分光光度法测定叶绿素含量

一、实验目的1.了解植物组织中叶绿素的分布及性质。

2.掌握测定叶绿素含量的原理和方法。

二、实验原理叶绿素广泛存在于果蔬等绿色植物组织中，并在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体。

当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素很不稳定，对光、热较敏感；在酸性条件下叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，在稀碱液中可水解成鲜绿色的叶绿酸盐以及叶绿醇和甲醇。

高等植物中叶绿素有两种：叶绿素a 和b ，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。

叶绿素的含量测定方法有多种，其中主要有：1.原子吸收光谱法：通过测定镁元素的含量，进而间接计算叶绿素的含量。

2.分光光度法：利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用朗伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。

叶绿素a 和叶绿素b 在645nm 和663nm 处有最大吸收，且两吸收曲线相交于652nm 处。

因此测定提取液在645nm 、663nm 、652nm 波长下的吸光值，并根据经验公式可分别计算出叶绿素a 、叶绿素b和总叶绿素的含量。

三、仪器、原料和试剂仪器分光光度计、电子顶载天平(感量0．01g)、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦境纸、滴管。

原料新鲜(或烘干)的植物叶片试剂1. 96％乙醇(或80％丙酮)2. 石英砂3. 碳酸钙粉四、操作步骤取新鲜植物叶片(或其它绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。

称取剪碎的新鲜样品2g ，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL ，继续研磨至组织变白。

静置3～5min 。

取滤纸1张置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗，滤液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。

直至滤纸和残渣中无绿色为止。

最后用乙醇定容至100mL ，摇匀。

取叶绿体色素提取液在波长665nm 、645nm 和652nm 下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。

五、计算按照实验原理中提供的经验公式，分别计算植物材料中叶绿素a 、b 和总叶绿素的含量叶绿素a= （12.7 A 665 -2.69 A 645）×WV ⨯1000 叶绿素b=（12.7 A 645 - 2.69A 665）× WV ⨯1000 总叶绿素a=（20.0A 645 + 8.02 A 665 ）× WV ⨯1000 或总叶绿素a= W V A ⨯⨯10005.34652几种叶绿素含量测定方法比较叶绿素含量是植物生长过程中一个重要的生理指标,由于其对周围环境很敏感,并与植物的光合作用、营养吸收等密切相关,被广泛作为植物生长的常规测定指标项目。

叶绿素含量的测定方法有多种,在国际上以传统的Arnon法(也称研磨法)应用最为广泛。

但该法需要把植物材料研磨并经转移、过滤或离心处理,不仅工作量大,而且不可避免地使试验人员较长时间与挥发于空气中的试剂相接触,对人体损害较大。

近年来,直接浸取法受到重视,张宪政等用不同配比的混合液对叶绿素进行提取,证明了用混合液提取的可行性。

李得孝,吴志旭等对传统的Arnon法进行了改进,将样品冷冻处理后,用50℃丙酮静置提取并进行测定,极大提高了工作效率。

(1)研磨法。

称取0. 5 g样品于研钵内,加入少量CaCO3和5 mL 80%的丙酮,将材料充分研磨细碎直至变白(约5 min),转移至10 mL具塞离心管中,定容至刻度,摇匀后置于4℃冰箱中静置12 h,离心10 min (2000 r/min),取上清液测定。

(2)直接浸取法。

称取0. 5 g样品放入10 mL具塞离心管中,用80%丙酮定容至刻度,于暗柜中静置72 h浸取,取上清液测定。

(3)样品冷冻后用50℃提取液提取法。

称取0. 5 g样品于10 mL具塞离心管中,置冰箱中冷冻2h,取出后加入10mL在水浴锅中加热至50℃的80%丙酮,充分振摇后于暗柜中静置4h,取上清液测定。

（4）叶绿素计法：叶绿素计是所有方法中最快捷的，你只需手持叶绿素计，将叶片插入仪器的感应部位，然后合上测量探头即可。

应用于这种测定的仪器又被叫做便携式叶绿素仪，因为该叶绿素计拥有小巧的机身，仅200g的重量，可以方便地装入口袋并带到现场进行测量。

在以上几种测定方法中，直接浸取法提取效果最好,但耗时长,传统研磨法叶绿素的损失较大,冷冻后用50℃提取液提取法操作简便且提取速度较快,在提取率和稳定性方面均显示良好的优越性。

冷冻后用50℃提取液提取法的最优试验条件为将试验材料冷冻1 h后,静置提取3 h。

而叶绿素仪法，则相较于其他三种化学方法，更加快速方便。

而且用SPAD-502测定叶绿素含量时，不会对叶片造成损伤，这也是使用叶绿素计的另一大好处。

因为你不需要摘下叶片，直接用仪器夹住叶片测定即可，这样就可以在作物的生长过程中全程对特定的叶片进行监测，从而得到更科学的分析结果。

分光光度法快速测定玉米叶片中的叶绿素作者:作者：潘玲玲徐晓洁谭晶晶张海艳乔英哲张晔晖来源：医学期刊 / 基础医学与生物医学工程收藏本文章【关键词】叶绿素,SPAD值,玉米叶,分光光度法摘要以玉米叶片为材料，利用双波长双光束紫外可见分光光度计，用最大决定系数增量回归算法，研究了叶片叶绿素a、b及SPAD值同时、快速测量方法。

结果表明，用3个波长点建立的模型可以达到良好的预测效果，预测叶绿素a、b及SPAD值的相关系数分别为0.9919、0.9816和0.9757；标准差分别为1.52、0.43和1.96；预测相对标准差分别为4.64%、5.50%和4.88%。

同时研究了仪器波长误差和带宽变化对测定结果的影响, 发现波长偏移超过0.2 nm,误差快速增大，且波长向长波方向偏移时对测量的影响要大于向短波方向偏移的影响；仪器带宽变大，预测误差也就越大。

关键词叶绿素，SPAD值,玉米叶，分光光度法1 引言叶绿素a、叶绿素b的含量的测定一般用光谱方法。

先用某种溶剂（如丙酮等）提取叶绿素，然后用光谱仪器测定[1,2]，这类方法操作繁琐，耗时太长。

而活体叶片中叶绿素的测量一般只能测定叶绿素总量或SPAD(soil and plant analyzer development)值[3]。

同时测定叶绿素a、叶绿素b和SPAD值的方法，尚未见报道。

本研究以玉米叶片为材料，利用双波长双光束紫外可见分光光度计，用最大决定系数增量回归算法，研究了叶片叶绿素a、叶绿素b及SPAD值同时、快速测量方法；研究了仪器波长误差和带宽变化对测定结果的影响。

本研究既可作为实验室快速测量的方法，也为开发研制野外活体叶片快速、无损测定仪器提供了参考。

2 实验部分2.1 仪器与试剂557型紫外可见分光光度计（日本日立公司）；60片玉米叶片，SPAD 值用SPAD502测量仪测定；叶绿素a、叶绿素b含量用Arnon法测定。

2.2 实验方法在分光光度计上，用双波长方式，参比波长为750 nm；扫描区间为590 ～700 nm，分别在带宽为2、4、6、8、10 nm测量60片玉米叶片的吸收光谱。

测得的光谱图经过实验室自主开发的光谱数字化系统，每隔0.1 nm采集一个数据，得到数字化的光谱图。

3 结果与讨论3.1 叶片的吸收光谱图图1是带宽为2 nm时的光谱，吸收峰值约680 nm，噪声很小，其它带宽下测得的图谱也类似。

3.2 数学模型的建立在590~700 nm的波长范围，每隔1nm取一个吸光值，用最大决定系数增量回归算法来建立模型。

选出叶片叶绿素a、叶绿素b和SPAD值同时测定的最优波长，即选择预测相对标准误差最小的波长组合。

结果表明：当只选择一个波长时，是625 nm；选择两个波长点时，最优组合是635和625 nm；选择３个波长点时，最优组合是635、625和610 nm；选择４个波长点时，最优组合是635、625、610和655 nm；选择5个波长点时，最优组合是635、625、610、655和700 nm；选择6个波长点时，最优组合是635、625、610、655、700和595 nm。

图2是以上6种组合时各种物质的预测相对标准差。

图1 60片玉米叶片吸收光谱图（略）Fig.1 Ａbsorption spectra of 60 maize leaves图2 不同波长数目的预测效果（略）Fig.2 Ｐrediction (RSD) of the models with different wavelength number从图2中可以看出，所用波长数越多，测量效果越好。

但这种变化越来越缓慢，尤其是3个波长以后，随着波长数目增加，测量效果改善不显著。

此外，叶绿素b的测量效果不如叶绿素a的测量效果好，而SPAD值的测量效果不同波长的差异不大；可能是叶绿素b的含量较低，化学值测量的相对误差较大；而SPAD值本身是用一个波长的吸收而得，所以较容易准确测定；总体上，当选３个波长点组合，３种组分测定的相对标准差约5%，如图3和图4所示。

图3 叶绿素a（Ａ）和叶绿素b（B)预测集的散点图（略）Fig.3 Diagram of the prediction result of chlorophyll a (A) and chlorophyl b (B)图4 SPAD预测集的散点图（略）Fig.4 Diagram of the prediction result of Soil and Plant Analyzer Development (SPAD)图3A和B以及图4分别是叶绿素a、叶绿素b和SPAD值测量时选择波长635 nm、625 nm 以及610nm组合建立模型的预测效果图。

这时叶绿素a、叶绿素b和SPAD值测量的预测相关系数分别是09919、0.9816和0.9757；预测标准差分别是1.52、043和1.96；预测相对标准差分别是4.64%、550%和4.88%；满足叶片分析测量的要求。

3.3 仪器波长误差对测量的影响研究用635、625和610 nm 3个波长所建立的模型，当测定样品时仪器波长发生偏移对测量结果的影响。

当波长偏移±0.1 nm、±0.2 nm、±0.5 nm、±1 nm时引起的相应测量误差如图5所示。

从图中可以看到，波长偏差±0.1 nm，±0.2 nm，叶绿素a、叶绿素b的RSD 值变化将近到达50%，对SPAD值测量的影响虽不如叶绿素a、叶绿素b明显，但是当波长偏移超过0.2 nm时，影响也很大，所以叶绿素的测量对仪器的波长准确性要求很高。

3.4 仪器带宽变化对测量的影响利用带宽6 nm这组光谱数据，用635、625以及610 nm ３个波长建立的模型，预测在仪器带宽为2、4、8、10 nm下测量的相应样品，结果如图6所示。