凯氏(Kjeldahl)定氮法

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总结凯氏定氮法

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注意事项：在蛋白质测定过程中应注意与采用氨试剂的检测项目时间错开，确保环境空气中无氨气的存在，否则将影响蛋白质的测定结果，使最终结果偏高。三、结果计算：
X4（干基）= (V1 - V0)×0.014×C×6.25 W（1-水分%）×0.1 ×100……… (4)
式中： X4 W V1 V0 C 0.014 6.25 试样的干基蛋白质含量，（%）；试样质量，（g）；滴定样品所消耗盐标准溶液体积，（mL）；滴定空白所消耗盐酸标准溶液体积，（mL）；盐酸标准溶液的浓度，（mol/L）； 1mL1mol/L 盐酸溶液相当于氮的质量，（g）；氮换算为蛋白质的系数。
c·2%的硼酸溶液：2g 硼酸加蒸馏水定容至 100mL； d·浓硫酸： e· 复合催化剂：硫酸钾或硫酸钠 97g 和无水硫酸铜 3g 的混合物； f·混合指示液：0.1%的甲基红乙醇溶液 20mL 与 0.2%溴甲酚绿乙醇溶液 30mL 混合摇匀。二、分析步骤 a·消化：称取混匀的样品 3g（精确至 0.001g），放入干燥的凯氏烧瓶中（避免样品粘在瓶颈内壁上），加入混合催化剂 10g，硫酸 25mL，轻轻摇动烧瓶，使样品完全湿润。然后将烧瓶以 45 角斜放在支架上，用电炉缓慢加热，当瓶内泡沫消失后强热至沸。待瓶壁不附有炭化物时，且瓶内液体为澄清浅绿色后，继续加热 30min 使其完全分解（以上操作应在通风橱内进行）。 b·蒸馏：将消化好并冷却至室温的样品溶液全部转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度摇匀。向 100mL 接受瓶中加入 20mL2% 硼酸溶液和 2～3 滴混合指示液，将接收瓶置于冷凝管下口，使下口浸入到硼酸接收液中。再吸取 10mL 定容后的样品液，沿小玻璃杯移入反应室，并用少量的蒸馏水冲洗小玻璃杯，塞紧棒状杯塞。向小玻璃杯中加入 20～30mL40%的氢氧化钠溶液（过量），慢慢提起棒状杯塞，使氢氧化钠缓慢流入反应室（防止反应室气体从杯塞处外泄），立即塞紧棒状杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸馏水使之密封。通入蒸汽 5min，降低接收瓶位置使冷凝管末端离开液面后再继续蒸馏 1min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。 c·滴定：用 0.01mol/L 的盐酸或硫酸标准溶液滴定接收瓶瓶中的液体，使之刚刚出现灰紫色即为终点，记录所消耗 0.01mol/L 的盐酸或硫酸标准溶液的体积（mL）。

凯氏定氮法的原理和应用

凯氏定氮法的原理和应用1. 原理凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定有机物和无机物中氮含量的方法。

它是由丹麦化学家Johan Kjeldahl在19世纪末发明的，被广泛应用于农业、环境科学、食品科学等领域。

该方法的原理是将样品中的有机氮化合物通过化学反应转化为无机氮的形式，然后用适当的碱溶液滴定测得，根据滴定所需的氢氧化钠溶液的体积来计算样品中氮的含量。

主要的反应过程如下： 1. 样品的消解：将样品与浓硫酸混合，并用加热使其反应，将有机氮化合物转化为氨的形式，生成硫酸铵和硫酸氢铵等化合物。

2.高温蒸煮：为了彻底转化所有有机氮化合物，通常需要将样品在高温下进行长时间的蒸煮。

3.酸碱中和滴定：将反应液冷却后，用稀硫酸或盐酸将其中的硫酸铵和硫酸氢铵转化为氨盐的形式。

然后，用氢氧化钠溶液进行滴定，将生成的氨中和，滴定至终点，终点可根据指示剂的改变来确定。

2. 应用凯氏定氮法广泛应用于以下领域：2.1 农业科学在农业科学中，凯氏定氮法常被用于测定土壤中的氮含量。

土壤中的氮是农作物生长所需的重要养分之一，准确测定土壤中的氮含量可以指导农民合理施肥和调节土壤养分，提高农作物产量和质量。

2.2 环境科学在环境科学研究中，凯氏定氮法可以用于测定水体、土壤和植物中的氮含量。

通过测定这些样品中的氮含量，可以评估水质、土壤质量和生态系统的健康状况，为环境保护和生态修复提供科学依据。

2.3 食品科学在食品科学领域，凯氏定氮法常用于测定食品中的蛋白质含量。

蛋白质是食品中重要的营养成分之一，准确测定食品中的蛋白质含量可以评估食品的营养价值和质量。

此外，凯氏定氮法还可以用于测定肥料中的氮含量、动物组织中的氮含量等。

3. 操作注意事项在使用凯氏定氮法时，需注意以下事项：•保持实验室的安全性，使用专门的消解设备，避免与强酸接触。

•样品的精确称量和溶解步骤十分重要，需要精确控制反应条件，以确保样品中的有机氮完全转化为氨。

凯氏定氮法的注意事项及操作要点

凯氏定氮法的注意事项及操作要点
凯氏定氮法是一种测定样品中氨氮含量的方法，以下是该方法的注意事项和操作要点：
1. 注意安全：在操作过程中，需要注意避免与凯氏试剂直接接触皮肤和眼睛，避免吸入氨气。

操作时需戴上实验手套和防护眼镜。

2. 样品处理：样品中的氨氮需要转化为氨气，因此需要先将样品与碱性试剂（如氢氧化钠溶液）和还原剂（如亚硫酸钠溶液）进行反应，将氨氮转化为氨气。

3. 容器选择：凯氏定氮法使用的装置一般为Kjeldahl管、凯氏瓶和蒸馏装置，需要确保这些容器的密封性能良好，以防止氨气泄漏。

同时，应选择耐热、耐腐蚀的材料。

4. 消除干扰：在实际分析中，可能会存在一些干扰物质，如硝酸盐、亚硝酸盐等。

针对这些干扰物质，可以采取添加还原剂去除亚硝酸盐，或使用降解法将硝酸盐转化为氨氮等方法来进行消除。

5. 酸碱滴定：将反应液中的氨氮转化为盐酸，然后再进行酸碱滴定来测定氨氮含量。

此时需要注意滴定时机和操作技巧，确保滴定的准确性。

6. 计算结果：根据滴定所消耗的酸碱溶液体积和其浓度，计算出氨氮含量。

注意结果的单位和精度，避免计算错误。

总之，在进行凯氏定氮法测定时，需要严格掌握操作要点和注意事项，确保结果的准确性和可靠性。

此外，注意实验室的通风和安全设施，保证操作过程中的安全。

6种方法测定蛋白质含量

一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2 CH2 COOH+3H2 场―2CO2+3SO2+4H2O+NH3（1）2NH3+H2 SO4（NH4）2 SO4（2）（NH4）2 SO4+2NaOH2H2 O+Na2 SO4+2NH3（3反应⑴、（2）在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入CuSO4乍催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。

收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。

如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。

二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCON是3两个分子脲经180C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定范围为1-10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材1.试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。

如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。

凯氏定氮法

凯氏定氮法凯氏定氮法（英语：Kjeldahl method，全称凯耶达尔定氮法，简称凯氮法）是分析化学中一种常用的确定有机化合物中氮含量的检测方法。

这种方法是由凯耶达尔于在1883年发明。

凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。

要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变成无机氮，再进行测定。

一、原理：凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。

为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。

硫酸铜起催化剂的作用。

凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。

使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。

消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。

滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。

在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。

测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。

以蛋白质为例，反应式如下：消化：蛋白质+ H2SO4→（NH4）2SO4+ SO2↑+ CO2 ↑+ H2O蒸馏：（NH4）2SO4 + 2NaOH→ Na2SO4+ 2 H2O + 2NH3 ↑2NH3 + 4H3BO3→（NH4）2B4O7+ 5H2O滴定：（NH4）2B4O7+ 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4 H3BO3蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量[约在14％~18％，平均为16％（质量分数）]。

微量凯氏(Mirco-Kjeldahl)定氮法

浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，借水蒸汽将产生的氨蒸馏蒸馏到一定蒸馏的量和浓度的硼酸溶液中（紫红色），硼酸吸收氨后（绿色），（紫红色）（绿色）氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降使溶液中氢离子浓度降滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为低。然后用标准无机酸滴定滴定止（紫红色），最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中（紫红色）氨的摩尔数）计算计算出待测物中的氮量。计算
器材
1、改良型凯氏定氮仪 2、10mL微量酸式滴定管 3、酒精灯（打火机） 4、凯氏烧瓶 5、锥形瓶（50~100毫升）、容量瓶（50毫升）
试剂
1、0.1mg/mL 标准（NH4）2SO4 2、30% NaOH溶液 3、2%硼酸 4、标准HCl （0.0100M） 5、混合指示剂（田式指示剂）
4. 蒸馏空白
⑴ 操作如蒸馏样品，空白不加（NH4）2SO4，而是5mL蒸馏水及5mL NaOH ⑵ 第3个锥形瓶收集完后，清洗反应室，放掉废水，滴定第2，3两只锥瓶内溶液，当硼酸溶液刚由绿变回淡紫色时为滴定终点，记录所用盐酸的量。
6. 计算
样品含N量（NH4）2SO4样品含量（mg/mL）= C (V1-V2) ×14 / V ）
微量凯氏（微量凯氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法）
目的
1、学习微量凯氏定氮法的原理 2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含量的测定，未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。
原理（消化、蒸馏、滴定、计算）
凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）的含氮量。天然的含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。消化” 消化（但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。）

凯氏定氮法原理

凯氏定氮法原理
凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的确定有机物中氮含量的化学测定方法。

其原理是将样品中的有机氮化合物经过一系列化学反应转化为无机氮化合物，再以标准化的方法测定生成的无机氮化合物的氮含量。

具体的步骤如下：
1. 取一个已知质量的样品，在水中溶解或者研磨成细粉末。

2. 将样品转移到凯氏消解瓶中，加入适量的浓硫酸。

3. 使用适当的消解器对样品进行消解。

在这个过程中，硫酸将有机氮化合物氧化为氨。

4. 将消解瓶中的溶液加热，使硫酸与氨反应生成硫酸铵。

H2SO4 + 2NH3 → (NH4)2SO4
5. 硬蒸发：将反应产物溶液转移到蒸发皿中，连续加热使溶液蒸发，直至生成块状固体。

6. 汲取蒸发皿中的固体，转移到蒸发烧杯中，加入适量的蒸馏水。

7. 加入酚酞指示剂，用稀氨水滴定生成的硫酸铵溶液，直至溶液呈现由粉红色到淡红色的变化。

8. 记录滴定过程中用掉的氨水体积，根据滴定液的浓度计算出氨的摩尔浓度。

9. 根据反应平衡关系计算出样品中有机氮化合物的质量，从而确定氮的含量。

凯氏定氮法主要适用于测定含氨基的有机化合物，如蛋白质、碱性氨基酸等的氮含量。

这种方法的优点是准确性高，并且适用范围广。

然而，它的操作步骤较为繁琐，消耗时间较长，且需要使用一些具有腐蚀性的试剂，需注意安全操作。

凯氏定氮法测定蛋白质含量

凯氏定氮法测定蛋白质含量简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它通过将样品中的有机氮转化为氨，然后将氨转化为氨基氮，再由氨基氮计算得出蛋白质的含量。

这个方法的优点是稳定可靠，适用于各种类型的样品。

实验原理凯氏定氮法的实验原理如下：1.样品预处理：将待测样品进行预处理，去除样品中的非氮有机物。

这样可以确保凯氏定氮方法只测定到蛋白质中的氮。

2.消化反应：将预处理后的样品与硫酸相结合，加热至沸腾。

在这个过程中，有机氮将被转化为氨。

3.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。

4.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。

5.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束，测定出反应过程中消耗的酸的体积。

6.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。

实验步骤以下是凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验步骤：1.准备样品：根据实验需要，准备待测样品。

样品的选择应根据实验目的和样品的特性进行。

2.样品预处理：将样品经过细碎、研磨等处理，去除样品中的非氮有机物。

3.消化反应：将预处理后的样品与浓硫酸相结合，加热至沸腾。

消化时间一般为2小时。

4.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。

5.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。

6.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束。

7.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。

实验注意事项1.在进行样品消化时，必须控制好加热温度，避免样品的溢出和烧焦。

2.在进行滴定时，应注意控制滴液的速度，避免过量的酸滴入。

3.实验过程中需注意个人安全，避免触及强酸和强碱。

01 生物化学实验--凯氏(Kjeldahl)微量定氮法测定血清蛋白质含量

凯氏（ Kjeldahl ）微量定氮法测定血清蛋白质含量【目的】1 ．掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括未知样品的消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。

2 ．熟悉微量凯氏定氮法的原理。

【原理】凯氏定氮法是蛋白质含量测定的经典方法，它是根据蛋白质分子中含氮量来测定的，各种蛋白质含氮量比较近似，平均约为 16 ％，即 1g 氮相当于 6.25g 蛋白质。

由测定出的氮量即可换算出蛋白质含量。

血清蛋白质或其它有机含氮物与浓硫酸加热进行消化 ( 氧化 ) 时，其中碳、氢、氧元素分别被氧化为二氧化碳和水，而氮原子则转变成氨，后者与硫酸结合生成硫酸铵，留在溶液中，为了加速有机物质的氧化分解，在消化时加入硫酸铜做为催化剂，加入硫酸钾以提高消化液的沸点。

硫酸铵与氢氧化钠作用，放出氨，通过水蒸气蒸馏将氨带入接收瓶中被硼酸溶液吸收，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，用已知浓度的标准盐酸滴定，直至原来溶液中氢离子的浓度恢复，即指示剂变为原来的颜色。

根据所消耗的标准盐酸量，即可计算出样品中的总氮量。

化学反应式如下：1 ．消化含氮化合物 +H 2 SO 4 —→CO 2 ↑+H 2 O +(NH 4 ) 2 SO 4 +SO 2 ↑2 ．蒸馏(NH 4 ) 2 SO 4 + 2NaOH—→2NH 4 OH+Na 2 SO 4NH 4 OH—→NH 3 ↑+ H 2 O3NH 3 +H 3 BO 3 —→(NH 4 ) 3 BO 33 ．滴定(NH 4 ) 3 BO 3 +3HCl—→3NH 4 Cl+H 3 BO 3以上测定为样品中的总氮量，由总氮量减去非蛋白氮，即为蛋白质含氮量，再乘以 6 . 25 即为血清蛋白质含量。

【器材】1 ．电炉2 ．铁三角架3 ．酒精灯4 ．锥形瓶5 ．消化管（凯氏烧瓶）6 ．滴定管7 ．微量凯氏定氮器8 ．刻度吸量管9 ．玻璃珠10 ．漏斗11 ．血清【试剂】1 ．硫酸钾粉末2 ． 12 . 5 ％硫酸铜水溶液3 ．浓硫酸4 ． 2 ％硼酸水溶液5 ．混合指示剂取 0 . 1 ％溴甲酚绿乙醇溶液 10ml 与 0 . 1 ％甲基红乙醇溶液 4ml 混合6 ． 30 ％氢氧化钠溶液7 ． 0 . 0lmol / L 盐酸标准溶液【操作】一、消化取消化管二支，标明测定管与空白管，按下表进行操作：混匀，置于电炉上加热消化（图 3-1 ），开始有水蒸气逸出，继而溶液呈现棕色并冒出白烟 (SO 3 ) ，此时火力应减小，并在管口上盖一小漏斗，以免硫酸损失过多，再继续消化至溶液变为澄清的蓝绿色，即消化完毕 ( 此过程约需 25 分钟左右 ) ，冷却后加水 3 . 8ml ，使总量成为 5ml( 内有 1 . 2ml 硫酸 ) ，混匀，准备蒸馏。

凯氏定氮法测定原理

凯氏定氮法测定原理
Kaiser法，又称为Kjeldahl定氮法，是一种常用的定氮分析方法，它是根据氨和氮的化学反应来测定氮含量。

该方法由Hermann Kaise（1842-1900）于1883年首次提出。

它可以测定含氮的有机物的氮含量，包括氨、胺、蛋白质、核酸、氨基酸等。

实验步骤为：
（1）将待测样品（植物、矿石、油、塑料、煤等）加入硫酸氢钠的溶液中，加热混合。

（2）将混合物用硝酸钠水溶液滤液，将滤液转移到烧杯中，加入氢氧化钠溶液，再通入硫氰酸钠溶液。

（3）收集产生的氨气，经洗涤后，采用酒精灯烧液中氨气，得到硝酸铵溶液。

（4）将硝酸铵溶液加入到酸性氧化液中，当氧化后有过量电子，再加入KMnO4溶液，氧化过量电子，经滤液，可以得到含有氮的酸性液体。

（5）把滤液用碱量计测定酸性液体中的氮含量。

经公式计算可得样品中氮含量。

总结
Kaiser定氮法是一种用于测定有机物中氮含量的常见定氮分析方法，它的基本原理是：使用硝酸钠水溶液滤液得到氨气，将氨气采用酒精灯烧液得到硝酸铵溶液，然后将硝酸铵溶液加入到酸性氧化液中氧化出过量电子，经滤液后，将滤液加入碱量计测定，从而得到样品中氮含量的数值。

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5种蛋白质分析方法

蛋白质分析方法1、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。

含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。

经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

若以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1)2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。

为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。

收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

实验和计算方法这里从略。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。

如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

评价：总氮-非蛋白氮=蛋白质氮——>蛋白质含量灵敏度低，误差大，耗时长。

2、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。

在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。

凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

测定范围为1-10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。

凯氏定氮法实验报告

姓名：马倩学号：0902041144 系年级：09级工业分析蛋白质浓度测定Kjeldahl method for measurement of protein--微量凯氏定氮法摘要凯氏定氮法的仪器设备简单，测定过程也较简便，又能同时测定多个试样，多用于化工生产的常规分析。

但此法不能直接用于硝基化合物，亚硝基化合物，偶氮化合物，肼，等的测定关键词：消化，碱化蒸馏，吸收，滴定Abstract ：the Kjeldahl apparatus has the advantages of simple equipment, the determination process is simple, and can simultaneously measure a plurality of samples, are used for chemical production routine analysis. But this method can not be used directly for nitro compound, a nitroso compound, azo compounds, such as hydrazine, determination ofKey words:digestion, alkali distillation, absorption, titration一、【实验目的】1. 掌握凯氏（Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量的原理和方法2. 学会使用凯氏定氮仪二、【实验原理】凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。

为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，硫酸铜起催化剂的作用。

使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有机物氧化。

凯氏定氮法

一、凯氏（kjeldahl）定氮法优点：用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少优点①可用于所有食品的蛋白质分析中;②操作相对比较简单;③实验费用较低;④结果准确,是一种测定蛋白质的经典方法;⑤用改进方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的蛋白质缺点①最终测定的是总有机氮,而不只是蛋白质氮;②实验时间太长(至少需要2h才能完成);③精度差,精度低于双缩脲法;④所用试剂有腐蚀性.灵敏度低适用于0.2-1.0mg氮干扰物质：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）；费时太长二Folin-酚试剂法优点：操作简便，灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。

缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。

而且对后者的影响还要大得多。

酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。

浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。

含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。

若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg。

通常测定范围是20~250mg。

三、Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

凯氏定氮法

凯氏定氮法1. 简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种用于测定有机物中氮含量的常用方法。

它是以丹麦化学家尤利乌斯·凯尔达尔（Johan Gustav Kjeldahl）的名字命名的，凯尔达尔于1883年首次提出了这种方法。

该方法适用于几乎所有的有机物样品，例如农产品、食品、肥料、土壤和水等。

凯氏定氮法的优点包括简单、准确、可靠，并且适应性强。

2. 测试步骤步骤一：样品处理将待测样品称取一定量（通常1-2g），精确称量并记录质量。

步骤二：消解将样品转移到凯氏消解管中，加入适量的浓硫酸（H2SO4）。

为使反应顺利进行，可以加入一些催化剂，如汞硫化物（HgS）。

经过消解，样品中的有机氮转为无机氮盐，主要形式为硫酸铵（NH4HSO4）。

消解期间要保持适当的温度控制，一般在沸水浴中加热1-2小时，直至反应结束。

步骤三：蒸馏将消解液转移到凯氏蒸馏装置中，加入含有氢氧化钠（NaOH）和含有酚酞指示剂的接收瓶中。

蒸馏器中的氢氧化钠用于吸收硫酸铵产生的氨气，并将其转化为氨水（NH4OH）。

使用蒸馏水蒸馏样品溶液，将氨气从样品中分离出来。

通过连续蒸馏过程，将氨气捕集在接收瓶中。

蒸馏过程中，要注意控制好蒸馏速度，并确保溶液中氨气的完全转化。

步骤四：滴定将收集到的氨水与盐酸（HCl）标准溶液进行滴定，用来确定氨气的数量。

滴定过程中，使用酚酞指示剂作为指示剂，使溶液在转变至中性时由红色变为无色。

通过滴定得到的氨氮量与消解液中样品的氮量成正比。

3. 计算氮含量根据凯氏定氮法的原理，可以通过以下公式计算样品中氮的含量：氮含量（%） = 滴定液中的NH3-N浓度（mol/L） × 滴定体积（L） ÷ 样品质量（g）4. 注意事项•操作过程中要注意安全，避免与强酸和强碱接触，戴上实验手套和护目镜。

•操作前应将仪器设备清洗干净，以免产生误差。

•消解液中加入的催化剂必须少量使用，过多会导致滴定过程中的误差。

凯氏定氮法原理资料

凯氏定氮法原理资料
一、定氮原理
定氮也叫氮氮定定，是用于测定有机物中氮含量的微量化学分析法。

它通过测定被分析物中氮含量而可知有机物的含氮量，是一种常用的分析方法，可用于测量有机物的氮含量，还可用于测量无机物中的氮含量。

二、凯氏定氮法原理
凯氏定氮法（Kjeldahl法）是一种检测有机物中氮含量的定性和定量化学分析法，它是从1883年由凯氏发现的。

原理是将检测物的氮先与硫酸盐反应，把氮转变为氨氮（NH3），然后利用钠氢溴酸将氨氮直接归结为氢气，最后用钠钡量定氢气的量，从而计算其氨氮含量。

三、凯氏定氮法实施过程
1.准备检测样本：从样本中取出一定的有机物放入容器中。

2.液化：用酸性高硫酸混合物将有机物腐蚀变成液形，形成氮化物。

3.氮化：将液化的物质煮至全部溶解，放入H2O2，NH3气体被溶解，氧气也会被溶解，形成硝酸盐和亚硝酸盐，NH3气体被释放，液体变成浓酸。

4.吸附：用浓硼酸吸附氮气，形成硼锆酸，其中含有氮气。

5.酸碱氧化：水合硼锆酸通入碱溶液，氧化硼锆酸将硼锆酸水解成氢气和氧气，氢气释放出，形成硫酸盐，NH3气体被释放出。

6.量取：将氢气收集，然后用钠钡溶液测量氢气的含量。

微量凯氏定氮法

微量凯氏定氮法目的1. 掌握应用微量凯氏定氮法测定样品总氮量/蛋白质的原理和方法2. 学会使用凯氏定氮仪原理凯氏(Kjeldahl)定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氮基酸等)的含氮量。

含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被分别氧化成CO 2和H 2O ，氮则转变为氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵，是为“消化”。

该反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾/硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂促进反应的进行。

以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下：NH 2浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，可借助水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量及一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中的氢离子浓度降低；然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中氨的当量数)即可计算出待测样品中的氮含量。

OH NH SO Na NaOH SO NH 4424222)4(+→+↑+→324NH O H OH NH324333BO H NH BO H NH →+334324BO H CL NH HCL BO H NH +→+滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.2~5.6，将NH 4H 2BO 3的蓝/绿色滴至原来H 3BO 3的蓝紫色即为终点。

本法适用范围0.2~1.0mg 氮，相对误差应小于2%。

材料、试剂与器具材料鱼肉、血清等含蛋白质样品试剂1. 浓硫酸(化学纯)2. 30%氢氧化钠(分析纯)溶液3. 硫酸钾-硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜以3:1 (W/W)配比混合研磨成粉末4. 混合指示剂：0.1%甲烯蓝乙醇溶液50ml 与0.1%甲基红乙醇溶液200ml 混合配成(贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏)5. 0.0500M HCl↑↑↑+++→+32224224323NH O H SO CO SO H COOH CH 424423)(2SO NH SO H NH →+6. 硼酸-指示剂混合液：2%硼酸溶液100ml，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可(约加1ml左右混合指示剂)。