植物表达载体pCAMBIA230_省略__ros的构建及其在草莓上的验证_金万梅
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Abstract In order to study multi-gene interaction and reduce the blindness of many transformation, CaMV 35S promoter and nos terminator were added into gene del and ros upstream and downstream, respectively. del and ros genes can regulate anthocyanin synthesis. Intermediate vector pBI121- del and pCAMBIA1301ros were constructed. BamHⅠand BglⅡproduced the same end tetra-nucleotide segments. The CaMV 35S promoter separately driven del and ros genes were constructed in plant expression vector pCAMBIA2301 under ligase. Strawberries(Fragaria ananassa Duch.) were treated by the constructed vector pCAMBIA2301del- ros via Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediated transformation method. Transgenic strawberry lines were screened by PCR analysis. Observed by organizations, the roots and leaves of transgenic strawberry lines became reddish purple. The expression of anthocyanin biosynthetic genes anthocyanidinsynthase(ANS), chalcone- flavanone isomerase(CHI), flavanone 3- hydroxylase(F3H),
有关植物花青素合成已有很多研究，苯丙氨酸 是花青素生物合成的直接前体，花青素属于类黄酮 化合物，其基本结构是 2-苯基苯丙呋喃。苯丙氨酸 在苯丙氨酸解氨酶、酸-4-羟化酶和 CoA 连接酶的 作用下，生成香豆酰 CoA，在苯丙氨酸解氨酶催化 的基础上产生香豆醇、松柏醇、芥子醇及其他亚类 的 植 物 酚 类 物 质 ，香 豆 酰 CoA 在 查 尔 酮 合 酶 (chalcone synthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalconeflavanone isomerase, CHI)、黄 烷 酮 - 3- 羟 化 酶 (flavanone 3-hydroxylase, F3H)的催化下产生二氢 黄酮醇，二氢黄酮醇有 3 条路径，最终在 F3H、二羟 黄 酮 醇 - 4- 还 原 酶 (dihydroflavonol- 4- reductase, DFR)的催化下生成无色花青素，在花色素合成酶 (anthocyanidinsynthase, ANS)、类黄酮-3-O-葡糖基 转 移 酶 (UDP glucose- flavonoid 3- O- glcosyltransferase, UFGT)作用下将无色花青素转变成蓝 紫色或砖红色的葡糖苷(Quattrocchio et al., 1993； Butelli et al., 2008; Chiu, Li, 2012)。
基金项目：北京市重要农作物转基因技术创新研究(No. KJCX201102003) 收稿日期：2013-11-01 接受日期：2013-12-23
农业生物技术学报
390 Journal of Agricultural Biotechnology
dihydroflavonol- 4- reductase(DFR) and UDP glucose- flavonoid 3- O- glcosyl- transferase(UFGT) were all enhanced in transgenic strawberry plant. The results were further confirmed that the plant expression vector pCAMBIA2301- del- ros could be used to transform plants. Construction of plant expression vector pCAMBIA2301-del-ros can provides a good idea for constructing a multi-gene plant expression vector and a method for studying interaction of multiple genes. Keywords Plant expression vector, Construction, Strawberry, Genetic transformation
0 引言
pCAMBIA 系列载体是植物基因工程中最常 用 的 植 物 双 元 表 达 载 体 之 一 ( 巩 元 勇 等,wk.baidu.com2013)。 pCAMBIA2301 载体在 GUS 基因的上下游均有酶 切位点，并且在 CaMV 35S 的上游有一个多克隆位 点(multiple cloning site, MCS)，这种结构比较利于 改造；另外在细菌和植物转化时所用的选择标记都 是卡那霉素(kanamycin)(Chauhan, Khurana,2011)。 基于这点 pCAMBIA2301 在植物基因功能研究中， 尤其是在双子叶植物研究中是一个非常有用的植 物表达载体。
草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物，是一种 世界各国广泛栽培的经济作物。我国草莓种植总 面积已达到 10 多万 hm2，成为世界草莓生产和消费 第一大国。草莓是双子叶植物，对卡那霉素很敏 感。草莓体内存在一条完整的花青素合成路径，采 用转录因子的调控手段，将来自金鱼草的花青素调 控基因 del 和 ros 一起转入草莓中，研究多个调节基 因如何影响花青素的。一般情况下要研究 del 和 ros 基因互作，需要对这两个基因分别进行转化，费 时而且工作量很大。本研究将这两个基因构建在 同一个植物表达载体上，然后进行遗传转化，可以 一次性将两个基因同时导入到植物中，为多基因改 良植物材料提供便利。
Online system: http://www.jabiotech.org
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(3): 389~396 DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.03.015
植物表达载体 pCAMBIA2301-del-ros 的构建及其在草莓上的验证
花 青 素 (anthocyanin) 是 一 类 存 在 于 草 莓 (Fragaria ananassa Duch.)、葡萄(Vitis vinifera L.)、苹 果(Malus domestica Borkh.)等植物中的次生代谢物 质，决定着花、种子和果实的颜色(Akifumi et al., 2008；Doshi et al., 2006)。另外，花青素可以对人体 的许多疾病如癌症、心血管疾病和神经性疾病等起 防御作用(Butelli et al., 2008)。
在花青素的生物合成中，一个结构基因的作用 是有限的，因为花青素表达水平的提高需要整个生 物合成路径结构基因都要高效表达；相比较而言， 一两个调节基因就会影响整个花青素的合成 (Quattrocchio et al., 1993)。转录因子是重要的调节 基因，MYC 或 MYB 类转录因子影响花青素合成调 控，可以显著提高紫色花青素的含量。Delila(del) 基因是 MYC 类的转录因子，是一个编码螺旋-环螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)的转录因子，其 作用是调节花青素合成的结构基因的转录水平 (Mooneyet al., 1995)。Rosea1(ros)基因是一个编码 MYB 类相关的转录因子，ros 控制着花的紫色，对 结构基因的调节作用显著(Schwinn et al., 2006)。 del 和 ros 二者互作，使紫色花青素结构酶基因高水 平 转 录 ，从 而 使 紫 色 花 青 素 水 平 大 大 提 高 (Mathews et al., 2003; Butelli et al., 2008)。 Maligeppagol 等(2013)从金鱼草(Antirrhinum majus L.)中克隆了 del 和 ros 基因，将其构建在由果实专一 性启动子驱动的载体上，利用根癌农杆菌介导的方 法转化了番茄(Solanum lycopersicum L.)，获得了转 基因番茄；与野生型对照相比，转基因番茄在成熟 果实中积累了更多的花青素，而花青素丰富的番茄 果实对其生命周期中的许多病害具有抵抗作用。
Construction of Plant Expression Vector pCAMBIA2301- del- ros and Genetic Transformation in Strawberry(Fragaria ananassa Duch.)
JIN Wan-Mei* WANG Hua
Institute of Forestry and Pomology, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100093, China * Corresponding author, jwm0809@163.com
金万梅* 王华
北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093 *通讯作者，jwm0809@163.com
摘 要 为了研究多基因互作，减少多次转化的不确定性，本研究在花青素合成调节基因 del(delila)和 ros (rosea1)的上下游分别引入 CaMV 35S 启动子和 nos 终止子，以 pBI121-del 和 pCAMBIA1301-ros 做中间载 体，并利用 BamHⅠ和 Bgl Ⅱ产生相同 4 碱基末端的片段，在连接酶的作用下将 CaMV 35S 启动子分别驱 动的 del 和 ros 基因构建在同一个植物表达载体 pCAMBIA2301 上，利用所构建的载体 pCAMBIA2301-delros 通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 介导的方法转化草莓(Fragaria ananassa Duch.)， 并进行 PCR 检测，获得转基因草莓。通过组织观察发现，转基因草莓的根和叶的颜色变成红紫色；实时 RT-PCR 分析表明，在转基因草莓中花青素合成的结构基因花色素合成酶(anthocyanidinsynthase, ANS)、查 尔酮异构酶(chalcone-flavanone isomerase, CHI)、查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)、二羟黄酮醇-4-还原 酶(dihydroflavonol-4-reductase, DFR)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)和类黄酮-3-O-葡糖 基转移酶(UDP glucose-flavonoid 3-O-glcosyl-transferase, UFGT)在转基因株系中的表达均上调，这也进一 步证实通过该方法构建的植物表达载体 pCAMBIA2301-del-ros 可以用来转化植物。本研究结果表明，植 物表达载体 pCAMBIA2301-del-ros 成功构建，为多基因植物表达载体的构建提供了一种思路，也为在植 物体内同时研究多个基因的互作提供借鉴。 关键词 植物表达载体，构建，草莓，转基因
有关植物花青素合成已有很多研究，苯丙氨酸 是花青素生物合成的直接前体，花青素属于类黄酮 化合物，其基本结构是 2-苯基苯丙呋喃。苯丙氨酸 在苯丙氨酸解氨酶、酸-4-羟化酶和 CoA 连接酶的 作用下，生成香豆酰 CoA，在苯丙氨酸解氨酶催化 的基础上产生香豆醇、松柏醇、芥子醇及其他亚类 的 植 物 酚 类 物 质 ，香 豆 酰 CoA 在 查 尔 酮 合 酶 (chalcone synthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalconeflavanone isomerase, CHI)、黄 烷 酮 - 3- 羟 化 酶 (flavanone 3-hydroxylase, F3H)的催化下产生二氢 黄酮醇，二氢黄酮醇有 3 条路径，最终在 F3H、二羟 黄 酮 醇 - 4- 还 原 酶 (dihydroflavonol- 4- reductase, DFR)的催化下生成无色花青素，在花色素合成酶 (anthocyanidinsynthase, ANS)、类黄酮-3-O-葡糖基 转 移 酶 (UDP glucose- flavonoid 3- O- glcosyltransferase, UFGT)作用下将无色花青素转变成蓝 紫色或砖红色的葡糖苷(Quattrocchio et al., 1993； Butelli et al., 2008; Chiu, Li, 2012)。
基金项目：北京市重要农作物转基因技术创新研究(No. KJCX201102003) 收稿日期：2013-11-01 接受日期：2013-12-23
农业生物技术学报
390 Journal of Agricultural Biotechnology
dihydroflavonol- 4- reductase(DFR) and UDP glucose- flavonoid 3- O- glcosyl- transferase(UFGT) were all enhanced in transgenic strawberry plant. The results were further confirmed that the plant expression vector pCAMBIA2301- del- ros could be used to transform plants. Construction of plant expression vector pCAMBIA2301-del-ros can provides a good idea for constructing a multi-gene plant expression vector and a method for studying interaction of multiple genes. Keywords Plant expression vector, Construction, Strawberry, Genetic transformation
0 引言
pCAMBIA 系列载体是植物基因工程中最常 用 的 植 物 双 元 表 达 载 体 之 一 ( 巩 元 勇 等,wk.baidu.com2013)。 pCAMBIA2301 载体在 GUS 基因的上下游均有酶 切位点，并且在 CaMV 35S 的上游有一个多克隆位 点(multiple cloning site, MCS)，这种结构比较利于 改造；另外在细菌和植物转化时所用的选择标记都 是卡那霉素(kanamycin)(Chauhan, Khurana,2011)。 基于这点 pCAMBIA2301 在植物基因功能研究中， 尤其是在双子叶植物研究中是一个非常有用的植 物表达载体。
草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物，是一种 世界各国广泛栽培的经济作物。我国草莓种植总 面积已达到 10 多万 hm2，成为世界草莓生产和消费 第一大国。草莓是双子叶植物，对卡那霉素很敏 感。草莓体内存在一条完整的花青素合成路径，采 用转录因子的调控手段，将来自金鱼草的花青素调 控基因 del 和 ros 一起转入草莓中，研究多个调节基 因如何影响花青素的。一般情况下要研究 del 和 ros 基因互作，需要对这两个基因分别进行转化，费 时而且工作量很大。本研究将这两个基因构建在 同一个植物表达载体上，然后进行遗传转化，可以 一次性将两个基因同时导入到植物中，为多基因改 良植物材料提供便利。
Online system: http://www.jabiotech.org
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(3): 389~396 DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.03.015
植物表达载体 pCAMBIA2301-del-ros 的构建及其在草莓上的验证
花 青 素 (anthocyanin) 是 一 类 存 在 于 草 莓 (Fragaria ananassa Duch.)、葡萄(Vitis vinifera L.)、苹 果(Malus domestica Borkh.)等植物中的次生代谢物 质，决定着花、种子和果实的颜色(Akifumi et al., 2008；Doshi et al., 2006)。另外，花青素可以对人体 的许多疾病如癌症、心血管疾病和神经性疾病等起 防御作用(Butelli et al., 2008)。
在花青素的生物合成中，一个结构基因的作用 是有限的，因为花青素表达水平的提高需要整个生 物合成路径结构基因都要高效表达；相比较而言， 一两个调节基因就会影响整个花青素的合成 (Quattrocchio et al., 1993)。转录因子是重要的调节 基因，MYC 或 MYB 类转录因子影响花青素合成调 控，可以显著提高紫色花青素的含量。Delila(del) 基因是 MYC 类的转录因子，是一个编码螺旋-环螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)的转录因子，其 作用是调节花青素合成的结构基因的转录水平 (Mooneyet al., 1995)。Rosea1(ros)基因是一个编码 MYB 类相关的转录因子，ros 控制着花的紫色，对 结构基因的调节作用显著(Schwinn et al., 2006)。 del 和 ros 二者互作，使紫色花青素结构酶基因高水 平 转 录 ，从 而 使 紫 色 花 青 素 水 平 大 大 提 高 (Mathews et al., 2003; Butelli et al., 2008)。 Maligeppagol 等(2013)从金鱼草(Antirrhinum majus L.)中克隆了 del 和 ros 基因，将其构建在由果实专一 性启动子驱动的载体上，利用根癌农杆菌介导的方 法转化了番茄(Solanum lycopersicum L.)，获得了转 基因番茄；与野生型对照相比，转基因番茄在成熟 果实中积累了更多的花青素，而花青素丰富的番茄 果实对其生命周期中的许多病害具有抵抗作用。
Construction of Plant Expression Vector pCAMBIA2301- del- ros and Genetic Transformation in Strawberry(Fragaria ananassa Duch.)
JIN Wan-Mei* WANG Hua
Institute of Forestry and Pomology, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100093, China * Corresponding author, jwm0809@163.com
金万梅* 王华
北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093 *通讯作者，jwm0809@163.com
摘 要 为了研究多基因互作，减少多次转化的不确定性，本研究在花青素合成调节基因 del(delila)和 ros (rosea1)的上下游分别引入 CaMV 35S 启动子和 nos 终止子，以 pBI121-del 和 pCAMBIA1301-ros 做中间载 体，并利用 BamHⅠ和 Bgl Ⅱ产生相同 4 碱基末端的片段，在连接酶的作用下将 CaMV 35S 启动子分别驱 动的 del 和 ros 基因构建在同一个植物表达载体 pCAMBIA2301 上，利用所构建的载体 pCAMBIA2301-delros 通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 介导的方法转化草莓(Fragaria ananassa Duch.)， 并进行 PCR 检测，获得转基因草莓。通过组织观察发现，转基因草莓的根和叶的颜色变成红紫色；实时 RT-PCR 分析表明，在转基因草莓中花青素合成的结构基因花色素合成酶(anthocyanidinsynthase, ANS)、查 尔酮异构酶(chalcone-flavanone isomerase, CHI)、查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)、二羟黄酮醇-4-还原 酶(dihydroflavonol-4-reductase, DFR)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)和类黄酮-3-O-葡糖 基转移酶(UDP glucose-flavonoid 3-O-glcosyl-transferase, UFGT)在转基因株系中的表达均上调，这也进一 步证实通过该方法构建的植物表达载体 pCAMBIA2301-del-ros 可以用来转化植物。本研究结果表明，植 物表达载体 pCAMBIA2301-del-ros 成功构建，为多基因植物表达载体的构建提供了一种思路，也为在植 物体内同时研究多个基因的互作提供借鉴。 关键词 植物表达载体，构建，草莓，转基因