安捷伦科技针对速成鸡中抗病毒药物利巴韦林和金刚烷胺的整体解决方案

安捷伦科技针对”速成鸡”中抗病毒药物利巴韦林和金刚烷胺的
整体解决方案
李建中,吴翠玲,陆予菲,于明武,陈伟,张之旭
（安捷伦科技(中国)有限公司,北京,100102）
近日,央视曝光山东等地部分养殖户在肉鸡饲养过程中大量滥用抗生素,激素和抗病毒类药物,违规喂食金刚烷胺、利巴韦林等抗病毒药品的“速成鸡”流入上海百盛旗下餐饮机构一事，美国快餐业巨头肯德基和麦当劳在中国被卷入“速成鸡”风波，引发沪上人士和全国消费者的广泛关注和担忧！农业部对此事件高度重视，及时责成山东有关部门去调查处理这件事情，也派出了专家组奔赴山东。

现在已经关闭了有关的养鸡企业和加工企业，包括一些养鸡户，正在紧锣密鼓的查处之中。

此次事件中首次被曝光的抗病毒类药物利巴韦林和金刚烷胺目前国家尚无相应的检测技术标准和方法，这为相关政府执法检测部门，生产企业和第三方实验室迅速开展监督检查带来了技术上的困难。

安捷伦科技作为分析仪器业界知名品牌，多年来一直致力于为食品安全领域提供强有力的产品、技术解决方案。

为应对此次食品安全突发事件，安捷伦科技为广大分析工作者提供了分析检测鸡肉中抗病毒类药物利巴韦林和金刚烷胺的完整解决方案。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
安捷伦科技有限公司6460 QQQ质谱仪；安捷伦科技有限公司1290 Infinity UHPLC。

乙腈，甲醇，异丙醇，乙酸铵，氨水，甲酸，去离子水，三氯乙酸。

Poroshell120 EC-C18 3.0x100 mm, 2.7 µm:P/N 695975-302，
ZORBAX SB-Aq RRHT 100*3.0mm，1.8 μm P/N.828975-314。

1.2 样品前处理条件
1.2.1鸡肉中利巴韦林的前处理方法
准确称取鸡肉样品( 2g± 0. 02) g 于15mL具塞离心管中, 加入已知浓度的标准品，5 mL 的乙腈∶1%三氯乙酸溶液（7:3）, 加盖后涡旋1min, 10000r/min离心10 min, 吸取上清液于15mL离心管中；再向残渣中再加入5 mL的乙腈∶1%三氯乙酸溶液（7:3）, 重复上述操作, 合并两次上清液；涡旋混匀，用氨水调节提取液pH 值为8.5± 0.1,再10000r /min离心10 min，取全部上清液过柱净化。

净化流程如下：
1.2.2鸡肉中金刚烷胺的前处理方法
称取2g鸡肉样品（精确至0.01g）至15mL离心管中，依次加入已知浓度的标准品、5mL的甲醇∶1%三氯乙酸（50+50，V/V），涡旋1min，超声30min，10000r/min离心10min，上清液全部转移至15mL离心管中；再加入5mL的甲醇∶1%三氯乙酸（50+50，V/V）重复提取一次，合并全部提取液；涡旋均匀后重新离心，取出上清液5mL，过Plexa PCX固相萃取柱净化，如下所示：
1.3 液相和质谱条件
液相色谱柱为安捷伦Poroshell120 EC-C18，3.0 x 100mm, 2.7 μm（金刚烷胺）和ZORBAX SB-Aq RRHT 3.0 x 100mm，1.8 μm P/N.828975-314（利巴韦林）；流动相为A为水（含0.1%体积比的甲酸+5mM 乙酸铵），B为乙腈，柱温30o C；进样量2µL，流速为0.4 mL/min。

利巴韦林梯度见下表1
Time(min) B%
0.00 0.00
2.00 0.00
4.00 1
5.00
4.10 90.00
6.00 90.00
金刚烷胺洗脱梯度见表2
Time(min) B%
0.00 0.00
2.00 0.00
4.00 1
5.00
5.00 15.00
8.00 30.00
8.50 98.00
10.00 98.00
QQQ质谱参数（ESI+模式）：干燥气温度（Gas Temp）300 o C，干燥气流量（Gas Flow）8mL/min，雾化器压力（Nebulizer）40psi，鞘流气温度（Sheath Gas Temp）300 o C，鞘流气流量（Sheath Gas Flow）11mL/min，毛细管电压（Capillary）3000V，喷嘴电压（Nozzle）0V；MRM参数见表3，安捷伦MassHunter
软件用于定性（Qualitative）和定量（Quantitative）分析。

表3 利巴韦林和金刚烷胺的MRM参数
2 结果与讨论
从利巴韦林和金刚烷胺的结构和文献报道，可以采用电喷雾离子源正离子模式测试，实验结果表明利巴韦林可以生成[M+H]+（m/z 245.1）和[M+Na]+（m/z 267.1）分子离子峰，金刚烷胺可以生成[M+H]+（m/z 152.2）分子离子峰；分别选择[M+H]+峰进行子离子扫描，最终确认利巴韦林选择m/z 113（定量子离子）和96（定性子离子），金刚烷胺选择m/z 135（定量子离子）和93（定性子离子）作为多反应通道监测离子对。

由于利巴韦林极性较强，在反相C18色谱柱上保留较弱，所以采用100%水相作为梯度色谱条件的起始比例，另比较了C18柱和SB-Aq在分析利巴韦林时具有选择性差异，在C18上不能完全分离的基质干扰，SB-Aq可以实现很好的分离。

另外流动相添加0.1%甲酸和低浓度乙酸铵促进正离子电离。

经过优化后的色谱图见图1。

图1 1ppb浓度利巴韦林和金刚烷胺的MRM谱图
仪器方法学考察了灵敏度，线性范围，稳定性及添加回收率等指标。

其中灵敏度测试了0.1ppb 浓度标准品，其中利巴韦林的信噪比为99.2；金刚烷胺的信噪比为35.6，均大于10倍信噪比定量检出限，结果如图2和图3所示：
图2 0.1ppb浓度利巴韦林灵敏度谱图
图3 0.1ppb浓度金刚烷胺灵敏度谱图
在0.1ppb～10ppb浓度范围内，测试线性相关系数均大于0.999。

如图4和图5所示：
图4 利巴韦林标准曲线
图5 金刚烷胺标准曲线
各浓度点平行6针测试，峰面积的RSD均小于5%，具有良好的稳定性。

分别向空白鸡肉中添加标准品测试回收率，其中利巴韦林的添加回收率在80~101%之间，见表4；金刚烷胺添加回收率结果在70%~82%之间，见表5。

标准品，空白样品和添加样品的谱图如图6和图7所示：
图6 利巴韦林标准品、空白样品和添加样品的TIC叠加谱图
图7金刚烷胺标准品、空白样品和添加样品的TIC叠加谱图表4 鸡肉中的利巴韦林回收率结果
表5鸡肉中的金刚烷胺添加回收率结果
3 结论
利用安捷伦科技的Bond Elut PBA和Bond Elut Plexa PCX固相萃取柱和1290UHPLC+6460QQQ高灵敏度液质联用技术，可以实现对问题鸡肉中抗病毒药物利巴韦林和金刚烷胺残留量的检测确证分析，可以为此类药物的快速筛查确证分析提供了有力的解决方案。

Poroshell120 EC-C18 是安捷伦专利的薄壳型高效液相色谱柱，具有柱压低，柱效高的突出特点，既可以用于UHPLC分析，也可以在常规HPLC上实现快速高效分析，是实验室提高工作效率，节约溶剂成本的良好选择。

ZORBAX SB-Aq 是安捷伦特有的一款可以耐受100%水相的反相液相色谱柱，对在普通反相色谱柱上难以保留的水溶性化合物有很好的选择性。

使用该款色谱柱可以有效地将利巴韦林和鸡肉基质中的干扰物质完全分开，提高定量和定性结果的稳定性和准确度。