生物技术原理与方法

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生物技术原理与方法
二、基因工程工具酶和DNA加工
基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加 工、连接等。
DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所 需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片 段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端 修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。
使其成为感受态细胞。 典型步骤： 细菌冰培上养冷激离心－收20集保存加备入用C。aCl2溶液悬浮 42℃热激
转化 (transformation) 将外源DNA导入原核细胞内部的方法。 将重组DNA与感受态细胞混合，冷激，即可完成转化。
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八、真核生物转化
根癌农杆菌法 / Ti质粒法转化植物 农杆菌可以侵染植物细胞，其Ti质粒可以整合到植
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五、PCR原理与方法
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•一般30－40个循环。单分子的理论扩增可达109 。
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六、常用载体 的种类与结构
1. 质粒载体 Plasmid
ori： 复制起点 Ampr、Tetr：抗性筛选基因 适宜的克隆位点 适当的拷贝数
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十、转基因技术在农业上的应用
1. 植物抗虫基因工程
B. 雪莲凝集素基因的应用
来源：高等植物，英国剑桥 原理：雪莲凝集素蛋白对昆虫肠道细胞表面蛋白具有特异性
凝聚作用。 基因修饰：无需修饰 表达方式：叶片和非人畜食用部分 转基因植物：水稻，大豆，玉米，大麦，马铃薯等
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药做动力。 PEG介导转化法： 在PEG和CaCl存在下的转化原生质体。 显微注射法( micro-injection)：毛细管直接注射动物细胞或原生质体 花粉管通道法： DNA沿花粉管通道直接进入胚囊。 病毒介导的转化：重组病毒先插入农杆菌T－DNA，或直接侵染
其中电击穿孔法、基因枪法和PEG最为成功
•1。利用大麦抗病基因(Mla)提高植物抗病性
• Mla 是大麦的叶绿体蛋白，可增强对白粉病菌抗病性。 Mlo 的DNA约3700bp，具有11个内含子。
• cDNA是可利用的方式 •
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生物技术原理与方法
基 因 工 程 的 基 本 原 理
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基因工程的基本原理
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2020/11/26
生物技术原理与方法
主要讲课内容
一、概论 二、基因工程 三、细胞工程 四、发酵工程 五、酶工程
(3 学时) (9 学时) (3 学时) (1 学时) (2 学时)
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一、基因工程原理与方法
基因克隆的基本原理 基因工程的工具－－酶 基因工程载体 基因文库 转基因技术 转基因策略
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•CEN4，4号染色体的着丝粒 •TEL，端粒 •ARS，自主复制起点 •TRP1和URA3，酵母选择标 记 •SUP4，蓝白斑标记
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七、原核生物的转化
（ transformation）
感受态细胞 (competent cells) 能够接受外源DNA的寄主细胞。 一般利用热激和冷激的方法改变细胞壁和质膜的结构，
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六、常用载体的种类与结构
2. 噬菌体载体 phage vector
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六、常用载体的种类与结构
3. 粘粒载体 cosmid （ 重组子37－52kb）
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六、常用载体的种类与结构
4. 酵母人工染色体 yeast artificial chromosomse (YAC)
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十、转基因技术在农业上的应用
2. 植物抗病基因工程
A. 植物抗病毒病 (基因工程疫苗)
策略：抑制病毒结构基因表达
转反义的病毒基因：外壳蛋白(CP)，移动蛋白(MP)， 复制酶基因等
RNAi技术 ：转入反向重复序列，产生发夹状RNA产 物，从而抑制相应基因的表达。
(基因工程疫苗)
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四、基因文库
• 基因组文库：Genomic library 包含所有基因组DNA片
段重组子的总和。多用于基 因结构研究。
• cDNA文库：cDNA library (Expression library) 包含所有cDNA分子的重 组子的总和。多用于基因表 达产物，即基因功能的研究。
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三、简单的基因克隆策略
•
克隆已知基因或其同源基因片段
•DNA的提取
•PCR方法扩增特异性片段
•插入载体上
•转化细菌
•筛选重组子
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三、简单的基因克隆策略
•mRNA提取 •cDNA的合成 •PCR扩增特异性片段 •转化细菌 •筛选重组子
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九、转基因生物的检测
1. Southern 检测 检测DNA。检测目的基因是否插入整合到寄 主染色体上。多使用放射性DNA探针。
2. Northern 检测 检测mRNA。检测基因的表达。多使用放射 性DNA探针或放射性RNA探针。
3. Western 检测 检测蛋白。检测基因的表达。使用目的基因 蛋白的抗体。
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四、基因文库
1. 基因组文库的构建： 基因组DNA的提取
基因组DNA的消解(随机) 补平
插入载体(连接)
•载体类型：
l噬菌体 ：23 kb 粘粒：37－52 kb •BAC(细菌人工染色体)：350 kb •YAC(酵母人工染色体)：>1 mb
扩增
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九、转基因生物的检测
1. 凝胶电泳
生物大分子在电场作用下在凝胶中的运动。 电压一定时，凝胶浓度决定了大分子运动的速度；相 对来说，分子量越大，运动速度越慢。
2.
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大分子杂交
DNA/DNA、DNA/RNA、蛋白/蛋白、蛋白/核酸 大分子电泳转移到尼龙膜上与放射性探针杂交
物细胞的染色体上。
步骤： 将目的基因克隆到Ti质粒上转化到农杆菌中利
用农杆菌侵染植物组织组织培养筛选重组子。 将目的基因克隆到Ti质粒上 Ti质粒包被钨弹利
用基因抢直接打入植物细胞组织培养筛选重组子。
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八、真核生物转化
电击穿孔法(electroporation)：制备原生质体 高压电击 DAN转移 基因枪法 (genegun)： DNA包裹金属弹 轰击真核细胞。用气体或炸
B. 改造植物脂肪种类 不饱和脂肪酸合成相关的酶类。
C. 果实延熟与保鲜 抑制有关乙烯合成酶。转反义基因序列。
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3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
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2020/11/26
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B. 改造除草剂作用的靶蛋白
不同除草剂的作用靶蛋白不同。修饰和改造靶蛋白基 因的结构，可以提高对除草剂的抗性或耐性。
将突变的EPES酶导入番茄，高抗草甘膦。
策略：强化表达
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十、转基因技术在农业上的应用
3. 植物品质改良的基因工程
A. 增加蛋白含量 转化高效表达的豆科植物储藏蛋白基因。
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十、转基因技术在农业上的应用
1. 植物抗虫基因工程
C. 蛋白酶抑制剂基因
来源：高等植物，特别是豆科植物 原理：对昆虫肠道的蛋白酶活性起抑制作用，导致消化不良，
营养匮乏死亡。 基因修饰：无需修饰 表达方式：叶片和非人畜食用部分 转基因植物：水稻，大豆，玉米，大麦，马铃薯等主要作物
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二、基因工程工具酶和DNA加工
1. DNA切割
1.2 DNase DNase I 无识别的内切酶，可产生大小均一的片段。
1.3 物理方法 利用超声波；振荡、加压等。
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二、基因工程工具酶和DNA加工
2. DNA的修饰
Phosphatase 去除DNA末端的5’ P，防止分子间的连接。
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十、转基因技术在农业上的应用
1. 植物抗虫基因工程
A. Bt蛋白基因的应用
来源：原核生物苏云金杆菌(Bacillus thurgiensis)，革兰氏阴 性菌
原理：Bt蛋白降解产生对昆虫肠道具有毒性的多肽。 基因修饰：保留毒性片段；修改编码习惯 表达方式：强化表达；特异性表达在非食用部分 转基因植物：番茄，棉花，水稻，大豆，玉米等
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十、转基因技术在农业上的应用
2. 植物抗病基因工程
B. 植物抗真菌病害 原理
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十、转基因技术在农业上的应用
2. 植物抗病基因工程
B. 植物抗真菌病害
策略：通过激活信号传导途径强化植物防卫反应基因 的表达
强化植物防卫反应基因表达：外-1,3-葡聚糖酶，几丁 质酶等
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六、常用载体的种类与结构
1. 质粒载体 Plasmid
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六、 1. 常 用 载 体 的 种 类 与 结 构
质粒载体 Plasmid
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六、常用载体的种类与结构
2. 噬菌体载体 phage vector
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二、基因工程工具酶和DNA加工
基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加 工、连接等。
DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所 需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片 段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端 修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。
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生物技术原理与方法
一、基因的结构与表达调控
• 真核生物与原核生物基因的结构
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一、基因的结构与表达调控
• 真核生物与原核生物基因的结构
•原核生物结构基因的组成 • 多数以操纵子形式存在，多个基因转录；但往往分 别翻译。 • 无内含子结构。
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转植物抗病基因 ：克隆抗病基因并转入植物中去强 化表达。
转录因子基因：希望调控防卫相关基因的表达。
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十、转基因技术在农业上的应用
3. 植物抗除草剂基因工程
A. 转耐除草剂基因
从环境微生物中筛选耐除草剂基因，降解或修饰除草 剂。
bar基因(乙酰化酶)可使PPT乙酰化失去毒性。
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二、基因工程工具酶和DNA加工
1. DNA切割
1.1 限制性内切酶 (restriction endonuclease) 类型：即I 、II / III 型酶。真正有用的是II 型酶。 命名：属命＋种名＋菌株＋顺序号 Hind III；EcoRI；BamHI。 至今已发现上千种限制性内切酶，常用的有几十种。 特异性：4－6 碱基的识别位点 HpaII：C’CGG EcoRI：G’AATTC BamHI： G’GATCC Aha III：TTT’AAA
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四、基因文库
2. cDNA文库的构建： 总mRNA的提取 反转录 cDNA合成
插入l噬菌体载体(连接)
转化进入细菌
扩增
•载体类型：
lZAP噬菌体 ：23 kb
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四、基因文库
3. 基因组文库的筛选 基因组文库培养 DNA探针或 蛋白抗体探针筛选 挑单斑 测序鉴定
Polymerase 补平DNA双链；合成DNA和RNA分子。
Exonucleases 补平DNA双链
Methylase 保护内切酶位点的降解
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二、基因工程工具酶和DNA加工
3. DNA的连接
类型 平端连接与粘端连接。
酶 T4 DNA ligase：平端连接与粘端连接 E. coli DNA ligase：粘端连接
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一、基因工程原理
• 应用实例
•1。利用Bt基因防治棉铃虫
• Bt是苏云金杆菌的晶体蛋白，具有高度特异性杀虫活性。 在昆虫消化道内降解成为活化毒性肽，导致昆虫死亡。
• 该基因无内含子结构；但与真核生物的编码嗜好不同。
•
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一、基因工程原理
• 应用实例