不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理说课讲解
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶
两单体构成的人工合成凝胶 丙烯酰胺（Acr） N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）
作为电泳介质的优点 自由调节孔径；韧性好；性质稳定； 无电渗作用；无色透明。
合成聚丙烯酰胺凝胶的两种方法
化学合成系统 过硫酸铵（AP） 四甲基乙二胺（TEMED）
实验结果的分析
相关理论
表-1 血清中各蛋白质的相关特性
种类
分子量(万） PI
分 布(%)
清蛋白
6.9
6.1
55
1-球蛋白 2.1~30.8 7.3
5.0
2-球蛋白 4.1~72.5 6.8
9.0
-球蛋白
1.2~25 7.6
13.0
-球蛋白
15.6
8.0
11.0
-球蛋白
-球蛋白 2-球蛋白 1-球蛋白 清蛋白 前清蛋白
光学合成系统 核黄素 四甲基乙二胺（TEMED）
聚丙烯酰胺凝胶浓度与交联度
凝胶总浓度T=[(a+b)/m]×100% 交联剂百分比C=[b/(a+b)] ]×100%
a为Acr克数，b为Bis克数， m为缓冲液体积（ml) a:b＜10 凝胶变脆、硬、呈乳白色 a:b＞100易断裂 （一般a:b=30左右，根据T可适当调整））
蛋白质聚丙烯胺凝胶电泳
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘电泳）
电泳的概念
带电粒子（胶体颗粒、离子等）在电场 的作用下在特定的介质中向与其电荷性 质相反的电极方向定向泳动的现象。
广泛应用于生物大分子的分离和鉴定
电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
电荷差异
电荷性质 电荷数量
聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 步骤 详细ppt课件
AP胺在单水体溶的液双中键能打产生开游，离活基化S形O4成2-.自，由使基丙丙烯酰烯 酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形 成凝胶
TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-.
注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件 下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔 绝氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
（1）丙烯酰胺（acrylamide，Acr）结构式
上海交通大学医学院
（2）亚甲双丙烯酰胺
（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）
上海交通大学医学院
上海交通大学医学院
讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
思考题
名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。
上海交通大学医学院
讲课内容
1
PAG的组成
2
PAG的聚合
3
PAG的浓度与孔径的关系
4
不连续PAGE
5
PAGE的特点
上海交通大学医学院
化学聚合法聚合成小孔胶
上海交通大学医学院
分离原理
1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续性
两层凝胶T与C不同孔径不同 浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大 孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。
上海交通大学医学院
2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、具体实验操作
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻 璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内， 加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数 次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要 充分.
四、实验结果分析
绘制标准曲线：
按下式计算相对迁移率：
三、具体实验操作
3. 实验步骤
1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形 瓶. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米 左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶 前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性 完成,避免产生气泡.
三、具体实验操作
※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶, 连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置 40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平. 5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去 底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、加样三个。 （1）取10µ l标准蛋白溶解液于EP管内， 再加入10µ 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。 l
相对迁移率 =
蛋白样品距加样端迁移距离（cm） 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）
以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移 率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即 可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块 凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
03
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳具有高分辨率和分离范围广的优点，广泛应用于蛋 白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
03
实验材料与设备
实验材料
01
02
03
04
05
血清样品
丙烯酰胺和N,N'- 分离胶和浓缩胶 甲…
电泳缓冲液
Байду номын сангаас
染色液和脱色液
用于电泳分离的血清样品 ，应保证新鲜、无菌，且 无杂质。
用于制备凝胶的原材料， 应保证纯度高、无杂质。
电泳仪
用于电泳分离的设备，应保证 性能稳定、精度高。
电源
用于提供电泳仪所需的电流和 电压，应保证安全、稳定。
电子天平
用于称量实验材料，应保证精 度高、稳定性好。
04
实验步骤与操作
实验前的准备
准备试剂
准备凝胶板
确保所有试剂都已正确配制，包括丙烯酰 胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、TEMED、 Tris-HCl、甘氨酸、过硫酸铵等。
用于电泳分离的不同浓度 的凝胶，应保证性能稳定 、无杂质。
用于维持电泳过程中的pH 值和离子强度，应保证质 量稳定、无杂质。
用于染色和脱色分离后的 凝胶，应保证无毒、无害 、无污染。
实验设备
垂直电泳槽
用于放置凝胶和电泳缓冲液的 容器，应保证密封性好、不易 变形。
离心机
用于制备血清样品，应保证性 能稳定、易于操作。
结合其他技术
结合质谱分析、免疫印迹等其他技术，对分离出的蛋白质进行定性和 定量分析，以更深入地了解蛋白质的性质和功能。
应用于临床研究
进一步研究血清中特定蛋白质与疾病之间的关系，探索其在临床诊断 和疾病监测中的应用价值。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法发布时间：11-06-01 来源：点击量：10032 字段选择：大中小聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。
在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。
聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。
凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。
一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。
凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。
合成聚丙的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示，可用下式计算：公式a：丙烯酰胺克数；b：甲撑双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。
交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。
聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。
由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳p讲解学习
将加样纸分别吸取样液,成一字形排放在两电极之间的 凝胶中央. (8)连接电极:
将电极线的插头插入电极板的插孔内,盖上电极板,使铂 金丝压在电极条上.盖上安全罩,接通冷凝水.
(9)电泳: 将电泳仪正极输出端与磷酸电极条相连, 负极输出端与
(3)灌胶, 聚胶60分钟 (4)取下玻璃板, 电泳槽上加少许液体石蜡,将坐标纸浸透铺 平整, 坐标纸上放带胶玻璃板 (5)加电极条:取4张滤纸条,其中两张滤纸条浸透1mol/L 磷 酸,另两张浸透1mol/L NaOH, 多余的液滴用滤纸质吸去,然 后对称放在凝胶的两侧.
(6)剪取加样纸: 按坐标纸的尺寸,剪成0.5 x 0.5cm大小的加样纸,拨去上
倾出固定液,用蒸馏水漂洗一次,加入考马斯亮蓝R250溶 液染色60分钟.
(12) 脱色: 倾出染色液(回收染色液).加入少量的脱色液脱色,直至背
景清楚. (13)计算等电点:
量取标准蛋白的相对迁移率,绘制等电点标准曲线,计算 未知蛋白等电点.
(3) Pharmalyte (瑞典Pharmacia) 七氨基多羧基组成的 pH范围: 2.5-5, 4-5.5, 5-8, 8-10, 3-10 等
(4)载体两性电解质(军事医学科学院) 合成的方式与Ampholine基本相同. pH范围: 3-9.5, 3.5-5.5, 4.0-6.0, 5.0-7.0, 6.0-9.0, 7.0-10.0
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳
一、实验简介 1、实验目的
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳实验，初步掌握聚焦电泳 的基本原理和实验技术
2、基本原理 2.1蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质.在不同的pH环境中所带的正 负电荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零,此时 的pH为该பைடு நூலகம்白质的等电点。在电场下不泳动。
【课件】实验八不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳ppt
2.2 电泳的基本原理
利用物质的两个差异来分离物质
1.电荷差异 (1)电荷性质 (2)电荷数量
2.分子差异 (1)分子大小 (2)分子形状
2.3 电泳分离蛋白质的原理
1. 蛋白质两性解离与等电点
若向蛋白质溶液中加入适量的酸或碱，使羧基和氨基的解离度相同， 此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点（PI）。
电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应
（2）不连续系统——不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓
度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应， 分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较 前者佳。
2. 根据蛋白质样品变性与否，分为： （1）变性电泳——也就是SDS-PAGE，蛋白质失去二三级结构； （2）非变性电泳 ——蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子
实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
实验八：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
贾跃腾 罗世翔
一、 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验操作及注意事项 （P138）
1.1 分离胶的配制
实验分组（每人做一管，每组配一份胶）
认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）
封管
分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，A1C2H2G5，每组总 体积为10ml，灌胶高度为7-8cm）
封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出现折光线时可进行 下一步操作）
注意事项：
1、封管要严，防止漏液。 2、固定玻璃管要竖直，防止夹碎。 3、每组配一份胶，试剂与移液管对号，准确加量。 4、配胶后立即灌胶（用滴管灌胶，用后立即清洗） 5、正丁醇沿管壁缓缓加入
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
一、实验目的 1．掌握凝胶电泳的三个效应。 1．掌握凝胶电泳的三个效应。 2．了解该电泳的特点及适用范围。 ．了解该电泳的胺凝胶电泳的三种效应： 讲解聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应： 1、浓缩效应。 1、浓缩效应。 2、电荷效应。 、电荷效应。 3、分子筛效应。 、分子筛效应。
实验思考
1、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应。 、解释聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应。 2、由本次实验结果解释醋纤薄膜电泳分离后 、 各条区带清晰度的差别。 各条区带清晰度的差别。
四、实验材料
1．圆盘电泳槽。 ．圆盘电泳槽。 2．电泳仪。 ．电泳仪。 3．玻璃管（10×0.6 cm）。 ．玻璃管（ × ）。 4．50l微量注射器、5ml注射器。 微量注射器、 注射器。 ． 微量注射器 注射器 5．10 cm长的局麻针头，10号针头。 长的局麻针头， 号针头 号针头。 ． 长的局麻针头 6．试剂 ．
三、实验原理
本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。 本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。电 荷数和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效 电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。 应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于 具有以上三种效应，所以此方法分离效果好， 具有以上三种效应，所以此方法分离效果好，分辨 率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成5～ 个组分 个组分， 率高，血清蛋白在纸上电泳仅能分成 ～7个组分， 而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出12～ 个 而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出 ～30个 组分。 组分
五、实验方法
（一）凝胶柱的制备 1．凝胶玻璃管的准备 ． 2．分离胶的制备 ． 3．浓缩胶的制备 ． 4. 装柱
(二)加样 二 加样 (三)电泳 三 电泳 (四)剥胶 四 剥胶 (五)固定和染色 五 固定和染色 (六)漂洗 六 漂洗
SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
精选版课件ppt
1
一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
精选版课件ppt
21
2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
精选版课件ppt
22
精选版课件ppt
23
3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
精选版课件ppt
24
三、去污剂的选择
无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween
Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium
精选版课件ppt
9
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
精选版课件ppt
10
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较 高的平衡浓度。
精选版课件ppt
57
精选版课件ppt
58
（3）“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。
精选版课件ppt
59
（4）“纹理”现象 由于样品中的不溶颗粒引起的。
SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件
精选2021版课件
2
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
精选2021版课件
3
二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略。
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
精选2021版课件
27
精选2021版课件
28
精选2021版课件
29
精选2021版课件
30
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
精选2021版课件
31
精选2021版课件
32
精选2021版课件
33
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
精选2021版课件
44
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
精选2021版课件
45
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
精选2021版课件
9
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响，
而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理(上)
⒉日常生活中尽量避免过度烹饪食品，如温度过高或加热时间太长。提倡平衡膳食，减少油炸 和高脂肪食品的摄入，多吃水果和蔬菜，不要吸烟。
⒊由于煎炸食品是我国居民常吃的食物，国家应加强膳食中丙烯酰胺的监测与控制，开展我国 人群丙烯酰胺的暴露评估，并研究探索减少加工食品中丙烯酰胺含量的方法
N.N-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉）（N,N’-methylene bis acrylamide）
丙烯酰胺 (acrylamide)
丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯 酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。淀粉类食品 在高温（ 120℃）烹调下容易产生丙烯酰胺。
研究表明，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙 烯酰胺，饮水是其中的一条重要接触途径。
N.N-亚甲基双丙烯酰胺，别名MBA，双叫N.N-甲叉双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰 胺，N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强 光则自交联，微溶于水、乙醇。
丙烯酰胺单体和交联剂N1 N′-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺 基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的 聚丙烯酰胺凝胶。
丙烯酰胺简介 丙烯酰胺是一种有机化合物，别名AM；纯品为白色结晶固体，易溶于水、甲醇、乙醇、丙醇， 稍溶于乙酸乙酯、氯仿，微溶于苯，在酸碱环境中可水解成丙烯酸。职业性接触主要见于丙烯 酰胺生产和树脂、黏合剂等的合成，在地下建筑、改良土壤、油漆、造纸及服装加工等行业也 。 [毒性]
SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解课件PPT
2021/3/10
34
2021/3/10
35
2021/3/10
36
分离胶聚合之后
2021/3/10
37
2021/3/10
38
2021/3/10
39
2021/3/10
40
2021/3/10
41
2021/3/10
42
2021/3/10
43
（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以
（3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
2021/3/10
9
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响，
而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
2021/3/10
6
2021/3/10
7
▪ SDS和还原剂的作用： （1）分子被解聚或组成它们的多肽键 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束。 （3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大 超
过了蛋白质分子原有的电荷量，消除
了不同分子之间原有的电荷差异。
2021/3/10
8
蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS 胶束基本上是相同的。
2021/3/10
4
1、SDS
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
2021/3/10
5
2、强还原剂 巯基乙醇（β-mercaptoethanal）
不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[实验目的]学习和掌握不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法和测定蛋白质相对分子质量的基本原理和实验技术。
[实验原理]SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的高级结构，强还原剂β-巯基乙醇能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
[器材与试剂]一、器材垂直板电泳槽、电泳仪（直流稳压）、电子天平、移液器、烧杯、量筒、离心管、灭菌tip头、大培养皿、漏斗、滤纸、镊子、玻棒、电炉二、试剂1、30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。
置棕色瓶中，4℃保存。
2、1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液3、10% SDS溶液4、10%过硫酸铵：新鲜配制5、TEMED溶液：4℃保存6、1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液7、2×样品溶解液：2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L Tris-HCl （pH8.0）缓冲液。
8、5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：每1000ml该溶液中，含15.1g Tris，94g甘氨酸和50ml 10%（W/V）SDS贮存液。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰氨凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。
这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。
SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理
[毒性] 丙烯酰胺属中等毒类，对眼睛和皮肤有一定的刺激作用，可经皮肤、呼吸道和消化道吸收，
在体内有蓄积作用，主要影响神经系统，急性中毒十分罕见。密切大量接触可出现亚急性中毒，
中毒者表现为嗜睡、小脑功能障碍以及感觉运动型多发性周围神经病。长期低浓度接触可引起慢
性中毒，中毒者出现头痛、头晕、疲劳、嗜睡、手指刺痛、麻木感，还可伴有两手掌发红、脱屑，
度；同时通过加强个人防护，如戴口罩、手套，穿防护服和鞋等，以防止或减少丙烯酰胺进入体
内。
⒉日常生活中尽量避免过度烹饪食品，如温度过高或加热时间太长。提倡平衡膳食，减少油炸和
高脂肪食品的摄入，多吃水果和蔬菜，不要吸烟。
⒊由于煎炸食品是我国居民常吃的食物，国家应加强膳食中丙烯酰胺的监测与控制，开展我国人
群丙烯酰胺的暴露评估，并研究探索减少加工食品中丙烯酰胺含量的方法
精品文档
4
N.N-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉）（N,N’-methylene bis acrylamide）
N.N-亚甲基双丙烯酰胺，别名MBA，双叫N.N-甲叉双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰胺， N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则 自交联，微溶于水、乙醇。
手掌、足心多汗，进一步发展可出现四肢无力、肌肉疼痛以及小脑功能障碍等。
丙烯酰胺慢性毒性作用最引人关注的是它的致癌性。丙烯酰胺具有致突变作用，可引起哺乳动物
体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常。动物试验研究发现，丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿
瘤，如乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体肿瘤等。但目前还没有
丙烯酰胺单体和交联剂N1 N′-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺 基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的 聚丙烯酰胺凝胶。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。
由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
1．浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。
当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。
由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。
电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。
这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。
2．电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。
3．分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。
它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。
打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、pH值和凝胶孔径，而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。
由此产生的浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
1．浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。
当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。
由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。
电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。
这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。
2．电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。
3．分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。
它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。
打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。