病毒转基因技术原理 腺相关病毒
病毒转基因技术原理腺相关病毒课件
腺相关病毒的监管现状与政策建议
监管机构
各国政府设立了相应的监管机构 ，负责监督和管理病毒转基因技
术的研发和应用。
法规制定
各国政府制定了一系列法规和标 准，以确保病毒转基因技术的安
全性和可靠性。
政策建议
建议各国政府加强国际合作，共 同制定和完善病毒转基因技术的
监管政策和标准。
未来展望与研究方向
未来展望
06
CATALOGUE
腺相关病毒的安全性评价与监管现状
腺相关病毒的安全性评价
宿主范围
腺相关病毒的宿主范围窄，主 要感染分裂期细胞，对静止期
细胞不感染。
免疫原性
腺相关病毒的免疫原性低，不 会引发明显的免疫反应。
基因整合
腺相关病毒的基因整合频率低 ，不会引起基因突变。
毒性
腺相关病毒的毒性很低，对动 物和人体无毒害作用。
病毒转基因技术原 理腺相关病毒课件
目录
• 病毒转基因技术概述 • 腺相关病毒概述 • 腺相关病毒作为基因治疗载体的优势与局
限 • 腺相关病毒的基因转移机制 • 腺相关病毒在基因治疗中的应用案例 • 腺相关病毒的安全性评价与监管现状
01
CATALOGUE
病毒转基因技术概述
病毒转基因技术的定义与特点
04
新产生的病毒粒子通过 细胞膜释放到细胞外， 完成基因转移过程。
腺相关病毒的免疫反应与逃逸机制
宿主细胞对腺相关病毒的感染会产生 免疫反应，如产生抗体和细胞毒性T 细胞等。
了解腺相关病毒的免疫反应与逃逸机 制有助于提高基因转移效率和安全性 。
腺相关病毒通过逃逸机制逃避宿主细 胞的免疫攻击，如抗原变异和免疫抑 制等。
总结词
腺相关病毒在罕见病基因治疗中具有独 特优势，为罕见病患者提供了新的希望 。
转基因生物技术的原理及安全性评估
转基因生物技术的原理及安全性评估随着人类科技的快速发展，转基因生物也渐渐开始进入我们生活和工作的各个领域中。
那么，究竟什么是转基因技术? 转基因生物技术有何原理？它的安全性又如何评估呢？一、什么是转基因技术？转基因技术，也称为基因工程技术，是指利用现代生物技术手段人为地将来自不同生物的DNA序列重新组合并重新插入目标生物中从而改变其基因组的一种技术。
它是把不同物种的基因转移或直接合成新的基因，化学合成后，经过特定载体（一种辅助物质）进行导入目标生物中，从而在基因、染色体或单一细胞水平上改变生物特性的技术。
二、转基因生物技术的原理转基因生物的制备过程主要可分为以下几个步骤：1、提取经筛选的外源基因首先我们要明确，所谓外源基因是指指来自不同生物体外来源的基因，即我们常说的外来基因。
转基因技术就是先从非目标生物中选择合适的外源基因，再将其从原有宿主生物的基因组中提取出来。
提取方法多种多样，以PCR技术为主。
在PCR反应中加入合适的引物，用引物扩增出外源基因DNA片段，并通过基因测序验证其正确性。
2、将外源基因与载体DNA连接为了能将外源基因高效导入到目标细胞中，需要利用载体将外源基因进行包装和转化。
常用的载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、大肠杆菌等。
在将外源基因插入载体DNA的过程中，需要用限制性内切酶将载体DNA中的目标插入位点进行剪切，同时也需要用同源重组技术进行连接。
3、导入目标细胞中载体和目标细胞的转染是重要的步骤，其中腺病毒和逆转录病毒能够自主将目标基因导入细胞核，而质粒则需要借助电穿孔、高压注射及微射流等手段将质粒导入细胞。
此时，外源基因进入到目标细胞的染色体中，并被细胞正常的生命活动所操纵。
4、筛选与鉴定目标基因工程菌株细胞将外源基因整合到基因组中之后我们需要进行筛选和鉴定分析，将被筛选出的目标基因工程菌株进行进一步地分析鉴定。
以确保目标细胞受到的外源基因的影响不会对生物体本身的生理系统产生不良影响。
病毒包装实验整体规程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类1.11.1.1体，一方面1.1.21）研。
? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.21.2.1达E11.2.21）2）3）4）5）1.2.3腺病毒包装简要流程1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体2）采用 PacI 消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
5）分装，-80℃保存。
1.3、慢病毒和腺病毒的比较2、构建目的基因到载体2.1构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定DNA分子。
质粒在宿主细胞体内外都可复制。
通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
3.1大肠杆菌感受态细胞的制备30min2）离心管放到42℃保温90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落3.3质粒提取步骤1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清一次。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1 原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
腺病毒基因治疗的副作用评估
腺病毒基因治疗的副作用评估近年来，腺病毒基因治疗作为一种新型的治疗手段，已经得到了广泛的关注和研究。
然而，就像所有的医学技术一样，腺病毒基因治疗也存在着一定的副作用。
因此，对于腺病毒基因治疗的副作用评估显得格外重要。
腺病毒基因治疗是一种基于基因工程技术开发的治疗手段，通过将编码特定蛋白质的基因导入人体细胞中，从而修复或改善疾病的相关功能。
由于腺病毒具有很高的基因导入效率和不引起免疫排斥等优点，因此在治疗某些疾病方面表现出了广阔的应用前景，如遗传性疾病、肿瘤和心血管疾病等。
然而，腺病毒基因治疗也面临着不可忽视的副作用。
这些副作用可分为两种类型：一是与腺病毒本身相关的副作用；二是与基因治疗转基因体的特殊性质和行为相关的副作用。
首先，腺病毒基因治疗中与腺病毒本身相关的副作用主要包括免疫反应和肝毒性。
由于腺病毒会引起机体的免疫反应，因此在进行腺病毒基因治疗时，需要特别注意避免对患者造成免疫反击。
此外，在治疗过程中，腺病毒基因治疗可能会导致肝毒性的副作用，这可能会影响患者的生命安全。
其次，腺病毒基因治疗中与基因治疗转基因体的特殊性质和行为相关的副作用主要包括插入位点突变和癌变风险。
由于腺病毒基因治疗是将基因导入人体细胞中，因此可能会导致插入位点的突变。
这种变异可能会导致特定基因功能的发生改变，从而影响机体的正常生理功能。
此外，腺病毒基因治疗中还存在着癌变风险。
这是因为腺病毒基因治疗可能会影响人类基因组的稳定性，从而导致癌变的发生。
针对以上的副作用，科学家们已经开展了大量的研究和实验，在副作用评估方面也做出了一些有益的尝试和尝试。
其中，良好的基因载体设计和在治疗前进行全面的遗传分析，以及对患者的密切监控等措施，可以有效降低副作用的发生风险。
总之，腺病毒基因治疗为许多疾病的治疗提供了一种新的选择和希望，但同时也带来了一些副作用和风险。
科研人员和医疗工作者需要深入研究腺病毒基因治疗的副作用和安全性，加强副作用评估并采取一系列有效的措施，保证患者的安全和有效治疗。
病毒转基因技术原理 腺相关病毒
病毒转基因技术原理腺相关病毒
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第一节腺相关病毒简介
l生物学特性 l致病性与免疫性
第一部分生物学特性
l血清型 l病毒结构 l病毒复制 l对理化因素的抵抗力
血清型
lAAV是从腺病毒的污染物1965年、人群或非人灵长类动物等 的组织中分离鉴定到的, l共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株variants， l通过签名PCRsignaturePCR技术,利用高度保守序列扩增Cap 基因的一小段可变区的DNA序列,以筛检是否是新的AAV分离 株,然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或和Rep基 因的全长序列，在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵 羊、山羊和蛇等的不同组织器官,发现了大量的具有多样性的 AAV的基因组，但新分离的病毒株,尚未进行血清学分型,通称 为变株， lAAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守,与AAV-2 型较为类似,不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异， 50~80%AAV-2抗体在人群中检测出，
第二节腺相关病毒载体 转基因技术原理
l蛋白表达型腺相关病毒载体
―三成分包装系统 ―自我互补型AAV载体self-complementaryAAVvector,scAAV l基―因打反靶式型剪腺接相型关A病AV毒载载体体trans-splicingAAVvector,tsAAV lrA―AV衣的壳纯蛋化和白定修量饰型AAV载体
病毒转基因技术原理腺相关病毒课件
ITR
ITR中的前125个核苷酸具有回文结 构，其中还存在两个小的内部回文结 构，可自身折叠后经碱基配对、形成T 字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸， 保持非配对状态，称为D序列（D sequence）。 ITR中还具有Rep结合元件（Rep binding elements， RBEs) RBE和 RBEˊ ， 以及一个末端解离位点TRS （terminal resolution site）等重要序 列。 ITR是在AAV生物学中重要的顺式
右端的ORF（Cap基因）
由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白， 即VP1，VP2和VP3。 这些衣壳蛋白利用共同的ORF ，但转录起始位置不一致。 一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。 构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染 性，尤其是VP1含量低的情况下。缺乏VP1的病毒体没有感染性。
AAV-3 AAV-4 AAV-5 AAV-6 AAV-7
受体和辅助受体
α2–3/α2–6 N linked SA HSPG, FGFR1, HGFR, integrins, 37/67 kDa LamR HSPG, 37/67 kDa LamR α2–3 O linked SA α2–3 N linked SA, PDGFR HSPG, α2–3/α2–6 N linked SA
AAV的复制周期可以分为两个阶段
AAV成功感染细胞后，依据是否有辅助病毒存 在的情况下：裂解阶段（ lytic stage）和溶原性阶 段（lysogenic stage）
溶原性阶段（lysogenic stage）:在缺乏辅助病毒如AdV、HSV等感染的 情况下，AAV几乎不能复制，基因表达受到抑制，AAV基因组会整合到 染色体q13.4的一个4kb大小的区域（命名为AAVS1），建立潜伏感染
病毒感染细胞实验整体流程和原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1。
1慢病毒1。
1.1原理慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus—siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞（比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞）。
2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究.4）无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
1。
1。
3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体,包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3) 培养 48hrs — 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5）分装、— 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告.1.2、腺病毒1。
2.1 原理腺病毒(Adenovirus,Ad）是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂.有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力.这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
转化与转染的名词解释
转化与转染的名词解释转化与转染是生物学研究中经常被提及的两个概念。
它们在不同的领域和语境下具有不同的涵义，但是它们都与细胞、基因和分子生物学相关。
在本文中，我们将深入探讨这两个概念的含义和应用。
转化是指生物学中的一个概念，它通常用于描述细胞吸收外部DNA并将其整合到自身基因组的过程。
转化可以发生在原核生物和真核生物中，但其机制略有不同。
在原核生物中，比如大肠杆菌，转化是通过自然转化或人工转化方法实现的。
自然转化是指细菌在自然环境下吸收外部naked DNA（没有包裹膜的DNA），并将其整合到基因组中。
这种转化方式在细菌遗传学研究中起到了重要作用，也被广泛应用于基因工程技术中。
人工转化则是通过利用化学方法或物理手段，如热冲击、电穿孔等，使细菌细胞膜变得渗透性增加，从而达到吸收外部DNA的目的。
在真核生物中，转化的过程相对复杂。
它涉及到转化参与者之间的相互作用和调控机制。
真核生物的转化过程主要通过质粒介导实现，即通过适当的载体将外源DNA导入目标细胞。
这种方法在分子生物学实验室中被广泛使用，用于基因功能研究、基因敲除和基因敲入等实验操作。
除了基础研究领域中的应用外，转化在应用生物技术中也扮演着重要的角色。
转基因技术是指将外源基因导入到目标物种中，以获取特定的性状改良或功能增强。
转基因植物的广泛应用，如抗虫、抗病、抗逆等特性的导入，极大地促进了农业生产和食品安全。
在医学领域中，基因治疗技术以及制药工业中的重组蛋白和生物制剂的生产，也借助于转化技术来实现。
在转化概念的基础上，我们进一步探讨转染的含义和应用。
转染是指将外源DNA、RNA或蛋白质等分子通过一定的方法导入到目标细胞中。
转染技术被广泛应用于生命科学研究中的基因功能解析、细胞信号通路研究和新药开发等方面。
转染技术的方法多种多样，包括物理方法、化学方法和生物方法等。
物理方法包括电穿孔法、阳离子聚合物法和基因枪法等，利用高压或电场等手段使细胞膜变得通透，从而实现外源分子的导入。
基因转移技术的原理和应用
基因转移技术的原理和应用基因转移技术是一种先进的生物技术，可以将外源基因成功地转移到目的细胞中，从而实现基因改良、修补或治疗等多种应用。
本文将介绍基因转移技术的原理和应用，希望能够帮助读者更好地了解和掌握这项生物技术。
一、基因转移技术的原理基因转移技术是将外源基因转移到目标细胞中，实现基因信息的传递和表达。
其原理主要包括两种方法，即体外法和体内法。
1. 体外法体外法是指将目标细胞体外培养，并结合特定的载体和基因导入工具实现基因转移。
目前常用的载体有质粒和病毒载体，基因导入工具有电穿孔、胆固醇配合物、离子和聚乙烯亚胺等。
以质粒载体为例，其主要包括基因片段、启动子、终止子、选择标记等元件，可以快速实现外源基因在细胞内的表达和筛选。
2. 体内法体内法是指将外源基因直接注射或转染到目标组织或器官中，通过细胞的吞噬作用、离子通道和转运蛋白等方式进入目标细胞。
常用的体内转染方法有病毒载体介导的基因转移、基因电转移、基因枪等。
其中，病毒载体介导的基因转移具有高效率、稳定性和专一性的特点，是目前常用的基因转移技术。
二、基因转移技术的应用基因转移技术是一项高科技的生物技术，可以应用于多个领域和行业。
以下是其主要应用方向。
1. 生物技术基因转移技术在生物技术领域中，可以应用于基因工程、生物药物制备、基因检测和治疗等方面。
通过基因转移技术，可以实现目标基因的点突变、标记、定量表达等，进一步研究和应用生物学中的相关问题。
同时，利用基因转移技术制备生物药物，例如利用质粒载体中的重组人生长激素基因，生产出纯化的人生长激素制剂。
2. 农业基因转移技术在农业领域中，可以应用于精准育种、抗病胁迫和产量提高等方面。
例如利用基因转移技术，可以为作物导入具有抗病性的外源基因，提高作物的抗病性和产量。
同时，也可以利用基因转移技术研究植物的功能基因和启动子，实现植物分子育种的目标。
近年来，转基因作物也越来越广泛地应用于全球农业中，既有优势也有局限，需要不断地进行评估和监测。
转基因病毒制备技术的使用技巧
转基因病毒制备技术的使用技巧随着科学技术的不断进步，转基因技术已经成为生物学和医学领域中的重要工具。
转基因病毒制备技术是其中一种常用的方法，它通过改变病毒的基因组成来研究疾病的发生机制、开发新的治疗方法等。
本文将介绍转基因病毒制备技术的一些使用技巧，希望能对相关研究人员提供帮助。
首先，选择合适的病毒载体是制备转基因病毒的重要一步。
病毒载体可以作为基因的载体，将目标基因导入宿主细胞内。
常用的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，研究人员需要根据自己的研究目的和要求选择合适的载体。
例如，腺病毒载体适用于高效的基因传递和表达，而慢病毒载体则适用于基因的稳定整合和长期表达。
其次，在转基因病毒制备过程中，正确的基因构建是非常关键的。
基因构建包括两个主要步骤，即插入目标基因和调控序列到病毒载体中。
实验者需要根据自己的需要设计合适的引物，通过PCR扩增所需基因，并经过酶切等操作将其插入载体中。
同时，为了确保基因的高效表达，调控序列如启动子、启动子增强子和终止子等也需要精心设计。
第三，转染是制备转基因病毒的关键一环。
转染是将经过构建的转基因载体导入到宿主细胞中的过程。
可以采用物理方法（如电穿孔、基因枪）或化学方法（如钙磷酸盐共沉淀、聚合物转染剂）来实现。
选择适当的转染方法需要考虑细胞毒性、转染效率和细胞类型等因素，并应根据实验目的进行优化。
此外，病毒感染和复制的时间点和细胞密度也需要控制好，以便获得满意的转染效果。
第四，经过转染后，为了确保得到纯化的转基因病毒，必须进行筛选和纯化。
筛选可以通过检测转基因病毒的表达蛋白或标记物来进行，例如利用荧光蛋白标记基因来筛选转染阳性细胞。
纯化则可以采用不同的方法，如超速离心、密度梯度离心、柱层析和亲和层析等。
最后，转基因病毒的质量控制也是非常重要的。
质量控制包括病毒滴度的测定、病毒基因组完整性的验证以及传染性的检测等。
病毒滴度测定可以通过滴度法或TCID50法来进行。
基因组完整性的验证可以通过PCR扩增病毒基因组进行检测。
病毒感染细胞实验整体流程及原理
成都百美科生物QQ7742053病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒成都百美科生物QQ77420531.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
病毒转基因技术原理概
转化过程
病毒转基因技术通过将外源基因 插入到病毒基因组中，利用病毒 的感染和复制能力，将外源基因 传递给宿主细胞。
转化机制
转化机制涉及病毒与宿主细胞的 相互作用，包括病毒识别、进入、 复制和组装等过程。这些过程受 到宿主细胞内环境和病毒载体的 影响。
转化效率
转化效率是指成功转化的细胞数 量与总细胞数量的比例。转化效 率受到多种因素的影响，如病毒 载体的类型、感染条件、宿主细 胞的特性等。
利用病毒转基因技术生产重组蛋白、 单克隆抗体等生物药物，用于治疗和 诊断疾病。
疫苗研发
病毒转基因技术可以用于构建重组疫 苗，通过表达特定抗原，激发机体免 疫反应，达到预防疾病的目的。
病毒转基因技术的发展历程
初始阶段
01
20世纪70年代，科学家开始探索利用病毒转导外源基因的能力。
发展阶段
02
20世纪90年代，腺病毒、逆转录病毒等病毒载体被广泛应用于
病毒转基因的复制
插入外源基因的病毒载体在宿主 细胞内复制，病毒基因组随复制
过程传递给子代病毒。
外源基因的表达
外源基因在宿主细胞内表达，通 过转录和翻译过程合成蛋白质。 外源基因的表达受到病毒载体的 调控元件影响，如启动子、增强
子等。
表达产物的特性
外源基因表达的产物可以是蛋白 质或多肽，也可以是RNA。表达 产物在宿主细胞内发挥作用，或
转基因产物的检测与鉴定
转基因产物的检测
通过特定的检测方法，检测目的基因 的表达产物。
转基因产物的鉴定
对目的基因表达产物进行鉴定，包括 理化性质、生物学活性等方面的检测 。
PART 04
病毒转基因技术的优缺点
含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒载体的构建与鉴定
含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒载体的构建与鉴定徐学武;俞卫锋;王星华;李泉;董刚;吴飞翔【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2005(15)4【摘要】目的:构建含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒。
方法:构建腺病毒穿梭质粒pDC312-DTREE,与骨架质粒共转染HEK293细胞,细胞内同源重组包装出腺病毒腺相关杂合病毒。
PCR法鉴定病毒及TCID50法测定病毒滴度。
杂合病毒感染NIH3T3细胞观察转基因的表达,ELISA法测定表达产物浓度。
结果:穿梭质粒pDC312-DTREE经限制性核酸内切酶AatII及NotI酶切结果正确。
PCR鉴定结果表明病毒DNA内有人β-内啡呔DNA序列,且无野生型病毒的污染,病毒滴度为1.29×1010PFUml。
病毒感染细胞后第3d,细胞培养液内有高浓度的β-内啡呔。
结论:成功构建了含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒,为进行下游相关研究奠定了基础。
【总页数】3页(P6-8)【关键词】β-内啡呔;腺病毒;腺相关病毒;杂合病毒;构建;鉴定【作者】徐学武;俞卫锋;王星华;李泉;董刚;吴飞翔【作者单位】第二军医大学东方肝胆外科医院麻醉科;第二军医大学东方肝胆外科医院病毒基因治疗实验室【正文语种】中文【中图分类】Q71【相关文献】1.含TK-IES-ES非融合基因重组腺相关病毒的构建及其功能的初步鉴定 [J], 潘建刚;周兴;韩瑞发;陈志光;李江婷2.含人β1转化生长因子短发夹RNA重组腺病毒载体的构建和鉴定 [J], 马宁;李宏;赵慧;刘畅;杨宇丹;洪敏3.重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体的构建与鉴定 [J], 袁绍辉;刘伟;吴滨奇;韩晰光;毕郑钢4.小鼠神经生长因子前导肽和人内吗啡肽-2融合基因重组腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 吴飞翔;俞卫锋;黄盛东;徐学武;龚德军;董刚;袁扬;孙玉明5.靶向Slug基因的腺相关腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 严明总;张克君;王齐全;欧树安因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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AAV的复制周期可以分为两个阶段
AAV成功感染细胞后，依据是否有辅助病毒存在的情况下：裂解阶段
（ lytic stage）和溶原性阶段（lysogenic stage）
溶原性阶段（lysogenic stage）:在缺乏辅助病毒如AdV、HSV等感染的情况下，AAV几乎不能复制，基因表 达受到抑制，AAV基因组会整合到染色体q13.4的一个4kb大小的区域（命名为AAVS1），建立潜伏感染
ITR
ITR中的前125个核苷酸具有回文结构，其中还存在两个
小的内部回文结构，可自身折叠后经碱基配对、形成T字 形的发夹结构；剩余的20个核苷酸，保持非配对状态，称
为D序列（D sequence）。
ITR中还具有Rep结合元件（Rep binding elements，
RBEs) RBE和 RBEˊ ， 以及一个末端解离位点TRS （terminal resolution site）等重要序列。
构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染性，尤其是VP1含量低的情况下。缺
乏VP1的病毒体没有感染性。
病毒复制
八个主要步骤：
•与细胞表面受体黏附或结合 •内吞（endocytosis） •在细胞内经内吞体运输 •释放出内吞体 •进入胞核 •脱壳并释放病毒基因组 •启动双链DNA的合成
型，通称为变株。
AAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守，与AAV-2型较为类似，不同血清型的衣
壳蛋白结构中表位的差异。50 ~ 80% AAV-2抗体在人群中检测出。
转导不同组织器官的AAV最优血清型
组织
最优血清型
肝脏
AAV-8,AAV-9
骨骼肌
AAV-1,AAV-7,AAV-6, AAV-8,AAV9
AAV-8
37/67 kDa LamR
AAV-9
Galactose, 37/67 kDa LamR
•不同血清型的AAV感染的细胞类型不同，这取决于不同血清型的AAV靶向细胞
表面的受体的差异。而且这也决定了不同血清型的病毒在细胞内的不同的运输
途径
AAV病毒基因组的复制模型左为RFm，右为RFd）
Rep 蛋白
病毒结构
AAV-2 20–30 nm，基因组为线性、单链的DNA分子。正链和负链的单链DNA分子，以同等效率包装
在病毒体衣壳中。基因组全长4679个核苷酸。
基因组包括两个ORF，三个启动子（启动子以在基因组中处的作图位置标示，分别为p5、p19和p40启动
子），以及两末端为145个核苷酸的反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）
裂解阶段（ lytic stage）:在辅助病毒如AdV、HSV-1等共同感染的情况下，AAV可以经历核酸复制、病毒 基因表达和病毒体产生等过程，最终形成产毒性感染
ITR是在AAV生物学中重要的顺式（cis）作用活性元件，
在病毒复制中具有重要作用：在非容许条件下，ITR在病 毒复制的负调控中起关键作用；在容许条件下，作为病毒
基因组复制的起点和引物。
ITR对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整
合，均是必需的。
左端的ORF（Rep基因）
可编码四个Rep蛋白，即Rep78， Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。较大的Rep蛋白如Rep78和
通过签名PCR（signature PCR）技术，利用高度保守序列扩增Cap基因的一小段可变区的
DNA序列，以筛检是否是新的AAV分离株，然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或（和） Rep基因的全长序列。在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵羊、山羊和蛇等的不同组 织器官，发现了大量的具有多样性的AAV的基因组。但新分离的病毒株，尚未进行血清学分
中枢神经系统
AAV-5, AAV-1,AAV-4
肺脏
AAV-9
心脏
AAV-8
肾脏
AAV-2
胰腺
AAV-8
眼睛（光受体细胞）AAV-5, AAV-4
不同血清型在吸附细胞表面能力、病毒受体、胞内交通和抗原性等方面具有 明显的区别，以及针对不同组织和细胞的转导效率不一致，体现出不同的组
织极性（tissue tropisms）
启动子等。
较小的Rep蛋白如Rep52和Rep40，由P19启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，参与单链DNA的聚集
并包装入病毒体的衣壳。
右端的ORF（Cap基因）
由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白，即VP1，VP2和VP3。 这些衣壳蛋白利用共同的ORF ，但转录起始位置不一致。 一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。
Rep68，由P5启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，具有链和位点特异的核酸内切酶活性（切割点在 TRS附近）以及位点特异的DNA结合活性（结合于RBE）。因此它们是重要的调节蛋白，以反式（trans）方式参与调 节AAV复制周期的所有阶段，如 DNA复制、位点特异性整合、整合病毒基因组的拯救，调节病毒和细胞内基因表达的
•整合到细胞染色体或以附加子形式持久表达病毒基因
AAV病毒的糖苷受体和辅助受体
AAV血清型 AAV-1 AAV-2
AAV-3 AAV-4 AAV-5 AAV-6 AAV-7
受体和辅助受体
α2–3/α2–6 N linked SA HSPG, FGFR1, HGFR, integrins, 37/67 kDa LamR HSPG, 37/67 kDa LamR α2–3 O linked SA α2–3 N linked SA, PDGFR HSPG, α2–3/α2–6 N linked SA
主要内容
腺相关病毒简介 腺相关病毒载体转基因技术原理
腺相关病毒载体的医学应用 优缺点总结和复习思考题
第一节 腺相关病毒简介
生物学特性 致病性与免疫性
第一部分 生物学特性
血清型 病毒结构 病毒复制 对理化因素的抵抗力
血清型
AAV是从腺病毒的污染物（1965ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ）、人群或非人灵长类动物等的组织中分离鉴定到的。 共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株（variants）。