微生物代谢的人工控制
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合 谷 成 氨 谷 酸 中间产物 氨 棒 酸 状 的 α-酮戊二酸 杆 途 谷氨酸脱氢酶 菌 径 NH +
4
葡萄糖
抑制
改变细胞 膜的透性， 使谷氨酸迅 速排放到细 胞外面，解 除谷氨酸的 抑制作用。
谷氨酸
黄色短杆菌合成赖氨酸的途径
天冬氨酸
天冬氨酸激酶
抑制
中间产物Ⅰ
中间产物Ⅱ
高丝氨酸 脱氢酶
高丝氨酸 甲硫 氨酸 苏氨酸
三、转移或构建新的代谢途径 • 转移代谢途径
•
构建新的代谢途径一般是指引入外源基因(簇)来改 造和修饰代谢网络,使细胞从不能合成某种代谢产物 转变为能够合成此代谢产物。 • 在真氧产碱菌(Alcaligenes eutrphus)一些细菌中 于限制生长和碳源过量条件下,在细胞内大量累聚羟 基丁酸(PHB)或聚羟基烷酸(PHA) ,这些聚合物都具 生物降解性能。为了利用大肠杆菌生产 PHB ,有人将 真氧碱菌的 PHB操纵子(包括编码 PGB 多聚酶、硫 解酶和还原的基因)克隆到大肠杆菌中,所构建的工程 菌和真氧产碱菌一样,当N源耗空时能积累大量 PHB , 可达细胞总量的50%。
第五节微生物代谢工程的应用最新进展
• 代谢工程的研究目的是要改进微生物的代谢,增加
•
工业生物产品的收率及生产能力。 而如何从本质上把握生物代谢网络的调控规律， 最终做到可以定量预测基因改变和环境变化后， 生物代谢网络的变动规律，从而为优化生物代谢 功能、提高研究和生产效率提供坚实的理论支持 和强大的技术后盾，是现代系统生物学的一个待 解难题，也是代谢工程的主要任务。
• 微生物代谢酶的活性调节
• 以酶分子结构为基础 • 指调节胞内已有酶分子的构象或分子结构来改变酶
活性，从而调节所催化的代谢反应的速率的方式。
是酶分子水平上的调节，属于精细的调节。
• 特点：作用直接、响应快、可逆
Allosteric regulation
微生物代谢的人工控制实例
• 人工控制微生物代谢
1、微生物代谢工程的优缺点
• 优点：方向性强、目标明确、效率高、技
术手段先进、过程可控性好和重现性好等 优点（微生物代谢工程在修饰靶点选择、 实验设计以及数据分析方面占有绝对优 势）； • 主要缺点是对相应微生物的代谢和遗传机 理知识以及基因操作工具的依赖性太强。
2、微生物代谢工程的最新应用领域 应用领域主要包括: (1)改善或提高微生物的某种性能; (2) 产生宿主细胞本身不能合成的新物质; (3)生产非天然的新物质如新型药物; (4) 对环境有害物质的降解; (5)阻断或降低副产物的生成; (6)提高菌体对环境的适应能力; (7)提高代谢产品生产速率和生产能力;
• 构建代谢旁路
• 高密度培养技术在发酵生产中，为实现大肠杆
菌的高密度培养,必须阻断或降低对细胞生长有 抑制作用的有毒物的产生。大肠杆菌糖代谢末 端产物乙酸达到一定浓度后明显造成细胞生长 受抑制, 人们应用代谢工程的方法,将枯草杆菌 的乙酰乳酸合成酶基 因克隆到大肠杆菌中,构建 新的代谢支路,结果明显改变细胞糖代谢流,使乙 酸处于较低水平,以实现高密度培养目的。
的目的—— 最大限度积累对人 类有用的代谢产物
当赖氨酸和苏氨酸都积累过 量时，就会抑制天冬氨酸激 酶的活性，使细胞内难以积 累赖氨酸；而赖氨酸单独过 量就不会出现这种现象。 黄色短杆菌
第二节 发酵工程流程 1、菌种 的选育 4、 5、发酵过程 （中心阶段） 6、产品的 分离提纯 2、 3、
1来自百度文库菌种选育的常用方法比较
第四节 微生物的代谢途径修饰
• 代谢工程的目的
• 通过重组DNA技术构建具有能合成目标产物的
代谢网络或具有高产能力的工程菌，并用于生 产。
• 代谢工程研究的设计思路
1)提高通向目标产物的代谢流; 2)扩展代谢途径; 3)构建新的代谢途径
一、改变代谢途径
• • • •
加速限速反应 改变分支代谢途径流向 构建代谢旁路 改变能量代谢途径
1 目的 最大限度的积累对人类有用的代谢产物 2 措施 • 改变微生物细胞膜的通透性 • 改变微生物的遗传特性（诱变、重组等） • 控制发酵条件（如温度、PH、O2等）
谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径
葡萄糖
中间产物
通过调节酶的活性， 控制代谢过程
α-酮戊二酸 抑制 谷氨酸脱氢酶 NH4+
谷氨酸
微生物代谢的人工控制—— 改变膜的透性
• • •
• 改变分支代谢途径流向
在有竞争途径(如分支代谢途径)存在时,阻断有害的或无关的竞争 代谢途径代谢产物的合成,从而达到改变代谢流,提高目标产物产量 的目的。
• 高丝氨酸脱氢酶缺陷型(Hom2)赖氨酸工程菌 • 芳香族氨基酸合成 头孢烷酸中 ,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三条支
路上的任一条支路的酶活性被加强 ,其与另两条支路的竞争将占据 优势。日本 Katsumata Ryoichi 等人从谷氨酸棒杆菌 K86 中提 取质粒 pCDtrp157 ,该质粒带有DAHP合成酶基因和色氨酸合成 酶基因。将该质粒转化至谷氨酸棒杆菌 KY9182(Phe2) ,使该菌 可产色氨酸1.1 gΠL。若将苯丙氨酸合成相关的酶基因如 pheA 的 基因克隆 ,则可使色氨酸生产菌转化为苯丙氨酸生产菌。
+
赖氨酸
微生物代谢的人工控制—— 改变遗传特性
天冬氨酸
人工诱变不能产生高丝氨酸 脱氢酶的菌种
天冬氨酸激酶
抑制
高丝氨酸 脱氢酶
中间产物Ⅰ
高丝氨酸
中间产物Ⅱ
不能合成
甲硫氨酸 苏氨酸
可以大 量积累
赖氨酸
微生物代谢的人工控制—— 改变发酵条件
• O2：
如：酵母菌在有氧条件下大量繁殖，在无 氧条件下才大量产生酒精。 又如：谷氨酸棒状杆菌在溶氧不足时，生 成的产物是乳酸或是琥珀酸。 • C：N 如在谷氨酸发酵过程中，当培养基中C： N=4：1时，菌体大量繁殖而产生谷氨酸 少；当C：N=3：1时，菌体繁殖受抑制而 合成谷氨酸多
能克服远源杂交不 亲合的障碍，定向 改变遗传性状。
2、培养基的配制 原则有三：
• 根据不同的菌种，应选择不同的原料配制
培养基。配制的培养基应满足微生物在碳 源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面 的营养要求，并为微生物提供适宜的PH。 • 培养基的营养要协调，以利于产物的合成。 • 培养基在满足微生物的营养的需求的基础 上，应尽量降低生产成本，以得到更高的 经济效益。
• 构建新的代谢途径
A）转移代谢途径,即将多个特定代谢途径中的相关基 因(簇)转移到无这些基因的菌株中,从而达到使其能 合成新的目标产物的目的; • Hopwood 等 将放线菌红素(Actinorhodin)的生物合 成基因导入 Granaticin 和 Medermycin产生菌中 ,所 构建的工程菌可积累具有新结构的抗生素 Dihydrogranatirhodin 和 Mederrhodins A。 b）将无关的代谢途径相连,形成新的代谢途径,从而合 成新的目标产物。
•
• 一个崭新的科学领域,它综合了分子生物学、微生
物学、分子反应动力学、生化工程等多个学科领 域的最新成果,是目前国内外研究的热点； 代谢工程被视为继蛋白质多肽单基因表达的第一 代基因工程、基因定向突变的第二代基因工程(即 蛋白质工程)之后的第三代基因工程。
人工控制改造后自身效率提高实例
α-淀粉酶 热稳定性提高，活力增加2500倍 6-磷酸葡萄糖脱氢 酶活性提高1000倍 酶 抗螯合剂性能提高1000倍 洗涤剂用蛋白酶 半乳糖苷酶 井冈霉素 7051杀虫素 特异性提高1000倍 250倍 300倍
• 改变能量代谢途径
• 除了通过相关代谢途径的基因, 改变能量代谢途径
或电子传递系统也可以有效改变代谢流。 • 重组木糖发酵菌株 SaccharomycescerevisiaeTMB3001可以在含木糖的 培养基上生长,但其用木糖产乙醇率很低, 一个重要 原因就是菌体内氧化还原作用辅因子的不平衡 。因 此 Thomas TMB3001 CPB. CR4两种 Saccharomycescerevisiae菌株,通过 gdh1的敲除和 GDH2的过表达,这二者不仅能发酵木糖产乙醇,而且 被修饰了还原代谢系统,C13标记葡萄糖结果显示氨 同化作用从利用 NADPH变为 NADH依赖的,同时 CPB.CR4菌株的乙醇产率提高了25%。
3、灭菌
杀死杂菌防止杂菌与发酵菌形成竞 争关系，对发酵过程造成不良影响。 4、扩大培养和接种 扩大培养是将培养到对数期的菌体 分开，分头进行培养，以促使菌体数量 快速增加，能在短时间里得到大量的菌 体。接种时要防止杂菌的污染。
5、发酵过程： （中心阶段，重点是在发酵条件的控制）
控制对象
溶氧 PH
部分成熟的研究举例
• • • • • •
药物生产的代谢工程与定向进化 ; 可再生资源利用的代谢工程; 用代谢工程改进染料生产及使用; 乳酸菌的代谢工程; 微生物塑料工厂的过程设计—PHA 的代谢工程; 1 ,3-丙二醇、次生代谢物及类黄酮的代谢工程;通 过3 种生物(植物、酵母和大肠杆菌) 的6 个基因 用代谢途径工程使E.coli成为生产抗疟疾药物(青 篙素) 的“绿色工厂”
温度
控制方式 对需氧型生物保证氧的供应，对厌 氧型生物控制氧的供应。 措施：控制通气量和搅拌速度等。 加酸、加碱或加缓冲液
注意降温，使温度控制在所培养微 生物的最适温度。措施：控制搅拌 速度、冷却水的循环速度等。
6、分离 提纯：
菌体：过滤、沉淀 代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换
第三节 微生物代谢的人工调控方法
微生物代谢的人工调控
• 第一节 微生物代谢的人工控制简介 • 第二节 发酵工程流程 • 第三节微生物代谢的人工调控方法 • 第四节微生物的代谢途径修饰
• 改变代谢途径 • 扩展代谢途径 • 转移或构建新的代谢途径
• 第五节微生物代谢途径修饰的应用
第一节 微生物代谢的人工控制简介
• 微生物代谢的人工控制
类型 原理 诱变 基因 育种 突变 方 法 物理、化学、 生物因素诱变 优点 （缺点）
能大幅度改变某些性 状、操作简便，但也 具有很大的盲目性。
将目的基因导 能定向改变微生 基因 DNA 入受体细胞中， 物的遗传性状， 工程 重组 构建工程菌或 但操作过程复杂、 工程细胞。 要求高。 细胞 细胞 工程 融合 体细胞杂交 等方法
一、改变代谢途径，提高通向目标产物的代谢流 • 加速限速反应(通过关键酶的过量表达来解决代谢瓶颈)
将编码限速酶的基因通过基因扩增 ,增加拷贝数 ,在宿主中 表达并增强催化限速反应的酶的表达量或活性,从而提高代 谢流。以实现目的产物产率的上升。经典代谢工程主要过程: 首先 ,必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。 然后 ,将编码限速酶的基因通过酶切等手段 ,制得特定片段 , 连接在高拷贝数的载体上再导入宿主中去表达,从而加速限 速反应,提高目的产物产率。 在头孢霉素 C传统的发酵过程中 ,青霉素N的积累表明下一 步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤 ,通过克隆编码 限速酶(脱乙酰基头孢霉素合成酶)基因 cefEF,再将该重组 质粒导入头孢霉素 C生产菌株顶头孢( Cephalosporium acremonium)中 ,所得工程菌株的头孢霉素C的产量提高了 25 %,而青霉素N的积累量减少了15倍。
二、扩展代谢途径
• 通过基因工程手段在宿主菌中克隆、表达特定基因
(簇)等,使原有代谢途径进一步向前或向后延伸,从而 可利用新的原料用于合成目标产物或产生新的末端 代谢产物。 • 外源基因的导入 ,通过扩展代谢途径可使宿主菌能 够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 Winter 等 克隆假单胞菌的单加氧酶基因并在大肠 杆菌中表达 ,获得的工程菌可有效降解三氯乙烯 ,降 解力远大于原始菌株 ,可使三氯乙烯在水中的浓度 降至 1/1000。这说明关键酶转入不同的调控环境 中其活性可大大增加。
4
葡萄糖
抑制
改变细胞 膜的透性， 使谷氨酸迅 速排放到细 胞外面，解 除谷氨酸的 抑制作用。
谷氨酸
黄色短杆菌合成赖氨酸的途径
天冬氨酸
天冬氨酸激酶
抑制
中间产物Ⅰ
中间产物Ⅱ
高丝氨酸 脱氢酶
高丝氨酸 甲硫 氨酸 苏氨酸
三、转移或构建新的代谢途径 • 转移代谢途径
•
构建新的代谢途径一般是指引入外源基因(簇)来改 造和修饰代谢网络,使细胞从不能合成某种代谢产物 转变为能够合成此代谢产物。 • 在真氧产碱菌(Alcaligenes eutrphus)一些细菌中 于限制生长和碳源过量条件下,在细胞内大量累聚羟 基丁酸(PHB)或聚羟基烷酸(PHA) ,这些聚合物都具 生物降解性能。为了利用大肠杆菌生产 PHB ,有人将 真氧碱菌的 PHB操纵子(包括编码 PGB 多聚酶、硫 解酶和还原的基因)克隆到大肠杆菌中,所构建的工程 菌和真氧产碱菌一样,当N源耗空时能积累大量 PHB , 可达细胞总量的50%。
第五节微生物代谢工程的应用最新进展
• 代谢工程的研究目的是要改进微生物的代谢,增加
•
工业生物产品的收率及生产能力。 而如何从本质上把握生物代谢网络的调控规律， 最终做到可以定量预测基因改变和环境变化后， 生物代谢网络的变动规律，从而为优化生物代谢 功能、提高研究和生产效率提供坚实的理论支持 和强大的技术后盾，是现代系统生物学的一个待 解难题，也是代谢工程的主要任务。
• 微生物代谢酶的活性调节
• 以酶分子结构为基础 • 指调节胞内已有酶分子的构象或分子结构来改变酶
活性，从而调节所催化的代谢反应的速率的方式。
是酶分子水平上的调节，属于精细的调节。
• 特点：作用直接、响应快、可逆
Allosteric regulation
微生物代谢的人工控制实例
• 人工控制微生物代谢
1、微生物代谢工程的优缺点
• 优点：方向性强、目标明确、效率高、技
术手段先进、过程可控性好和重现性好等 优点（微生物代谢工程在修饰靶点选择、 实验设计以及数据分析方面占有绝对优 势）； • 主要缺点是对相应微生物的代谢和遗传机 理知识以及基因操作工具的依赖性太强。
2、微生物代谢工程的最新应用领域 应用领域主要包括: (1)改善或提高微生物的某种性能; (2) 产生宿主细胞本身不能合成的新物质; (3)生产非天然的新物质如新型药物; (4) 对环境有害物质的降解; (5)阻断或降低副产物的生成; (6)提高菌体对环境的适应能力; (7)提高代谢产品生产速率和生产能力;
• 构建代谢旁路
• 高密度培养技术在发酵生产中，为实现大肠杆
菌的高密度培养,必须阻断或降低对细胞生长有 抑制作用的有毒物的产生。大肠杆菌糖代谢末 端产物乙酸达到一定浓度后明显造成细胞生长 受抑制, 人们应用代谢工程的方法,将枯草杆菌 的乙酰乳酸合成酶基 因克隆到大肠杆菌中,构建 新的代谢支路,结果明显改变细胞糖代谢流,使乙 酸处于较低水平,以实现高密度培养目的。
的目的—— 最大限度积累对人 类有用的代谢产物
当赖氨酸和苏氨酸都积累过 量时，就会抑制天冬氨酸激 酶的活性，使细胞内难以积 累赖氨酸；而赖氨酸单独过 量就不会出现这种现象。 黄色短杆菌
第二节 发酵工程流程 1、菌种 的选育 4、 5、发酵过程 （中心阶段） 6、产品的 分离提纯 2、 3、
1来自百度文库菌种选育的常用方法比较
第四节 微生物的代谢途径修饰
• 代谢工程的目的
• 通过重组DNA技术构建具有能合成目标产物的
代谢网络或具有高产能力的工程菌，并用于生 产。
• 代谢工程研究的设计思路
1)提高通向目标产物的代谢流; 2)扩展代谢途径; 3)构建新的代谢途径
一、改变代谢途径
• • • •
加速限速反应 改变分支代谢途径流向 构建代谢旁路 改变能量代谢途径
1 目的 最大限度的积累对人类有用的代谢产物 2 措施 • 改变微生物细胞膜的通透性 • 改变微生物的遗传特性（诱变、重组等） • 控制发酵条件（如温度、PH、O2等）
谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径
葡萄糖
中间产物
通过调节酶的活性， 控制代谢过程
α-酮戊二酸 抑制 谷氨酸脱氢酶 NH4+
谷氨酸
微生物代谢的人工控制—— 改变膜的透性
• • •
• 改变分支代谢途径流向
在有竞争途径(如分支代谢途径)存在时,阻断有害的或无关的竞争 代谢途径代谢产物的合成,从而达到改变代谢流,提高目标产物产量 的目的。
• 高丝氨酸脱氢酶缺陷型(Hom2)赖氨酸工程菌 • 芳香族氨基酸合成 头孢烷酸中 ,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三条支
路上的任一条支路的酶活性被加强 ,其与另两条支路的竞争将占据 优势。日本 Katsumata Ryoichi 等人从谷氨酸棒杆菌 K86 中提 取质粒 pCDtrp157 ,该质粒带有DAHP合成酶基因和色氨酸合成 酶基因。将该质粒转化至谷氨酸棒杆菌 KY9182(Phe2) ,使该菌 可产色氨酸1.1 gΠL。若将苯丙氨酸合成相关的酶基因如 pheA 的 基因克隆 ,则可使色氨酸生产菌转化为苯丙氨酸生产菌。
+
赖氨酸
微生物代谢的人工控制—— 改变遗传特性
天冬氨酸
人工诱变不能产生高丝氨酸 脱氢酶的菌种
天冬氨酸激酶
抑制
高丝氨酸 脱氢酶
中间产物Ⅰ
高丝氨酸
中间产物Ⅱ
不能合成
甲硫氨酸 苏氨酸
可以大 量积累
赖氨酸
微生物代谢的人工控制—— 改变发酵条件
• O2：
如：酵母菌在有氧条件下大量繁殖，在无 氧条件下才大量产生酒精。 又如：谷氨酸棒状杆菌在溶氧不足时，生 成的产物是乳酸或是琥珀酸。 • C：N 如在谷氨酸发酵过程中，当培养基中C： N=4：1时，菌体大量繁殖而产生谷氨酸 少；当C：N=3：1时，菌体繁殖受抑制而 合成谷氨酸多
能克服远源杂交不 亲合的障碍，定向 改变遗传性状。
2、培养基的配制 原则有三：
• 根据不同的菌种，应选择不同的原料配制
培养基。配制的培养基应满足微生物在碳 源、氮源、生长因子、水、无机盐等方面 的营养要求，并为微生物提供适宜的PH。 • 培养基的营养要协调，以利于产物的合成。 • 培养基在满足微生物的营养的需求的基础 上，应尽量降低生产成本，以得到更高的 经济效益。
• 构建新的代谢途径
A）转移代谢途径,即将多个特定代谢途径中的相关基 因(簇)转移到无这些基因的菌株中,从而达到使其能 合成新的目标产物的目的; • Hopwood 等 将放线菌红素(Actinorhodin)的生物合 成基因导入 Granaticin 和 Medermycin产生菌中 ,所 构建的工程菌可积累具有新结构的抗生素 Dihydrogranatirhodin 和 Mederrhodins A。 b）将无关的代谢途径相连,形成新的代谢途径,从而合 成新的目标产物。
•
• 一个崭新的科学领域,它综合了分子生物学、微生
物学、分子反应动力学、生化工程等多个学科领 域的最新成果,是目前国内外研究的热点； 代谢工程被视为继蛋白质多肽单基因表达的第一 代基因工程、基因定向突变的第二代基因工程(即 蛋白质工程)之后的第三代基因工程。
人工控制改造后自身效率提高实例
α-淀粉酶 热稳定性提高，活力增加2500倍 6-磷酸葡萄糖脱氢 酶活性提高1000倍 酶 抗螯合剂性能提高1000倍 洗涤剂用蛋白酶 半乳糖苷酶 井冈霉素 7051杀虫素 特异性提高1000倍 250倍 300倍
• 改变能量代谢途径
• 除了通过相关代谢途径的基因, 改变能量代谢途径
或电子传递系统也可以有效改变代谢流。 • 重组木糖发酵菌株 SaccharomycescerevisiaeTMB3001可以在含木糖的 培养基上生长,但其用木糖产乙醇率很低, 一个重要 原因就是菌体内氧化还原作用辅因子的不平衡 。因 此 Thomas TMB3001 CPB. CR4两种 Saccharomycescerevisiae菌株,通过 gdh1的敲除和 GDH2的过表达,这二者不仅能发酵木糖产乙醇,而且 被修饰了还原代谢系统,C13标记葡萄糖结果显示氨 同化作用从利用 NADPH变为 NADH依赖的,同时 CPB.CR4菌株的乙醇产率提高了25%。
3、灭菌
杀死杂菌防止杂菌与发酵菌形成竞 争关系，对发酵过程造成不良影响。 4、扩大培养和接种 扩大培养是将培养到对数期的菌体 分开，分头进行培养，以促使菌体数量 快速增加，能在短时间里得到大量的菌 体。接种时要防止杂菌的污染。
5、发酵过程： （中心阶段，重点是在发酵条件的控制）
控制对象
溶氧 PH
部分成熟的研究举例
• • • • • •
药物生产的代谢工程与定向进化 ; 可再生资源利用的代谢工程; 用代谢工程改进染料生产及使用; 乳酸菌的代谢工程; 微生物塑料工厂的过程设计—PHA 的代谢工程; 1 ,3-丙二醇、次生代谢物及类黄酮的代谢工程;通 过3 种生物(植物、酵母和大肠杆菌) 的6 个基因 用代谢途径工程使E.coli成为生产抗疟疾药物(青 篙素) 的“绿色工厂”
温度
控制方式 对需氧型生物保证氧的供应，对厌 氧型生物控制氧的供应。 措施：控制通气量和搅拌速度等。 加酸、加碱或加缓冲液
注意降温，使温度控制在所培养微 生物的最适温度。措施：控制搅拌 速度、冷却水的循环速度等。
6、分离 提纯：
菌体：过滤、沉淀 代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换
第三节 微生物代谢的人工调控方法
微生物代谢的人工调控
• 第一节 微生物代谢的人工控制简介 • 第二节 发酵工程流程 • 第三节微生物代谢的人工调控方法 • 第四节微生物的代谢途径修饰
• 改变代谢途径 • 扩展代谢途径 • 转移或构建新的代谢途径
• 第五节微生物代谢途径修饰的应用
第一节 微生物代谢的人工控制简介
• 微生物代谢的人工控制
类型 原理 诱变 基因 育种 突变 方 法 物理、化学、 生物因素诱变 优点 （缺点）
能大幅度改变某些性 状、操作简便，但也 具有很大的盲目性。
将目的基因导 能定向改变微生 基因 DNA 入受体细胞中， 物的遗传性状， 工程 重组 构建工程菌或 但操作过程复杂、 工程细胞。 要求高。 细胞 细胞 工程 融合 体细胞杂交 等方法
一、改变代谢途径，提高通向目标产物的代谢流 • 加速限速反应(通过关键酶的过量表达来解决代谢瓶颈)
将编码限速酶的基因通过基因扩增 ,增加拷贝数 ,在宿主中 表达并增强催化限速反应的酶的表达量或活性,从而提高代 谢流。以实现目的产物产率的上升。经典代谢工程主要过程: 首先 ,必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。 然后 ,将编码限速酶的基因通过酶切等手段 ,制得特定片段 , 连接在高拷贝数的载体上再导入宿主中去表达,从而加速限 速反应,提高目的产物产率。 在头孢霉素 C传统的发酵过程中 ,青霉素N的积累表明下一 步酶反应是头孢霉素合成代谢中的限速步骤 ,通过克隆编码 限速酶(脱乙酰基头孢霉素合成酶)基因 cefEF,再将该重组 质粒导入头孢霉素 C生产菌株顶头孢( Cephalosporium acremonium)中 ,所得工程菌株的头孢霉素C的产量提高了 25 %,而青霉素N的积累量减少了15倍。
二、扩展代谢途径
• 通过基因工程手段在宿主菌中克隆、表达特定基因
(簇)等,使原有代谢途径进一步向前或向后延伸,从而 可利用新的原料用于合成目标产物或产生新的末端 代谢产物。 • 外源基因的导入 ,通过扩展代谢途径可使宿主菌能 够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 Winter 等 克隆假单胞菌的单加氧酶基因并在大肠 杆菌中表达 ,获得的工程菌可有效降解三氯乙烯 ,降 解力远大于原始菌株 ,可使三氯乙烯在水中的浓度 降至 1/1000。这说明关键酶转入不同的调控环境 中其活性可大大增加。