间接红细胞凝集试验诊断血吸虫病
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间接红细胞凝集试验诊断血吸虫病
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间接红细胞凝集试验 （Indirect haemagglutination test, IHA）
以红细胞为载体 吸附预先制备的特异性抗原或抗体作为试剂 检测标本中的相应抗体或抗原 血清学方法 特点：抗原与其抗体之间的特异性反应
红细胞凝集现象
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用含有5%蔗糖及1%正常兔血清（56℃灭活） 的pH7.2PBS保护液，配成10%浓度的致敏红细胞 悬液。
致敏效果与抗原的活性及纯度有关。
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（五）致敏红细胞的冰冻干燥
将上述致敏红细胞悬液摇匀，分装于2ml安瓿 内。每支0.4ml，立即放入-40℃冰箱冰冻，待全部 分装完毕后，移入冰冻干燥机内，冰冻干燥约24h， 干燥后封口，保存于4℃中备用。
（一）血吸虫虫卵抗原制备 分离虫卵→ 脱水、脱酯干燥→ 研磨成细粉 → 冻融→ 超声粉碎→ 普通离心→ 高速离心。 经离心后的上清液，即为虫卵抗原原液，保存于 -20℃中备用。
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理想抗原 敏感性高，特异性强，能区别不同感染度， 能区别现在感染还是过去感染，价廉。 但目前还没有，今后可能依靠杂交瘤技术、 DNA技术而获得理想的抗原。
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国外最早于1955年应用于检测马抗血清 国内陶义训等（1958）首先应用于诊断
日本血吸虫病 杨赞元等（1976）应用冰冻干燥方法
制备试剂
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3
一、基本概念
（一）凝集反应 是指细菌、细胞等颗粒性抗原加入相应抗体， 并在适量电解质存在的条件下，两者特异性 结合且进一步凝聚成肉眼可见的小块。
冰冻干燥具有高科技含量不是单纯干燥，在冰 冻状态下使水分子升华，不使红细胞破裂，不影响 抗原活性。
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三、操作步骤
（一）取生理盐水2ml，加入装有冰冻干 燥红细胞的安瓿中，配成2.0%的红细胞 悬液，摇匀。 （二）在“V”型微量血凝反应板的第1孔 中加生理盐水100μl, 第2、3孔中各加25μl。
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（三）间接血凝的类型
IHA：用抗原致敏红细胞检测标本中抗体 反向间接血凝试验：用特异性抗体致敏红
细胞检测标本中的相应抗原 间接血凝抑制试验 反向间接血凝抑制试验
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（正向）间接凝集反应
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反向间接凝集反应
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间接凝集抑制反应
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二、冻干致敏红细胞的制备
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（五）生理盐水：用于稀释IHA试剂、阳 参、阴参、血清样本的生理盐水必须保持 无菌。
（六）判断反应结果：在判断反应结果时
应在反应板下面衬一张白纸，使反应结果
更加清晰。先观察空白对照、阴参、阳参，
再观察样本。
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六、评价
IHA的优点： 敏感性高，阳性符合率在90%以上，对粪检阳 性者可高达95%，假阳性率一般不超过4%。 操作方便，用血量少，便于现场使用。 试剂生产方便，成本低，符合国情。 IHA的缺点： 特异性欠强、与其它吸虫有较高的交叉反应。 交叉反应主要在肺吸虫感染，可达50%以上。
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四、反应标准
（一）阴性反应：红细胞全部下沉在 凹底部，形成紧密的圆点，周围整齐 清晰。 （二）阳性反应：待检者血清以1:10 稀释度出现凝集反应为阳性起点
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（三）反应强度 “-”：红细胞全部下沉在凹底部，形成紧密的 圆点，周围整齐清晰 “+”：多数红细胞下沉在凹底部形成圆点， 周围可见少量凝集红细胞 “++”：凹底部可见明显的红点，凝集红细 胞在底部形成小薄层
凝集反应分为直接凝集和间接凝集反应。
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（二）间接红细胞凝集试验
原理 日本血吸虫可溶性虫卵抗原 载体颗粒 绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞 致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，
只能使用2～3天 致敏前将红细胞醛化，可长期保存而不溶血 常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛
胞破裂、溶血
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（三）红细胞鞣化
取1/10000鞣酸溶液与等量2.5%红细胞悬液混 匀，置于37℃ 中15min，并不断摇动。洗涤， 去除多余的鞣酸。
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鞣化红细胞的优点 鞣化后红细胞易吸附蛋白抗原。
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（四）红细胞致敏
取虫卵抗原原液1:100稀释，与2.5%的鞣化红 细胞等量混合，置于37℃水浴中30min，并不断摇 动，然后离心，洗涤，去除多余抗原。
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七、实用价值
（一）可作为血吸虫病的辅助诊断。无血 治史者和治疗史3年以上者，IHA阳性可给 予扩大治疗。
（二）在血吸虫病流行区，可作为查病的 过筛方法。
（三）可作为血清流行病学调查及疫情监 测的方法
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谢谢大家！
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此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
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“+++”：凹底部可见很弱的红点，红细胞呈 疏松的颗粒凝集 “++++”：红细胞呈明显的颗粒凝集，均匀 散布于凹底部周围形成薄层，有时呈皱褶状
效价(滴度)：发生凝集现象最高的血清稀释度。
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五、影响因素及注意事
（一）试剂：保存、对照、效价、摇匀。 （二）反应板：“V”型，底角应为90°。 反复冲洗。 （三）毛细吸管：校正、垂直。 （四）血清样本：新鲜为宜，保存在冰盒 内。溶血样本将影响测定结果的准确性。
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（三）第1孔中加待检血清25μl，混匀后吸出 25μl加于第2孔中，在第2孔中混匀后，吸出 25μl加于第3孔中，混匀后弃去25μl。此时第 1、2、3孔中的血清稀释度依次为1:5 、1:10 、 1:20。
（四）在第2、第3孔中各加致敏红细胞悬液 25μl，将反应板放在振荡器上振荡1min，室 温下静置45min，观察反应结果。
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（二）红细胞醛化
取人“O”型血红细胞3份（不同个体） 混合 ，用生理盐水洗涤 。置冰浴内，将戊 二醛溶液慢慢滴入红细胞悬液中，边加边 摇，醛化1h。用1/10000的柳硫汞蒸馏水配 成10%的红细胞悬液，置于4℃备用。
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醛化红细胞优点 克服了个体差异，保证实验重复性 延长红细胞的保存时间，在4℃可保存1年 避免操作过程中因振荡、低渗、冻融使红细
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间接红细胞凝集试验 （Indirect haemagglutination test, IHA）
以红细胞为载体 吸附预先制备的特异性抗原或抗体作为试剂 检测标本中的相应抗体或抗原 血清学方法 特点：抗原与其抗体之间的特异性反应
红细胞凝集现象
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用含有5%蔗糖及1%正常兔血清（56℃灭活） 的pH7.2PBS保护液，配成10%浓度的致敏红细胞 悬液。
致敏效果与抗原的活性及纯度有关。
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（五）致敏红细胞的冰冻干燥
将上述致敏红细胞悬液摇匀，分装于2ml安瓿 内。每支0.4ml，立即放入-40℃冰箱冰冻，待全部 分装完毕后，移入冰冻干燥机内，冰冻干燥约24h， 干燥后封口，保存于4℃中备用。
（一）血吸虫虫卵抗原制备 分离虫卵→ 脱水、脱酯干燥→ 研磨成细粉 → 冻融→ 超声粉碎→ 普通离心→ 高速离心。 经离心后的上清液，即为虫卵抗原原液，保存于 -20℃中备用。
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理想抗原 敏感性高，特异性强，能区别不同感染度， 能区别现在感染还是过去感染，价廉。 但目前还没有，今后可能依靠杂交瘤技术、 DNA技术而获得理想的抗原。
2
国外最早于1955年应用于检测马抗血清 国内陶义训等（1958）首先应用于诊断
日本血吸虫病 杨赞元等（1976）应用冰冻干燥方法
制备试剂
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一、基本概念
（一）凝集反应 是指细菌、细胞等颗粒性抗原加入相应抗体， 并在适量电解质存在的条件下，两者特异性 结合且进一步凝聚成肉眼可见的小块。
冰冻干燥具有高科技含量不是单纯干燥，在冰 冻状态下使水分子升华，不使红细胞破裂，不影响 抗原活性。
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三、操作步骤
（一）取生理盐水2ml，加入装有冰冻干 燥红细胞的安瓿中，配成2.0%的红细胞 悬液，摇匀。 （二）在“V”型微量血凝反应板的第1孔 中加生理盐水100μl, 第2、3孔中各加25μl。
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（三）间接血凝的类型
IHA：用抗原致敏红细胞检测标本中抗体 反向间接血凝试验：用特异性抗体致敏红
细胞检测标本中的相应抗原 间接血凝抑制试验 反向间接血凝抑制试验
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（正向）间接凝集反应
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反向间接凝集反应
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间接凝集抑制反应
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二、冻干致敏红细胞的制备
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（五）生理盐水：用于稀释IHA试剂、阳 参、阴参、血清样本的生理盐水必须保持 无菌。
（六）判断反应结果：在判断反应结果时
应在反应板下面衬一张白纸，使反应结果
更加清晰。先观察空白对照、阴参、阳参，
再观察样本。
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六、评价
IHA的优点： 敏感性高，阳性符合率在90%以上，对粪检阳 性者可高达95%，假阳性率一般不超过4%。 操作方便，用血量少，便于现场使用。 试剂生产方便，成本低，符合国情。 IHA的缺点： 特异性欠强、与其它吸虫有较高的交叉反应。 交叉反应主要在肺吸虫感染，可达50%以上。
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四、反应标准
（一）阴性反应：红细胞全部下沉在 凹底部，形成紧密的圆点，周围整齐 清晰。 （二）阳性反应：待检者血清以1:10 稀释度出现凝集反应为阳性起点
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（三）反应强度 “-”：红细胞全部下沉在凹底部，形成紧密的 圆点，周围整齐清晰 “+”：多数红细胞下沉在凹底部形成圆点， 周围可见少量凝集红细胞 “++”：凹底部可见明显的红点，凝集红细 胞在底部形成小薄层
凝集反应分为直接凝集和间接凝集反应。
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（二）间接红细胞凝集试验
原理 日本血吸虫可溶性虫卵抗原 载体颗粒 绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞 致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，
只能使用2～3天 致敏前将红细胞醛化，可长期保存而不溶血 常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛
胞破裂、溶血
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（三）红细胞鞣化
取1/10000鞣酸溶液与等量2.5%红细胞悬液混 匀，置于37℃ 中15min，并不断摇动。洗涤， 去除多余的鞣酸。
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鞣化红细胞的优点 鞣化后红细胞易吸附蛋白抗原。
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（四）红细胞致敏
取虫卵抗原原液1:100稀释，与2.5%的鞣化红 细胞等量混合，置于37℃水浴中30min，并不断摇 动，然后离心，洗涤，去除多余抗原。
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七、实用价值
（一）可作为血吸虫病的辅助诊断。无血 治史者和治疗史3年以上者，IHA阳性可给 予扩大治疗。
（二）在血吸虫病流行区，可作为查病的 过筛方法。
（三）可作为血清流行病学调查及疫情监 测的方法
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“+++”：凹底部可见很弱的红点，红细胞呈 疏松的颗粒凝集 “++++”：红细胞呈明显的颗粒凝集，均匀 散布于凹底部周围形成薄层，有时呈皱褶状
效价(滴度)：发生凝集现象最高的血清稀释度。
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22
五、影响因素及注意事
（一）试剂：保存、对照、效价、摇匀。 （二）反应板：“V”型，底角应为90°。 反复冲洗。 （三）毛细吸管：校正、垂直。 （四）血清样本：新鲜为宜，保存在冰盒 内。溶血样本将影响测定结果的准确性。
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18
（三）第1孔中加待检血清25μl，混匀后吸出 25μl加于第2孔中，在第2孔中混匀后，吸出 25μl加于第3孔中，混匀后弃去25μl。此时第 1、2、3孔中的血清稀释度依次为1:5 、1:10 、 1:20。
（四）在第2、第3孔中各加致敏红细胞悬液 25μl，将反应板放在振荡器上振荡1min，室 温下静置45min，观察反应结果。
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（二）红细胞醛化
取人“O”型血红细胞3份（不同个体） 混合 ，用生理盐水洗涤 。置冰浴内，将戊 二醛溶液慢慢滴入红细胞悬液中，边加边 摇，醛化1h。用1/10000的柳硫汞蒸馏水配 成10%的红细胞悬液，置于4℃备用。
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醛化红细胞优点 克服了个体差异，保证实验重复性 延长红细胞的保存时间，在4℃可保存1年 避免操作过程中因振荡、低渗、冻融使红细