基因工程菌稳定性分析(ppt 48页)
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差异：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒 载体拷贝数是不尽相同的，这种不同的细胞个体之间的质 粒载体拷贝数差异程度，简称差度。
无质粒载体细胞的速度是由分裂细胞中的质粒载体拷贝平 均值数决定的。
差度是影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳 定的原因之一。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
质1
950
粒
拷
贝 数 0.5
40
0
0.2
0.4
生长数率/h
β-半乳糖苷酶工程菌的连续养
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
一般情况下,质粒的结构不稳定性可以通过宿主 菌株的谨慎和恰当的选用来消除。因此在质粒 不稳 定性的研究过程中, 人们关注最多的,通常是质粒的 分离不稳定性。
GXU
第四节 提高质粒稳定性的方法
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
二、质粒载体不稳定性的类型
结构不稳定
指结构(序列)不稳定性, 即重组质粒上某一区域的 DNA 序列发生插入、缺失、重排和修饰等现象, 导致 其表观生物学功能的丧失;
分离不稳定
指细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。GXU
由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统， 从而保证了质粒的高度稳定。
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2 随机分配
在细胞分裂过程 中质粒拷贝数在两个 子细胞中随机分配。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
影响质粒载体稳定性的主要因素
新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应
基因工程菌稳定性分析
GXU
基因工程菌稳定性分析
第一节 基因工程菌的概述
第二节 质粒载体不稳定现象及类型 第三节 提高质粒稳定性的方法
第四节 影响质粒载体稳定性的主要因素 第五节 对NHase重组质粒稳定性分析
GXU
Slide 2
第一节 基因工程菌的概述
一、 基因工程菌的定义
基因工程菌( Gene Engineering Bacteria) 是利用 基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其 表达所需蛋白的重组菌。 二、基因工程菌构建的基本路线
目的基因获取-目的基因扩增-基因重组-重组载体 导入受体菌-筛选导入成功的受体菌
GXU
第一节 基因工程菌的概述
三、质粒的稳定性问题
基因工程技术是生物技术的核心和关键，通过 载体向受体细胞或细菌转入目的基因，从而使其表 达一系列与人类健康有关的重要物质，如抗生素、 氨基酸、疫苗等，在医药、环境治理等行业有广阔 应用前景。但是，质粒的稳定性问题是基因工程技 术工业化的瓶颈。
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
一、质粒载体不稳定的现象：
克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体 细胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身 的稳定性； 可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加； 产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体； 结构重排导致无法正常表达的突变体。
影响质粒重组的突变
同样也会影响质粒的稳
定性。实验观察表明，
在 重 组 缺 陷 (rec-) 的 大 肠
杆菌寄主细胞中，基因
工 程 常 用 载 体 pBR322 和
pUC当以单体形式存在时
最稳定。随着质粒寡聚
体比例的逐渐上升，其
稳定性就相应的下降。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生 长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。
具有低差度分布 特性的质粒载体相当 的稳定性，具有高差 度分布特性的质粒载 体稳定性较差。位于 后者的这种分布的低 拷贝数的一段产生无 质粒载体细胞的频率 相当高。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
3. 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应
质粒寡聚体，其稳定性比单体差，同样是造成质粒不稳 定性的重要原因之一。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
1. 新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应
质粒载体增加给宿主细胞DNA复制效应曲线。 即宿主细胞生长速度与质粒载体的分子量的大小成 正比，克隆的外源DNA段越大，寄主细胞生长缓慢 的时间就越长。
GXU
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
2. 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
1. 结构不稳定
原因：DNA的丢失，插入和重排。人工构建的多个 串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色体 及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的 不稳定性。 共 同 特 征 ： 同 向 重 复 序 列 之 间 的 同 源 重 组 （ short direct repeat). 例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换 大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产 生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。
高密度培养 基因工程菌 选择培养基 周期操作 固定化基因工程菌
寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆载 体。实验证明，pBR322派生载体中，寡聚化程度与插入 片段大小存在相关性。
决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种
主要的因素：一、质粒DNA分子间的重组频率；二、含
质粒寡聚体细胞生长速率。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
三、质粒拷贝分配到子细胞的途径
质粒拷贝分配到子细胞的途径可分为主动分配 和随机分配两种不同的方式。
1 主动分配的方式有两种:
平均分配--每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝
配对位点分配--只有一对质粒呈主动分配，其他的随机
分配
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2. 分离不稳定
原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。 由于缺陷性分配（defective partitioning）所造成的质 粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。 质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时代每 个质粒至少发生一次复制；二、细胞分裂时，复制产生 的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。
无质粒载体细胞的速度是由分裂细胞中的质粒载体拷贝平 均值数决定的。
差度是影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳 定的原因之一。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
质1
950
粒
拷
贝 数 0.5
40
0
0.2
0.4
生长数率/h
β-半乳糖苷酶工程菌的连续养
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
一般情况下,质粒的结构不稳定性可以通过宿主 菌株的谨慎和恰当的选用来消除。因此在质粒 不稳 定性的研究过程中, 人们关注最多的,通常是质粒的 分离不稳定性。
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第四节 提高质粒稳定性的方法
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
二、质粒载体不稳定性的类型
结构不稳定
指结构(序列)不稳定性, 即重组质粒上某一区域的 DNA 序列发生插入、缺失、重排和修饰等现象, 导致 其表观生物学功能的丧失;
分离不稳定
指细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。GXU
由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统， 从而保证了质粒的高度稳定。
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2 随机分配
在细胞分裂过程 中质粒拷贝数在两个 子细胞中随机分配。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
影响质粒载体稳定性的主要因素
新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应
基因工程菌稳定性分析
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基因工程菌稳定性分析
第一节 基因工程菌的概述
第二节 质粒载体不稳定现象及类型 第三节 提高质粒稳定性的方法
第四节 影响质粒载体稳定性的主要因素 第五节 对NHase重组质粒稳定性分析
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第一节 基因工程菌的概述
一、 基因工程菌的定义
基因工程菌( Gene Engineering Bacteria) 是利用 基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其 表达所需蛋白的重组菌。 二、基因工程菌构建的基本路线
目的基因获取-目的基因扩增-基因重组-重组载体 导入受体菌-筛选导入成功的受体菌
GXU
第一节 基因工程菌的概述
三、质粒的稳定性问题
基因工程技术是生物技术的核心和关键，通过 载体向受体细胞或细菌转入目的基因，从而使其表 达一系列与人类健康有关的重要物质，如抗生素、 氨基酸、疫苗等，在医药、环境治理等行业有广阔 应用前景。但是，质粒的稳定性问题是基因工程技 术工业化的瓶颈。
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
一、质粒载体不稳定的现象：
克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体 细胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身 的稳定性； 可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加； 产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体； 结构重排导致无法正常表达的突变体。
影响质粒重组的突变
同样也会影响质粒的稳
定性。实验观察表明，
在 重 组 缺 陷 (rec-) 的 大 肠
杆菌寄主细胞中，基因
工 程 常 用 载 体 pBR322 和
pUC当以单体形式存在时
最稳定。随着质粒寡聚
体比例的逐渐上升，其
稳定性就相应的下降。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生 长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。
具有低差度分布 特性的质粒载体相当 的稳定性，具有高差 度分布特性的质粒载 体稳定性较差。位于 后者的这种分布的低 拷贝数的一段产生无 质粒载体细胞的频率 相当高。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
3. 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应
质粒寡聚体，其稳定性比单体差，同样是造成质粒不稳 定性的重要原因之一。
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第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
1. 新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应
质粒载体增加给宿主细胞DNA复制效应曲线。 即宿主细胞生长速度与质粒载体的分子量的大小成 正比，克隆的外源DNA段越大，寄主细胞生长缓慢 的时间就越长。
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ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
2. 拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
1. 结构不稳定
原因：DNA的丢失，插入和重排。人工构建的多个 串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色体 及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的 不稳定性。 共 同 特 征 ： 同 向 重 复 序 列 之 间 的 同 源 重 组 （ short direct repeat). 例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换 大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产 生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。
高密度培养 基因工程菌 选择培养基 周期操作 固定化基因工程菌
寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆载 体。实验证明，pBR322派生载体中，寡聚化程度与插入 片段大小存在相关性。
决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种
主要的因素：一、质粒DNA分子间的重组频率；二、含
质粒寡聚体细胞生长速率。
GXU
第三节 影响质粒载体稳定性的主要因素
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第二节 质粒载体不稳定现象及类型
三、质粒拷贝分配到子细胞的途径
质粒拷贝分配到子细胞的途径可分为主动分配 和随机分配两种不同的方式。
1 主动分配的方式有两种:
平均分配--每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝
配对位点分配--只有一对质粒呈主动分配，其他的随机
分配
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
GXU
第二节 质粒载体不稳定现象及类型
2. 分离不稳定
原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。 由于缺陷性分配（defective partitioning）所造成的质 粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。 质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时代每 个质粒至少发生一次复制；二、细胞分裂时，复制产生 的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。