植物细胞的负面影响。
辅助物质的添加可以有效增加转化效率。
5.转化条件：转化温度、菌液浓度、转化时间等转化条件也会对转化效率产生影响。
具体条件需要根据植物种类和品种的特点进行优化。
总之，农杆菌介导植物转化主要是通过农杆菌菌株和植物的相互作用引发变化，其转化效率受多个因素的综合影响。
农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展
基金项目上海市科技兴农项目（沪农科推字〔2021〕第1-3号）；安徽省科技重大专项（201903a06020011）。
作者简介陈思（1997—），女，安徽安庆人，助理农艺师，从事水稻遗传育种工作。
*通信作者收稿日期2022-06-17农杆菌介导水稻遗传转化的影响因素及应用研究进展陈思张从合*王慧吴浩然杨力黄艳玲管昌红（安徽荃银高科种业股份有限公司/农业农村部杂交稻新品种创制重点实验室，安徽合肥230088）摘要在水稻遗传转化过程中，农杆菌介导转化法与其他方法相比优势较多，比如转入的外源DNA 结构完整及表达比较稳定、操作简便、转化率高等，已被广泛应用于转基因技术中。
本文对根癌农杆菌介导水稻遗传转化的原理、影响遗传转化的因素进行了综述，并探讨了农杆菌介导转化法的应用前景。
关键词水稻；根癌农杆菌；农杆菌介导转化法；遗传转化中图分类号S511文献标识码A文章编号1007-5739（2023）05-0001-04DOI ：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.05.001开放科学（资源服务）标识码（OSID ）：Research Progress on Influencing Factors of Agrobacterium-mediated GeneticTransformation of Rice and Its ApplicationCHEN SiZHANG Conghe *WANG HuiWU HaoranYANG LiHUANG YanlingGUAN Changhong(Anhui Win-all Hi-tech Seed Co.,Ltd./National Key Laboratory for New Variety Development of Hybrid Rice of Ministry of Agriculture and Rural Affairs ，Hefei Anhui 230088)AbstractIn the process of rice genetic transformation,agrobacterium-mediated transformation method has manyadvantages compared with other methods,such as the complete structure and relatively stable expression of the transferred exogenous DNA,simple operation and high transformation rate.It has been widely used in transgenic technology.This paper reviewed the principles of rice genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens and the factorsaffecting genetic transformation,and discussed the application prospects of agrobacterium-mediated methods.Keywordsrice;Agrobacterium tumefaciens ;agrobacterium mediated transformation method;genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物之一，是全球1/2以上人口的主食，也已经成为植物基因组学研究的重要对象[1]。
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。
其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。
本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。
一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。
它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。
因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。
农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。
其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。
二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。
例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。
在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。
其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。
此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。
为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。
一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。
提高农杆菌介导小麦遗传转化效率的几个因素
第 40 卷 第 6 期 Vol. 40 No. 6
山 东 大 学 学 报 (理 学 版) JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY
2005 年 12 月 Dec. 2005
文章编号 :167129352 (2005) 0620120205
收稿日期 :2005209215 基金项目 :国家转基因与产业化专项项目 (J992037) 作者简介 :于惠敏 (19632 ) ,女 ,硕士 ,副教授 ,从事植物学教学与研究 (现工作单位山东教育学院生物系) . 3 通讯作者
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
1 材料与方法
1. 1 小麦材料 (1) 胚性愈伤组织 :取小麦 ( Triticum aestivum L . )
品种济南 177 、核生 3 号的幼胚 ,在 MB2 培养基 (MS 培养基附加 2 mgL - 1 2 ,42D) 上诱导愈伤组织并继代 培养. 以培养 1 年以上的胚性愈伤组织 (再生分化频 率为 80 %左右) 作为转化材料. (2) 幼胚 : 取小麦开 花受粉后 12～15 d 的幼胚 (直径约 0. 5 mm 时) 置于 MB2 号培养基上诱导 10 d 左右 ,作为转化材料. 1. 2 农杆菌菌株和质粒
农杆菌介导实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌介导植物遗传转化的基本原理和操作步骤；2. 了解农杆菌转化过程中的影响因素；3. 通过实验验证农杆菌介导植物遗传转化的可行性。
二、实验原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤细菌，其Ti质粒（肿瘤诱导质粒）能够将外源基因导入植物细胞中。
Ti质粒上的T-DNA（转移DNA）片段能够插入到植物基因组中，从而实现外源基因在植物中的稳定遗传和表达。
三、实验材料1. 植物材料：拟转化植物的外植体（如叶片、茎段等）；2. 农杆菌菌株：含有T-DNA的农杆菌菌株（如LBA4404）；3. 转化载体：含有目的基因的载体（如质粒）；4. 培养基：MS培养基、诱导培养基、选择培养基等；5. 试剂：抗生素、酶、DNA标记物等。
四、实验步骤1. 构建转化载体：将目的基因克隆到载体上，构建含有T-DNA片段的转化载体。
2. 农杆菌活化：将农杆菌菌株接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜。
3. 外植体消毒：将外植体在70%乙醇中浸泡30秒，然后在无菌水中清洗3次，最后在无菌条件下用无菌刀片切取适当大小的外植体。
4. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与外植体在MS培养基上共培养，使农杆菌感染外植体。
5. 诱导再生：将转化后的外植体接种于诱导培养基上，诱导再生丛生芽。
6. 选择转化植株：将再生丛生芽在含有抗生素的选择培养基上培养，筛选出转化植株。
7. 鉴定转化植株：通过分子生物学方法（如PCR、Southern blot等）鉴定转化植株。
五、实验结果与分析1. 农杆菌转化频率：实验结果表明，农杆菌转化频率较高，转化植株数量较多。
2. 转化植株的遗传稳定性：通过分子生物学方法鉴定转化植株，发现转化植株的遗传稳定性较好，目的基因在植物基因组中的插入位置和拷贝数稳定。
3. 转化植株的表达：转化植株中目的基因的表达水平较高，达到预期效果。
六、实验结论通过农杆菌介导植物遗传转化实验，成功地将目的基因导入植物细胞中，实现了植物遗传改良。
农杆菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握农杆菌转化法的基本原理和操作步骤。
2. 将抗虫基因导入植物细胞，观察转化效果。
二、实验原理农杆菌转化法是一种将目的基因导入植物细胞的方法。
该方法利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）将目的基因转移到植物细胞中，并整合到植物细胞染色体DNA上，从而实现目的基因的遗传表达。
三、实验材料1. 植物材料：拟南芥种子、生长培养基、诱导培养基、选择培养基。
2. 农杆菌：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）。
3. 抗虫基因：Bt基因。
4. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶。
5. 试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素、CaCl2、DNA标记染料等。
四、实验步骤1. 目的基因克隆（1）设计引物：根据Bt基因序列设计一对引物，用于扩增Bt基因。
（2）PCR扩增：以Bt基因的DNA为模板，进行PCR扩增。
（3）克隆：将PCR产物连接到载体上，转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
2. 农杆菌工程（1）制备感受态农杆菌：将根癌农杆菌接种于LB液体培养基，37℃培养过夜，按1:100的比例接种于新鲜的LB液体培养基，37℃培养3小时，加入IPTG和CaCl2，使农杆菌进入感受态。
（2）目的基因转化：将克隆有Bt基因的载体与感受态农杆菌混合，在冰浴中孵育30分钟，然后将混合液涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。
3. 植物转化（1）种子处理：将拟南芥种子用70%酒精消毒后，用无菌水冲洗干净。
（2）农杆菌感染：将处理好的种子接种于含有农杆菌的培养基上，28℃恒温培养3天。
（3）筛选转化植株：将感染后的种子接种于选择培养基上，筛选出转化植株。
4. 抗虫鉴定（1）PCR检测：提取转化植株的DNA，进行Bt基因的PCR检测。
（2）生物测定：将转化植株与抗虫性差的拟南芥进行抗虫性比较，观察转化植株的抗虫效果。
农杆菌转化机理
农杆菌转化机理
农杆菌转化机理
农杆菌转化是一种广泛应用于生物工程和植物基因转化领域的技术，它的原理是通过利用农杆菌的自然基因转移能力，将外源DNA序列导入到目标细胞中。
农杆菌具有天然的DNA转移系统，能够将外源DNA经由细胞壁孔道导入细胞质内，再由各种核酸酶剪切，将DNA 外源序列整合到宿主染色体上。
农杆菌转化是一种相对简单的基因转化技术，其操作过程主要包括以下几个步骤：
1.农杆菌的预处理。
通过诱导剂和渗透压等手段，使其细胞壁松弛，增加其与外界交换物质的通透性，从而达到提高转化效率的目的。
2.目标细胞的前处理。
使其表面上的细胞壁稳定并与农杆菌结合，以便农杆菌能够将外源DNA导入到目标细胞内。
3.农杆菌的感染。
将预处理过的农杆菌与目标细胞接触，使其通过感染方式向目标细胞内输送外源DNA序列。
4.外源DNA序列的整合。
在接触过程中，农杆菌通过其自身的转移机制将外源DNA序列整合到目标细胞染色体的特定区域，从而实现外源基因导入。
此外，农杆菌转化机理还受到一些因素的影响，如接触时间、温度、菌株和目标组织细胞类型、外源DNA序列大小和复杂性等。
因此，在实际的应用中需要针对具体的情况进行优化和调整，以达到最佳的转化效果。
总之，农杆菌转化是一种简单高效的基因转移技术，已经被广泛应用于生物工程和农业生产中，在许多方面都有着重要的应用价值。
随着生命科学技术的不断发展，人们对于农杆菌转化及其机理的研究也将越来越深入，相信这将为该技术的进一步应用和发展带来新的机遇和挑战。
农杆菌转化原理及技术
❖ 抗性愈伤的分化
抗性苗的生根
❖
转基因植株田间种植
转化率、分化率和共转化率的计算
❖ 抗性愈伤获得率（%）=抗性克隆数/转化克隆数×100% ❖ 绿苗率（%）=再生克隆数/抗性克隆数×100%
谢谢
Bacterial T-plasmid produces receptors for acetosyringone
Plant wound produces acetosyringone
Produce callus transform callus stimulate shooting by cytokinin addition
blogsinacomcnwxppt农杆菌介导的水稻遗传转化原理及技术blogsinacomcnwxppt水稻遗传转化已成为水稻分子生物学研究和遗传改良的重要技术基础blogsinacomcnwxppt几种常用植物基因转化方法的比较转化方法农杆菌法peg法电击法微针注射法基因枪法花粉管通道法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞卵细胞宿主范围有性繁殖植物组培条件简单复杂复杂复杂简单操作复杂性简单简单复杂复杂复杂简单设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵便宜工作效率单子叶植物应用可行可行可行广泛广泛blogsinacomcnwxppt农杆菌介导法的优点操作简便外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝转移dna片段明确可转移大片段dna可直接用丌同的植物组织进行基因转移blogsinacomcnwxppt农杆菌介导遗传转化的原理blogsinacomcnwxppt农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌分为发根农杆菌导致毛状根的发生和根癌农杆菌导致冠瘿瘤冠瘿瘤细胞可产生正常细胞丌能产生的冠瘿碱
❖ 5.愈伤组织的筛选
❖ 将愈伤转移至选择培养基筛选抗性愈伤，每两周转 接1次。
农杆菌转化法作用
农杆菌转化法作用
农杆菌转化法作为一种常见的基因转移技术，被广泛应用于生物学和农业领域。
本文将从农杆菌转化法的基本原理、应用领域、优缺点等方面进行介绍。
一、基本原理
农杆菌转化法基于农杆菌与植物细胞间的互作关系，将外源DNA 转移至植物细胞中，实现基因转移。
其基本原理是将外源DNA与农杆菌质粒（Ti质粒）连接，然后将这些质粒转移至农杆菌细胞中，接着再将农杆菌与植物细胞接触，使质粒中的DNA转移到植物细胞中。
转移过程中，农杆菌的生物学特性是关键因素，包括其菌株的选择、营养物质的添加等。
二、应用领域
1.植物基因工程：农杆菌转化法是植物基因工程中最常见的技术之一。
利用农杆菌转化法可以将外源基因导入植物细胞中，实现多种基因功能的表达或靶向编辑。
2.农业生产：农杆菌转化法可以被用于改良农作物的品质和产量。
例如，通过导入耐盐碱性基因或高产基因，可以提高作物的适应性和产量。
3.医学研究：农杆菌转化法在医学研究中也有应用。
例如，将荧光
蛋白基因转移到哺乳动物细胞中，可以用于细胞追踪和药物筛选。
三、优缺点
1.优点：农杆菌转化法具有高效、简便、可重复性好等特点。
同时，该技术也可应用于多种植物物种中。
2.缺点：农杆菌转化法也存在一些缺点，如转化效率和稳定性会受到多种因素的影响，如农杆菌菌株的选择、植物细胞的生长状态等。
四、总结
农杆菌转化法作为一种常见的基因转移技术，具有广泛的应用前景。
虽然该技术存在缺点，但是其高效、简便的特点仍然使其成为一种重要的基因转移技术。
我们相信，在今后的生物学和农业领域中，农杆菌转化法会继续发挥重要的作用。
农杆菌介导高等植物基因转化的影响因素
农杆菌介导高等植物基因转化的影响因素刘石泉 余沛涛 (上海师范大学生命与环境科学学院)关健词 农杆菌 高等植物 基因转化 影响因素 简述了近年来农杆菌转化的基本原理和载体系统的进展,同时着重阐述了不同属性农杆菌、不同植物基因型和外植体、不同再生植株的细胞起源、不同培养方法、不同药物选择以及在叶绿体与细胞核中转化等因素影响农杆菌介导高等植物基因转化,以及这个研究课题的进展现状. 转基因产品目前已引起了国内外各界的广泛关注.面对目前全球已有近4000万公顷种植面积的转基因作物[1],市场上有近4000种转基因食品[2],预计每年转基因作物的产值为100亿美元以上[3].转基因技术已经在200多种植物中获得成功,特别是转基因棉花、水稻、大豆、玉米、烟草、蔬菜等均已在生产上发挥了重大作用[4].利用转基因技术可以冲破物种界限,实现种间遗传育种,并改良现有的物种性状,具有不可估量的前景.一、农杆菌转化的基本原理 农杆菌(Agrobacterium)是一种天然的基因转化系统.农杆菌分为根瘤农杆菌(A.tumefacious)和发根农杆菌(A.rhizogenes).根瘤农杆菌中含有肿瘤诱导质粒(T i),其上含有可转移DNA(T-DNA)区、毒性区(Vir区)以及冠瘿碱代谢基因编码区.T-DNA两端是两个25bp的重复序列,分别称为左边界和右边界,两个边界序列之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因.Vir 区中含有多个基因段,如VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH等,每个基因段都含有多个基因.当植物受到伤害时,分泌含有酚类化合物的汁液,如乙酰丁香酮等,这些酚类化合物一方面通过染色体毒性基因(chvA、chvB 等)介导的催化作用促使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于植物细胞表面;另一方面则被T i质粒上由VirA 和VirG组成的双组分调节系统识别,从而诱导其他Vir 基因的表达.VirD1和VirD2共同作用,由T-DNA右边界开始向左边界切割产生一条T-DNA单链(T-链),T -链5’末端与一分子VirD2结合,其余部分与VirE2结合,组成T-复合体.T-复合体被转移到农杆菌外,通过植物细胞壁上VirB蛋白组成的通道进入到植物细胞内. VirD2和VirE2上的核定位信号被转运蛋白识别,经主动运输过程通过核孔进入细胞核内,在VirD2的帮助下,插入植物核染色体中,完成T-DNA由农杆菌向植物的转移及整合过程[5]. 发根农杆菌的转化过程与根瘤农杆菌类似,只是其中含有的质粒称为根诱导质粒(Ri),其中T-DNA区同样含有与发根农杆菌生成有关的植物激素的合成基因及冠瘿碱合成基因. T-DNA区内的基因表达调控序列与真核生物类似,因而可以不在农杆菌中表达,而在植物中表达.T-DNA整合进入植物细胞染色体后,其中的生长素和细胞分裂素合成酶类基因表达,导致植物细胞大量增殖,形成肿瘤.随着被转化细胞的增殖,T-DNA也被大量扩增,冠瘿碱合成酶类基因拷贝数也随之增加,从而可以合成越来越多的冠瘿碱.冠瘿碱是农杆菌的主要碳源和氮源,其他土壤微生物不能代谢,从而使农杆菌在自然界中为自己赢得了独立的生存空间.二、农杆菌转化系统的发展1.菌株的改造 农杆菌根据转化能力的强弱可分为超毒菌株和普通菌株.超毒菌株是H ood等[6]报道的,他们利用双元载体策略,对农杆菌菌株A281进行了改造.他们构建了两种质粒,一种含有pT iBo542的T-DNA区,另一种含有pT iBo542的其余部分(即pEHA101).进一步的研究结果是从pT iBo542衍生出了两种转化系统:一种是超毒菌株,如EHA101,EHA105;另一种是超双元载体.K omair[7]从pT iBo542中构建了pT OK162超双元载体,并由它衍生出Ptok233.超毒菌株和超双元载体系统后来被人们广泛使用.2.载体系统的发展 天然的T i质粒含有与冠瘿碱代谢有关的基因,T-・61・DNA区内含有生长素和细胞分裂素基因,这些基因在实际应用中是多余的或不利的,因而必须对之改造,方能应用于实际转化操作. 首先是卸甲T i质粒的发明.Z ambryski等[8]将T i质粒T-DNA区中导致肿瘤生成基因去除,制成了卸甲的T i质粒,并将其T-DNA区转入到了植物中.利用卸甲T i 质粒可以使材料转化处不再生成肿瘤,从而获得转基因植株. 农杆菌载体系统分为共整合载体系统和双元载体系统.共整合载体系统包括两个质粒:一个是在农杆菌中T i质粒,含有Vir区和T-DNA区;另一个是在大肠杆菌中的中间载体,可以在体外进行操作.将目的基因插入其中,通过三亲交配实验,在含有辅助质粒的第三种菌株的帮助下,促使大肠杆菌中的中间载体通过结合过程进入农杆菌. Vir区和T-DNA是反式作用的,二者置于两个质粒上而不影响二者的相互作用.根据这一原理,人们构建了双元载体系统,它由两个质粒组成:一个置于农杆菌中,含有Vir区;另一个含有T-DNA区.这个质粒可以作得比较小(10kb左右,因而能利用大肠杆菌方便地进行体外操作.第二个质粒可以通过液氮冻融高效地转入农杆菌中.利用双元载体系统,可以实现载体和任意农杆菌的搭配,有利于找到高效的转化组合. 另外,K omari等[9]发展了另一种双元载体系统.他们把抗生素基因和G US基因分别放在两个T-DNA区上,将两个T-DNA区构建到同一个质粒中.利用含有这个质粒载体的农杆菌LBA4404转化烟草和水稻,两个基因的共转化频率为47%,只含带G US基因T-DNA区和只含带抗生素抗性基因T-DNA区的植株占被转化植株的一半以上.这有助于解决抗生素抗性基因存在于转基因植物中的问题,获得只含有目的基因、屏弃了抗生素抗性基因的转基因植株.3.植物农杆菌转化的发展 农杆菌的天然寄主是双子叶植物,植物的农杆菌转化也就由双子叶植物开始,并取得了一系列成功.已有多种双子叶植物,如烟草、马铃薯、番茄、茄子、大豆、甜菜、拟南芥菜以及十字花科芸薹属植物等被转化成功.对于双子叶植物而言,农杆菌的转化是比较容易的,但是,农杆菌介导的单子叶植物的转化直到20世纪90年代之后才取得一系列进展.目前已经转化成功的有石蒜科、百合科、鸢尾科、薯蓣科和禾本科的植物[5].三、影响农杆菌介导植物基因转化的 因素 Dandekar等[10]在对胡桃的研究中和Martin等[11]在对葡萄的研究中认为影响转化效率的两个重要因素为:用于转染的农杆菌菌株和目标植物受侵染的部位.实际上,农杆菌介导的遗传转化有两个关键过程:农杆菌侵染转化材料及转化材料的再生.各种因素对于转化效率的影响都可以归于对这两个过程的影响,而这两个过程需要相辅相成.下面就影响上述两个过程的诸多因素有关研究进行分析.1.不同属性农杆菌对转化的影响 农杆菌作为植物基因转化的工具,其属性对转化的成功有决定性的影响,这也是长期以来在转化过程中将研究重点放在选择和处理农杆菌的原因.农杆菌依其代谢冠瘿碱的种类可分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型等类型,不同的菌种会影响基因转化的效果. 由于农杆菌T i质粒上Vir区编码产物负责接受外界信号、T-DNA的加工、转移及整合等功能,所以该区对菌种的侵染力起决定性作用,因此,农杆菌Vir基因的表达及表达水平的高低直接影响到转化,这也是到目前为止对农杆菌的研究热点仍然集中在Vir基因及其编码产物上的原因. 植物受伤细胞分泌的某些酚类化合物对农杆菌Vir 基因的表达有诱导作用.目前广泛使用乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮及植物细胞培养液来诱导农杆菌,并在一些转化中取得好的转化效果[12,13].已有实验表明,一些自身不能产生对Vir基因具有高效诱导的酚类化合物的植物,使用乙酰丁香酮能产生较好的效果.同样,在共培养时间短、难以诱导Vir基因表达的情况下,酚类物质的使用可能会产生良好的效果[14].乙酰丁香酮的使用还可以减小植物基因型的差异[15].而在另一些植株的转化上,如草莓等,乙酰丁香酮的使用无效甚至有害[16]. 其他物质对Vir基因有诱导作用,如肌醇[17]、非代谢糖类(2-脱氧葡萄糖、6-脱氧葡萄糖[18]等).采用渗透保护剂甜菜碱和脯氨酸也可以诱导Vir基因的表达[19].此外,不同菌种Vir基因的诱导效果还与诱导培养基的pH有关[20]. 一般说来,农杆菌Vir基因诱导必须注意以下几点:①诱导培养基pH介于5～6之间.②农杆菌培养温度应在28～30℃.③避免在培养基中含有酵母提取物.・71・④培养基中需含有较高的糖浓度.2.植物基因型及外植体对转化的影响 大多数农杆菌能侵染多种植物,但其侵染性因植物种类而不同,有的甚至局限于某种植物的某种基因型.一般认为,基因型的特异性与细胞的生理状态有关,所以在进行转化之前必须对植物的基因型进行选择.在莴苣、拟南芥、马铃薯的转化中,基因型的差异表现比菌种的差异大.来源于植物的不同外植体及同一外植体的不同发育阶段对农杆菌的侵染具有不同的敏感性.总的说来,分生组织及伴有活跃细胞分裂的外植体对农杆菌的侵染最为敏感.幼叶、幼胚、茎尖顶端分生组织、小孢子、愈伤组织、悬浮细胞培养物等均可作为外植体.一般认为,幼嫩的外植体比老的外植体好.杨广东等[21]以大白菜3d苗龄带柄子叶为外植体,经根癌农杆菌介导,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入大白菜自交系“G P-11”和杂交种“中白4号”,并获得了对菜青虫具有一定抗性转基因植株.欧阳波等[22]通过根癌农杆菌介导转化番茄下胚轴,将外源双价基因导入番茄,获得了一批卡那霉素抗性苗.研究表明,番茄下胚轴是良好的遗传转化受体.烟草细胞看护培养能够提高外植体的转化效率和减少农杆菌对外植体的污染.从实际情况看,农杆菌感染外植体主要在切口部位,即使较老的外植体,其切口细胞受伤后,在内外源激素的作用下,转化成具有分生能力很强的细胞团.例如,有些外植体经预培养后,由于植物细胞启动脱分化,再与农杆菌共培养,对农杆菌侵染的敏感性增强,其受农杆菌侵染的细胞年龄就不能依据其外植体进行判断.当然对于外植体的发育阶段的确定是必要的.张建全等[23]对马铃薯反义AcInv基因,经农杆菌介导入生产上推广的9个普通四倍体栽培种,对影响转化的各个因素进行了优化研究.结果表明,在愈伤组织诱导过程中,外植体的预培养为:茎段2d,叶盘3d效果较好;茎段和叶盘侵染时间分别达8min和10min时转化率较高;外植体与农杆菌共培养时间分别为2d和3d时,茎段和叶盘的转化率较高;各个品种的外植体在卡那霉素抗性培养基上均能形成愈伤组织,但只有1号(“大西洋”)最后从愈伤组织上产生苗,形成正常植株,其再生率为11.2%,聚合酶链反应(PCR)扩增检测表明,大部分转基因植株为阳性.另外判断某种植物对农杆菌侵染的敏感性,不能纯粹以一种或几种外植体来判断,必须研究尽可能多的外植体类型.以木薯胚状体萌发出的子叶为外植体,获得很高的瞬时表达[24].从组培角度来讲,所选的外植体必须具有较高的分生能力、脱性强的细胞.3.再生植株的细胞起源对转化的影响 成功转化的关键是将外源基因导入那些具有脱性强的细胞.农杆菌介导的转化方法主要作用于表层细胞,如果细胞起源于深层,则很难得到转化株,即使得到转化株,其转化频率也很低,且转化株表现为嵌合体,这就是所谓再生与转化的矛盾.在油菜的转化中Mukho2 padhyay[25]等发现以胚轴切段为外植体很容易得到转化体,而以子叶为外植体则相当困难.解剖学研究表明,同样起源于维管束薄壁细胞的芽的发生方式有两种:一种是位于切面的维管束薄壁细胞先产生愈伤组织,然后产生芽;另一种是芽直接离从切面450～625μm的维管束细胞不经愈伤而直接形成芽.以胚轴切段为外植体,两种再生方式都存在,而只能以第一种方式获得转基因植株.而以子叶为外植体,只能通过第二种方式再生植株,从1000个外植体中只得到两株嵌合的转化株.以此推测,在子叶外植体中,由于具有再生能力的细胞团距离切口较远,细菌较难感染这些细胞,因而影响转化株的获得.柳建军[26]等研究建立了一套简单、高效的辣椒遗传转化系统.利用根癌农杆菌介导的带柄子叶转化法将豇豆胰蛋白酶抑制剂(C pTI)基因转入辣椒栽培品种益都羊角椒中获得转C pTI基因植株.杨广东[27]等以12～14 d苗龄的甜椒带柄子叶为外植体,经根癌农杆菌介导,将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入甜椒杂交种“中椒5号”和常规种“茄门”中,室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明,转基因植株对棉铃虫具有一定抗性.木薯的转化中,幼叶外植体切口细胞对农杆菌比较敏感,且能从幼叶诱导高频的胚状体的发生,但以此系统为基础的转化没有得到转化株,其原因是切口部位受细菌感染的细胞,只能呈现愈伤生长,而胚状体起源于离切口一定距离的内层维管束细胞,细菌难达到这些细胞,因而也难得到转化株[28].4.培养方法对转化的影响 转化所用的组培不同于纯粹的组织培养方法.农杆菌介导的转化要经过几个步骤:外植体接种农杆菌、与农杆菌共培.外植体在含抑制农杆菌及筛选转化体的药剂的培养基上培养,要受到农杆菌和药剂的胁迫.因此为保证转化细胞的生长,必须:①合理掌握接菌的数量、时间和共培的时间,注意解决瞬时表达效率高及随后而来的细菌增殖所导致的外植体不能生长的矛盾.有些植物外植体生长易受农杆菌侵染后的抑制,还有些嫩的外植体经农杆菌侵染后不能生长[29].②采用预培的方法以减轻伤害胁迫,调整细胞状态.预培养还有可能减少・81・伤害胁迫而有利于农杆菌的感染[23].③采用化学药剂缓解胁迫对外植体生长的抑制.硝酸银是抑制乙烯生成的抑制剂,具有促进形态发生的功能,所以在油菜转化的培养基中加入较高浓度的硝酸银(70～90nm olΠL)就能提高再生频率,且是在选择条件下获得转化体的必要条件[25].在葡萄的转化中,旺盛生长的胚性愈伤组织在接种农杆菌后,生长受抑制,组织褐化以至细胞死亡,据测试,这是细胞的过氧化造成的.后来有人用抗氧化剂DTT (dithiothreitol)和PVPP(polyvinypolypyrrolidone),可使被侵染的细胞恢复生长,有高达63%的外植体能产生胚状体,进而获得转化株[29]. T aylor等[30]通过改变木薯次生胚状体诱导的培养基,以G D基本培养基代替MS培养基,以Picoram代替2、4-D,经反复继代,获得一种脆性愈伤,以这种愈伤为外植体,采用基因枪法获得了转化株[31].以木薯体细胞胚状体萌发出的子叶为外植体能诱导器官发生并再生植株,且由于细胞源于切口及其附近部位[32],采用结合农杆菌介导的转基因方法业已成功地获得了木薯的转基因株[24].5.不同选择药物对转化效率的影响 由于在植物基因转化中,外源基因稳定的整合频率低,故如何选择适当的筛选标记,以准确、有效地分离转化与非转化细胞,且不干扰细胞的正常生长,也不干扰再生植株的产生,是转化成功的重要环节之一.转化常用的筛选标记有:新霉素磷酸转移酶(NPTII)、潮霉素磷酸转移酶(HPT或HPH)、PPT乙酰基转移酶(PAT)及二氢叶酸还原酶(DHFR)等基因. 杨广东等[33]在培养基中添加不同浓度的卡那霉素、头孢霉素和羧苄青霉素,观察抗生素对大白菜基因型G P -11种子发芽以及离体子叶再生的影响.结果表明,G P -11种子在含有200mgΠL卡那霉素的MS培养基上发芽生长时,幼苗子叶完全黄化,侧根数为0;随卡那霉素浓度的增加,芽、主根和侧根生长均受到一定程度抑制,但发芽率和发芽势不受影响.4d苗龄的离体子叶在含有10mgΠL卡那霉素并附加一定激素的改良MS培养基生长时,基本无绿芽诱出,在含7.5mgΠL和5mgΠL卡那霉素的培养基中,诱导的绿芽率只有32.5%和40.2%;在仅含3mgΠL卡那霉素的生根培养基中,小苗完全丧失生根能力.在添加浓度高至400mgΠL的头孢霉素或羧苄青霉素的诱芽培养基中,G P-11诱芽率为0,且它们之间差异不明显,但在添加头孢霉素或羧苄青霉素的生根培养基中,小苗生根依然正常.试验结果表明,在农杆菌介导的基因转化中,对大白菜转化苗筛选的卡那霉素浓度在10mgΠL左右是适宜的,添加的抑菌剂浓度在能控制农杆菌生长的同时,尽量降低浓度,最好不超过400 mgΠL;在诱导生根培养基中,卡那霉素浓度不宜超过3mgΠL.另外,对T0代转基因种子进行遗传分析时,在发芽培养基中添加卡那霉素浓度应该达到200mgΠL. NPTII作为一种选择标记基因,可用于多种作物的转化,其中筛选中常用的抗生素为卡那霉素和geneticin.某些单子叶植物能耐高浓度的卡那霉素,一般用geneti2 cin进行筛选.然而玉米的转化以200mgΠL的卡那霉素筛选时,仍能得到转化株[34].在水稻的转化中,卡那霉素筛选会干扰绿色植株的再生,而用庆大霉素则得到转化的绿苗,绝大多数对潮霉素比对卡那霉素敏感,潮霉素用于禾谷类作物的转化比卡那霉素效果好.PAT可用于单子叶植物及双子叶植物的筛选.植物细胞对叶酸类似物MTX(metholtreate)非常敏感.该化学物质主要抑制植物DHFR,而从大肠杆菌质粒R67分离得到的DHFR对MTX不敏感,将该基因转入烟草细胞后,再生的植株能抗MTX.采用该选择标记已获得小麦的抗MTX转基因株[35]. 另外,为了证实已经获得转基因植株,近几年人们一般不只是单一地采用抗生素标记,而是结合其他手段予以证实.如杨广东等[21]将修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)导入大白菜自交系“G P-11”和杂交种“中白4号”,并获得了卡那霉素抗性植株.PCR检测和S outhern blot杂交证实,sck基因已整合进大白菜基因组中;豇豆胰蛋白酶抑制剂活性检测表明,大部分转基因植株都对牛胰蛋白酶有一定的抑制活性.室内离体叶片饲虫和田间自然抗虫性鉴定进一步证明,转基因植株对菜青虫具有一定抗性.武东亮等[36]构建了人工合成的G FM CryIA 杀虫基因和经过修饰的C pTI基因的融合杀虫基因高效植物表达载体p G BIF4ABC.通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得42株卡那霉素抗性植株,用棉铃虫杀虫实验检验表明具有抗虫性.对其中7株烟草植株进行PCR 和S outhern印迹,4株烟草基因组中有融合杀虫基因的整合,为转基因植株.其中2株的抗虫性为高抗,1株中抗,1株不抗.6.叶绿体转化与细胞核转化的不同影响 近20年来,外源基因向核中转化一直是转基因的主要方向,然而,随着研究的不断深入,人们发现核转化有很多弊端,如核基因组大、背景复杂,外源基因整合位点和整合拷贝数难以控制,易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象[37].自1988年有些学者相继开展了叶绿体遗传转化研究,使这项新的遗传转化技术的优越性・91・和发展前景日益为人们所认识并受到重视.到目前为止,已经在烟草[38]、水稻[39]、拟南芥[40]、马铃薯[41]和油菜[42]等植物中实现了叶绿体的转化,这一转化系统已开始成为植物基因工程中的新的生长点.四、结束语 农杆菌是天然的遗传工程师,自1983年被首次用于烟草基因转化以来,农杆菌已经广泛应用于高等植物的转化.目前由农杆菌介导的转基因植物已扩展到经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、水果、树木及牧草等,有些已经实现了商品化,在改良植物的遗传性状方面发挥了重要作用[43].但是,农杆菌转化外来基因到植物体内是一个复杂的过程,目前有一些重要的作物或者它们的重要品种仍然不能用农杆菌来转化,或者转化效率太低.可以预见,随着对农杆菌感染机制的进一步阐明,影响农杆菌转化的因素进一步明朗化,人们按照自己的愿望设计未来作物将不再是梦想,遗传转化技术在植物分子改良以及分子生物学的研究中,也将会有更多的应用、更多的新突破.(2002年7月4日收到)刘石泉 硕士生,上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234余沛涛 副教授,上海师范大学生命与环境科学学院,上海2002341 刘谦,朱鑫泉.生物安全.北京:科学出版社,2001:452462 M etcalfe D.D.,Astw ood J.D.,T ownsend R.,et al.Assessment of the allergenic from genetically engineered crop plant.Critical Reviews in Food Science and Nutrition,1996;36:S16521863 S imm M.G erman geneticists get s ome relief.Science,1994;263(7):23 4 陈祯.高等植物转基因研究.生物学通报,2002;3(8):6285 徐春晖,夏光敏,贺晨霞.农杆菌转化系统研究进展,2002;14(4): 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农杆菌如何介导植物遗传转化
农杆菌如何介导植物遗传转化？植物遗传转化技术植物遗传转化技术也称植物转基因技术，是应用DNA重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术。
目前最常用的转基因方法是基因枪法和农杆菌法。
基因枪法的基本原理是利用表面附着有外源DNA的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA的目的。
但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、遗传稳定性较差、外源DNA整合机理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。
接下来，这篇文章着重介绍农杆菌介导的植物遗传转化。
优点农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于纯生物学的过程，与其它转化方法相比具有明显的优点，主要包括：(1)转化频率高；(2)可导入大片段的DNA，且导入植物细胞的片段确切；(3)导入基因拷贝数低，大多只有1-3个，表达效果好，能稳定遗传，多数符合盂德尔遗传规律。
而且，从大量的报道可以发现，农杆菌的寄主范围有很大的扩展，已经延伸到了原核生物、真菌甚至人类细胞等非植物领域。
原理农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，它对寄主细胞的转化是借助诱导瘤细胞(tumor-inducing, Ti)质粒将其中一段特定的DNA片断转入寄主细胞基因组的过程。
在自然环境中，被转移的DNA (T-DNA)携带了一套致瘤基因和冠瘿碱代谢基因，它们在植物中的表达可引起被侵染组织产生肿瘤并合成冠瘿碱作为细菌的氮源。
利用分子克隆技术可以将T-DNA替换为目标基因，使农杆菌成为一个能有效将外源基因导入植物的天然工具。
图1 农杆菌介导的基因转化。
此外，有多种植物蛋白质也参与了农杆菌介导的基因转化过程，主要作用于T-DNA胞内运输、进入细胞核以及整合阶段。
因为农杆菌主要利用植物细胞内的生物过程(例如DNA和蛋白质运输、靶蛋白水解和DNA修复)来转化其受体，研究这些基本的植物细胞生物学机制有助于扩大农杆菌的受体范围，同样也可促进转化过程和转基因植物的产物控制。
影响农杆菌介导大豆遗传转化效率因素的研究的开题报告
影响农杆菌介导大豆遗传转化效率因素的研究的开题报告1. 研究背景与意义大豆是我国重要的农作物之一。
利用遗传转化技术，可以将优良的农艺性状和新的基因导入大豆中，以提高其产量和营养价值。
目前，农杆菌介导的遗传转化技术是大豆遗传转化的主要方法之一。
然而，在农杆菌介导的大豆遗传转化过程中，效率较低，调控机制也不明确。
因此，研究影响农杆菌介导大豆遗传转化效率的因素，对于提高大豆遗传转化的效率和成功率具有重要的理论和应用价值。
2. 研究内容与目标本研究旨在探究影响农杆菌介导大豆遗传转化效率的因素，主要内容包括：（1）不同处理方法对大豆遗传转化效率的影响：通过比较不同处理方法，如不同植物生长阶段、不同试管转化条件等对大豆遗传转化效率的影响，选取最优条件。
（2）农杆菌菌株对大豆遗传转化效率的影响：比较不同农杆菌菌株对大豆遗传转化效率的影响，选取最优菌株。
（3）生理因素对大豆遗传转化效率的影响：探讨大豆生长阶段、激素的诱导等生理因素对大豆遗传转化效率的影响。
3. 研究方法与技术路线（1）选择不同生长期的大豆幼苗为转化材料，分别进行不同激素处理或不同试管转化条件下的农杆菌介导遗传转化实验，比较转化效率。
（2）比较不同农杆菌菌株在相同条件下的大豆遗传转化效率，选取最优菌株。
（3）通过测定大豆生长期的生理变化和激素含量，研究生理因素对大豆遗传转化效率的影响。
4. 预期结果与意义本研究预计可以筛选出最优的大豆遗传转化条件和最优的农杆菌菌株，探讨大豆生理因素对遗传转化效率的影响，为提高大豆遗传转化的效率和成功率提供理论依据。
这对于大豆产业的发展，以及基因工程领域的研究和应用，具有重要的意义。
农杆菌转化的原理和方法
农杆菌转化的原理和方法我折腾了好久农杆菌转化这事儿，总算找到点门道。
咱先说农杆菌转化的原理哈。
农杆菌就像一个小快递员，它有一种特殊的能力能把自己身上的一些东西，也就是我们要导入植物细胞的目标基因，运到植物细胞里面去。
为啥它能这样呢，是因为农杆菌里面有个叫Ti 质粒的东西，这Ti质粒就像它的一个工具包，里面有一段特别的DNA，可以和植物的基因组整合到一起，就很神奇。
再说说我试的那些方法。
一开始我真的是瞎摸索，我把植物材料，就比如说叶片，切得一块一块的，就像切菜一样。
然后把它放到含有农杆菌的溶液里，我以为这样就行了，可结果啥也没转化成，这就是失败的教训。
后来我才知道，处理植物材料之前还得给它做些准备工作呢。
要先对植物材料消毒，这个消毒就和咱们在家消毒碗筷有点像，得把表面乱七八糟的细菌啥的都消灭干净，要是不处理好，可能农杆菌的转化就会被影响，同时别的杂菌还可能在这个过程中捣乱。
再就是农杆菌这一块，不是随便抓来就能用的。
得调整农杆菌的状态，让它处于最有活力最适合转化的时候。
我就试过好多不同的培养条件，就像试不同泥瓦匠干活时候的环境一样。
温度、营养物质的量，我都调整过很多次。
有时候温度高一点，农杆菌就长得太快了，都有点控制不住，转化效果也不好；有时候营养物质少了，它没有力气去干这个转化的活了。
然后就是怎么让农杆菌和植物细胞接触这个过程。
我知道得让植物细胞有一定的伤口，农杆菌才能趁机把它的东西送进去。
我开始弄这个伤口的时候，下手太重了，把植物细胞都给弄太受伤了，结果细胞都死了不少，也没法完成转化。
后来总结经验，就像我们打针一样，要轻轻的，恰到好处，让植物细胞有一个小的创口就好。
再就是筛选这个步骤。
因为不是所有的植物细胞都能成功转化，就像不是所有人都能中奖一样。
得加一些特殊的东西，比如抗生素或者标记基因对应的筛选物质，来找出那些成功导入基因的植物细胞。
我刚开始搞不清浓度和用量，加了太多抗生素，结果很多本可能转化成功的细胞也被杀死了。
农杆菌转化机理
农杆菌转化机理农杆菌是从土壤中分离出来的革兰氏阴性细菌，根据宿主范围和致病症状可分为5种，其中研究最多也最透彻的是根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)，它能将自身Tumor—inducing(Ti)质粒的一段DNA(T-DNA)转移到植物细胞中, 从而使植物损伤部位形成冠瘿瘤。
T-DNA的转化是在Ti质粒上Vir区一系列Vir基因的作用下产生的.T— DNA 是质粒上一段10~30 kb的序列, 编码5个与致瘤有关的生长素和细胞分裂素合成酶基因。
其左右边界各有一段高度保守的25 bp的同向重叠序列(Direct repeat)与T—DNA的转化有关.其中右边界是VirD2的共价结合序列及VirD1/VirD2内切的靶序列, VirD2与右边界的共价结合及邻近右边界的过度驱动(Overdrive）序列导致了单链T-DNA由右边界剪切并转移的极性，而VirD2与左边界的结合可能导致了载体骨架序列的转移.农杆菌侵染时, 在单糖转运蛋白ChvE的配合下，双元组分系统的VirA作为感受信号的天线分子受到植物伤口产生的酚类物质和糖类的诱导而自动磷酸化, 并且随后使双元组分系统的另一组分VirG磷酸化为活性状态, 进而通过vir-box激活其他Vir基因的表达, 最后由VirD1/VirD2剪切的单链VirD2—T—DNA复合体由VirB和VirD4蛋白组装成的Type IV Secretion System(T4SS）运送到宿主细胞, 另外的几个Vir蛋白VirE2、VirE3、VirF、VirD5也同时通过这个通道运送到宿主细胞质中.VirD2—T-DNA复合体在进入宿主细胞质中不久, VirE2就结合上去，通过VirD2核定位信号的引导并在几个宿主蛋白和农杆菌因子的协助下向细胞核转运，最后结合在T—DNA上的蛋白被降解,而T-DNA通过一种尚不清楚的机制整合到宿主基因组中（图1)。
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二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。
根癌农杆菌含有Ti 质粒。
发根农杆菌含有Ri 质粒。
根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。
由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。
1 与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T-DNA 以外Vir 区的基因。
染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。
ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。
原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：（1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。
T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。
只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要．（2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。
（3）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。
（4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。
在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。
染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。
它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。
延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。
结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD，参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。
2 Vir 基因的诱导表达机制在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。
当农杆菌接受到此类信号时，其vir 区基因可被诱导转录。
另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖，As 和单糖可协同诱导Ti 质粒上vir 区基因的表达。
Vir 区基因的活化首先是从virA 基因开始的。
VirA 蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白，可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。
VirA 蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG 蛋白活化。
VirG 蛋白是DNA 结合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到vir 启动子的特定区域，从而成为其它vir 基因转录的激活因子，打开VirB、virC、virD、virE、virH 等几个基因。
ChvE 可大大增强vir 基因被As 诱导的效果，ChvE 可结合一些单糖，也可直接与VirA 周质区相互作用，以加强As 对Vir 基因的诱导。
3 T-DNA 复合物的形成T-DNA 的加工与转移是由Vir 基因被诱导后产生的蛋白完成。
VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2直接参与加工过程。
VirD1 蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA 变成松弛型DNA。
VirD2 蛋白具有特异剪切单链DNA 的内切酶活性，它可以识别T-DNA 底链边界重复序列上的特定位点，并在底链24 bp 重复序列和第四个碱基之间切割，将T-DNA 从Ti 质粒上剪切下来，称为T-strand 或T-链。
切开T-DNA后，VirD2 蛋白与T-链的5，端共价结合，避免核酸外切酶降解T-链。
新的T-DNA 底链以此链为模板，从右端产生的DNA 缺口处以5’-3’方向进行合成。
被取代的旧链游离出来，与许多VirE2 蛋白分子结合组成T-DNA 复合体。
此外，VirD2 作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA 复合体（或叫T-复合体）从农杆菌进入到植物细胞核。
4 T-DNA 复合物的跨膜转运农杆菌的T-DNA 转移通道由多达12 种蛋白组成，包括两个主要部分：纤毛附属丝（或纤毛）和膜结合复合体。
该通道也可称为T-复合体运输器，由virB 编码的11 种蛋白和VirD4 蛋白组成。
VirB1可在细菌膜上为T-复合体运输器的装备提供位点；VirB2 和VirB5 可被移动到细胞表面形成纤毛；其余的VirB、VirD4 为T-复合体的运输提供能量。
合成的T-复合体经过T-复合体运输器，以类似于细菌转导过程的方式注射到植物细胞内，并在VirD2 和VirE2 的核定位信号（NLS）序列引导下，以VirD2为先导向植物细胞核运动。
在人工构建的质粒中，vir 基因和T-DNA 可以放在同一个质粒上，也可以放在不同的质粒上。
影响转化效率的因素1、菌株染色体背景不同农杆菌株的类型的chv基因决定了其对受体细胞的识别和附着能力的差异。
根癌农杆菌的胭脂碱型和琥珀碱型生长快、不结球，转化易于操作，但共培养时菌体附着能力较差：章鱼碱型则生长慢、易结球，转化难于操作，但共培养时菌体附着后不易洗去。
2、共培养方式农杆菌转化的共培养介质可以是细菌培养基或植物受体培养基。
烟草等对农杆菌侵染比较敏感的植物的共培养时间一般较短，液体细菌培养基介质应用较多。
许多单子叶植物等不敏感植物受体与农杆菌共培养时间一般较长，用细菌培养介质容易造成农杆菌过度繁殖，导致植物外植体呼吸作用抑制和细菌分泌物毒害，因此多采用液体植物培养基作为共培养介质。
3、侵染浓度和时间农杆菌适宜的侵染浓度和时间因外植体对侵染的敏感性不同而有很大差异。
浓度过高、时间过长会引起农杆菌细胞间的竞争性抑制，而且过度增殖会抑制受体细胞的呼吸作用；浓度过底、时间过短则造成受体细胞表面农杆菌附着不足。
禾谷类作物一般侵染浓度较高，Hiei用LBA4404(pTOK233)转化水稻的最佳接种浓度为OD600=0.8~1.0， Ishida 用LBA4404(pSB131)转化玉米幼胚采用的侵染浓度为OD600=2.0；但烟草、大白菜等对侵染敏感的双子叶植物要求菌体浓度要低的多,一般为OD600= 0.5。
4、共培养条件（1）共培养温度农杆菌在20~30℃的范围内都可以生长，不同研究结果中vir区基因表达的适宜温度有一定差异，但多数在20~25℃获得较高的表达水平[]。
外植体生长温度也一般在此范围内，所以通常选取外植体的最佳生长温度为共培养温度，通常在25℃左右。
（2）共培养PH值研究人员普遍认为酸性培养环境有利于农杆菌的侵染。
因为植物细胞释放的对农杆菌有趋化作用的化学物质（如酚类、糖类）虽然在不同酸碱度下比较稳定，但在pH=5.0~5.8时对vir基因的诱导能力最高。
（3）诱导物和抑制物酚类是vir区基因表达的主要信号物质。
酚类物质产量低一度被认为是影响农杆菌转化，特别是单子叶植物转化的主要原因之一。
在众多的酚类物质中，乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮诱导能力较强，AS的促进效果与菌株类型、植物材料种类和共培养培养基的pH值有关。
没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚、儿茶酚、对羟基苯酚等多酚混合处理农杆菌也有很高的作用，但不同酚类物质是否有累加效应在不同研究结果中不近相同。
不同农杆菌类型对酚类物质的敏感性不同，根癌农杆菌的章鱼碱株系比胭脂碱系需要更高的酚类物质诱导，发根农杆菌的农杆碱型比甘露碱型对酚类物质刺激的敏感性更低。
糖类等小分子,这些小分子一方面可作为化学源吸引农杆菌的趋化运动,另一方面可诱导或抑制农杆菌vir基因的表达。
而糖类的主要作用是与农杆菌染色体毒性蛋白ChvE结合,激活virA蛋白进而诱导vir基因高水平表达和扩大农杆菌的寄主范围。
特别在AS浓度很低的情况下,它们可强烈诱导vir基因的表达,并且与AS存在协同效应,可显著提高AS诱导效果。
糖类在不含酚类化合物的情况下效果较明显,但是糖类和酚类化合物同时存在时却没有明显的协同效应。
多胺也参与植物宿主和病原之间的相互作用。
Kumar等曾用多胺物质对农杆菌进行活化后侵染烟草做GUS瞬时表达研究,结果表明农杆菌的侵染活力显著提高。
（4）共培养时激素的添加、有无光照共培养培养基中添加生长素、细胞分裂素对转化更有利。
而光照的有无要是植物种类而异。
5、受体类型和生理状态不同基因型对农杆菌侵染敏感性有差异。
目前用过的受体材料有叶盘、叶柄、根尖根段、茎尖茎段、幼穗、花药、子叶（柄）、胚或其部分结构（胚轴）、芽等，可以看出分生组织是较通用的受体。
分生能力强的植物细胞对农杆菌敏感，活跃的细胞分裂促进了T-DNA的整合。
6、预培养培养基外植体进行共培养前,在含有外源激素的培养基上预培养一段时间,使植物组织代谢活跃,促进细胞分裂,分裂状态的细胞更易整合外源DNA,从而提高外源基因的瞬时表达和转化率。
有人认为,在预培养时降低钙的含量会促进农杆菌的侵染。
钙在对致病微生物抵抗方面起到重要作用,而钙的不足会引起细胞壁结构的改变,这种改变使农杆菌更容易附在愈伤上,增强农杆菌对愈伤的感染能力。
7、接种方式比较常用的接种方式是将外植体置于侵染液中浸泡,时间长短视菌种和外植体种类而异。
有的研究者在浸泡的基础上结合了振荡进行接种，振荡培养能打破细胞表面的气泡,使农杆菌与外植体的接触面增大,有利于农杆菌侵染。
近年来,在提高遗传转化效率方面发展了一些新技术,如超声波辅助农杆菌介导法、负压与农杆菌介导结合法以及基因枪与农杆菌介导结合法等,均可增强农杆菌浸染,提高转化效率8、感受态细胞保存条件有实验表明，农杆菌感受态细胞以新鲜制备时效果较好，农杆菌感受态细胞在4℃保存7 d以内时进行转化可以得到部分转化子，而用甘油保存置于-20℃和-58℃的感受态细胞转化效率较低。
不过应该根据自己的试验情况进行优化。