生物素亲和素系统
临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合， 室温搅拌下反应2 ～4小时；
4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃ 透析过夜；
5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻 存备用。
2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成 新的标记物。
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3、生物素标记抗体（IgG）的制备 基本原理 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-
C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽 键，从而使其标记上生物素。
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4、实验流程
1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶 液；
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素 -过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗（抗）体接触， 将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为 ABC法。
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17第三节生物素和亲和素系统的技术方法一桥联亲和素生物素法bridgedavidinbiotintechnologybab法lymphocytebab法直接法检测原理示意图18二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab间接法lab法直接法检测原理示意图20abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc23第四节技术评价与应用领域1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
的羧基经活化修饰 后形成的衍生物， 只有活化生物素才 能偶联各种其他生 物大分子，如蛋白 质、多糖、荧光素 等。
简述生物素亲和素系统的特点
简述生物素亲和素系统的特点嘿，今天咱来聊聊这个生物素亲和素系统！你可别小看它，这玩意儿那可是相当有特点嘞！
要说这生物素亲和素系统，就像是一对超级合拍的好搭档。
首先呢，它们之间的亲和力强得很呐！硬要形容的话，就像是两块强力磁铁，“啪”一下子就吸到一块儿了，那叫一个紧密！这就意味着它们一旦牵手，那轻易可就不会松开哟，别提多牢固啦。
然后呢，这系统还特别敏感！就像是那种对周围动静特别在意的小机灵鬼儿。
只要稍微有点风吹草动，它就能迅速做出反应。
这种敏感度简直逆天了，别的系统可能还在那儿迷迷糊糊呢，它就能第一时间察觉到情况。
嘿，你知道吗？它还特别神通广大。
想象一下，它就如同一个万能连接器，可以把各种不同的东西都给串起来。
不管是蛋白质啦，还是别的啥玩意儿，它都能给完美地连接起来，厉害吧？这能力，简直就是生物界的“月老”，专门负责牵红线的！
而且哦，这个系统还超级稳定呢！就跟那泰山似的，任凭风吹雨打，它就是稳稳当当的。
不管周围环境怎么变，它都能坚定不移地发挥自己的作用。
咱再说说它的效率，那真是杠杠的！一旦运作起来，那速度就跟火箭似的，“嗖嗖”就把事情给搞定了。
别的系统可能还在慢悠悠地晃悠呢，它早就跑完一圈回来休息啦。
说起来，要是咱们生活中也有这种像生物素亲和素系统一样厉害的东西该多好啊！啥东西都能快速、牢固、敏感地结合在一起，那得省多少事儿啊！总之，这个生物素亲和素系统可真是不简单呐，小小的身体里蕴含着大大的能量和特点。
真是让咱不得不佩服大自然的神奇和智慧嘞！希望科学家们能好好利用它的这些特点，给咱的生活带来更多的惊喜和便利哟！是不是挺有趣的呀？嘿嘿。
9章生物素亲和素
生物素活化
标记蛋白质醛基的活化生物素
标记蛋白质巯基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
三、生物素标记蛋白质
1. 标记方式 生物素化蛋白质衍生物有二类： 一种是生物素化的大分子生物活性物 质（如生物素化抗原、抗体） 另一种是标记材料（如酶）结合生物 素后制成的标记物（如生物素 化酶）。
亲和素与链霉亲和素不同点
特点 等电点 分子量(KD) 是否有糖基 非特异吸附
AV 10.5 67 有 多
SAV 6 .0 65 无 少
三、SA和SAV的标记物 几乎所有用于标记的物质均可以同AV和 SAV结合， 125I、胶体金、荧光素、化学发光物 等 小分子物质 酶、抗原、抗体等大分子物质
BAS技术基本类型
1.BAB法（biotin--avidin bind，BAB ）， 也称为桥联亲和素－标记生物素法 （BRAB） 2.标记亲和素-生物素法（BA） （labeledavidin-biotin，LAB）
BAS技术基本类型
BAB法
（biotin--avidin bind，BAB）
及既可偶联生物大分子，又可连接荧光
素、酶等标记材料的特性，使该系统在
标记免疫分析技术领域中的应用具有很
强的稳定性和适用性。
第二节
生物素的理化性质及其标记物
一、生物素的特性 生物素（biotin，B）又称维生素H，辅酶R 分子量-----244.31 广泛分布于动、植物组织中，常从含 量较高的卵黄和肝组织中提取。生物素分 子有两个环状结构
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术
第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。
BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。
从而使蛋白质标记上生物素。
（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。
（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。
2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。
2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。
ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法是许世明于1981年在BAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。
ABC法与LAB法、BAB法不同的是第一抗体不为生物素所标记，生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接，最后进行显色反应定位。
复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素—过氧化物酶连接物与过量的亲和素反应而制备的。
ABC法与LAB法、BAB法相比较具有敏感性高、特异性强、背景染色淡等优点。
ABC法染色流程如下。
(1)4um石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3X3min。
(2)IHC的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复(AR)，PBS洗3X3min。
(3)3％过氧化氢孵育10min(可省略)，以阻断内源性过氧化物酶活性。
(4)PBS洗3X3min。
(5)10％非免疫性动物血清孵育10min(可省略)，以减少非特异性背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
(6)滴加适当稀释的第一抗体，37℃孵育60min或4℃过夜。
(7)PBS洗3X3min。
(8)滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30～60min。
(9)PBS洗3X3min。
(10)滴加ABC复合物(提前30min，A液与B液等量混合)，37℃孵育30～60min。
(11)PBS洗3X3min。
(12)0．04％DAB(含0．03％H：02)显色5～10min。
(13)复染，脱水，常规树胶封固和结果观察。
亲和素和生物素系统
标记亲和素-生物素法（labeled avidin biotin，LAB）
• 将亲和素与标记酶（HRP）结合，一个亲和素可 结合多个HRP
• 将生物素与抗体（一抗或二抗）结合，一个抗体 分子可连接多个生物素分子
• 细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体 结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素 上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。
• 抗体分子经生物素化后，其结合抗原的能 力不受损失，细胞经生物素化后仍能保持 正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗体、 细胞的标记。
亲和素
• 亲和素（avidin）是一种分子质量为 68000Da的一、胶体 金等，结合的能力。
• 生物素和亲和素之间有极强的亲和力，比 抗体对抗原的亲和力要高出100 万倍。
物素标记抗体结合。由于采用了改良的亲 和纯化技术和酶标技术，LSAB 法敏感性更 高、背景更清晰。
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• 亲和素有4 个亚单位，它具有4 个同生物素 亲和力极高的结合位点，因其能使生物素 失活，故又称抗生物素。
链霉亲和素
• 链霉亲和素（streptavidin ）是一种从链霉 菌培养物中提取的蛋白质，相对分子质量 60000，且不含糖链。
• 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物 素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是 一种更完美的生物素结合蛋白。因为它很 少有低聚糖残余成分，可保持中性等电点， 避免了组织中的非特异性染色。
• ABC 复合物不能饱和，即亲和素上的4 个结合位 点最多允许3 个位点与生物素化酶结合，留1~2 个位点与生物素化二抗结合。
• 抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC 复 合物结合，最终形成巨大复合体，因该复合体网 络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。
生物素亲和素
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
分子量：68 000
比活性：A≥12u/mgP
亲和常数：1015/mol
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：
能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末
端羧基经化学修
饰后制成带各种 活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生 物)
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第十一章 生物素-亲和素放大技术(附答案解析)
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第十一章生物素-亲和素放大技术（附答案解析）一、A1型题1、每个亲和素能结合生物素分子的数目是（）A、4B、2C、1D、3E、82、以下关于生物素-亲和素系统（BAS）的说法错误的是（）A、1个亲和素分子可结合4个生物素分子B、1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C、生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D、亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E、亲和素和生物素.有极强的亲和力3、免疫组化技术的优点不包括（）A、高特异性B、高敏感性C、形态学的直观性D、精确定量分析E、能对抗原表达情况进行分析4、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是（）A、ABAB、ABCC、BRABD、BAE、LAB5、免疫组化染色前，对标本进行固定的目的是（）A、保存组织细胞的抗原性B、防止细胞脱落C、防止细胞自溶D、终止胞内酶的活性E、使细胞内蛋白质凝固6、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原7、关于亲和素-生物素系统的错误描述是（）A、用于间接包被B、用于终反应放大C、用于酶免疫测定D、用于胶体金测定E、不用于荧光免疫测定8、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原9、关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（）A、根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B、活化生物素与待标记抗原或抗体可以为任意比例C、在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性E、生物素标记酶时会影响其免疫活性10、亲和素和生物素结合的特点是（）A、免疫反应B、不属于免疫反应C、特异性弱D、亲和力小E、不够稳定二、B型题1、 A.ABCBC.BABD.直接法BASE.间接法BAS<1> 、标记亲和素-生物素的方法为（）；<2> 、亲和素-生物素化酶复合物技术为（）；<3> 、生物素化第二抗体为（）；<4> 、生物素化第一抗体为（）。
亲和素与生物素 连接
亲和素与生物素连接
亲和素与生物素，生命中的紧密连接。
亲和素和生物素是生命中不可或缺的两种物质，它们之间有着
紧密的连接。
亲和素是一种蛋白质，它在生物体内起着极其重要的
作用。
亲和素通过与生物素结合，形成了生物素-亲和素复合物，这
种复合物在细胞内参与了许多重要的生物化学反应。
生物素是一种维生素，它在细胞代谢中扮演着关键的角色。
生
物素与亲和素结合后，形成了一种生物素-亲和素复合物，这种复合
物在许多酶催化的生物化学反应中起着媒介作用。
这些反应包括葡
萄糖新陈代谢、脂肪酸合成和氨基酸代谢等，这些都是维持生命所
必需的过程。
亲和素和生物素的连接不仅仅局限于细胞内的生物化学反应，
它们也在医学和生物技术领域发挥着重要作用。
生物素标记技术利
用了生物素和亲和素之间的结合，用于检测和分离蛋白质和核酸等
生物分子，这为科学研究和医学诊断提供了重要的工具。
总之，亲和素和生物素之间的连接是生命中不可或缺的一部分。
它们共同参与着细胞代谢和生物化学反应，为维持生命的正常运转提供了重要的支持。
同时，它们的结合也为科学研究和医学诊断提供了重要的技术手段。
因此，亲和素与生物素之间的连接是生命中不可或缺的一环。
生物素亲和素系统在ECP的实验效能
义。结论 ： 生物素亲和素包被可提高实验的灵敏度、 线性范 围， 减少抗体用量 ， 节约抗体包被 时间。 关键词 嗜酸细胞 阳离子蛋 白质 生物素 酶联免疫吸附测定 单克 隆抗体 亲和素
Ｔｈ ｐ ｉａ ｉｎ ｏ ｏ ｉ－ ｉｉ ｙ ｔ ｍ ｕ ｌ— ｔ ｏ ｙ Ｓａ ｄ ｃ Ｉ ｅＡｐ ｌ ｔ ｆＢｉｔ Ａｖｄ ｎ Ｓ ｓｅ ｉ Ｄｏ ｂｅ Ａｎ ｉ ｄ ｎ ｗｉｈ ＥＬＳＡ ｃ ｏ ｎ ｎ ｂ Ｍ ｅ ｈ ｄ ｆ ｒＥ ｓｎ ｐ ｉ ｔ ｎｃＰｒ ｔ ｉ ｔｏ ｏ ｏ ｉｏ ｈｌ Ｃａ ｉ ｉ ｏｅ ｎ ｉ ａ ｏ
ｓ ｎ ｉ ｖｔ ， ｎ ｃ ｕ ａ ｙ ａ ｄ ｖ ｒａ ｉ ｔ ｒ ｏ ａ ｅ ｅｗｅ ｎ ｔ ｒ ｅ ｍｅ ｈ ｄ ． ｈ ｅ ｅ ｓｏ Ｐ ｗｅ ｅ ｄ ｔ ｃｅ ｓ ｇ ｔ ｅ ｅ ｅ ｓｔ ｉ ｉａ ｃ ｒ ｃ ｎ ａ ｂｌ ｙ ｗｅ ｅ ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｂ ｔ ｅ ｈ ｅ ｔ ｏ ｓ Ｔ ｅ ｌｖ ｌ ｆＥＣ ｒ ｅｅ ｔｄ ｕ ｉ ｈ ｓ ｉ ｙ ｉ ｉ ｎ
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天津 医药 ２ １ ３月 第 ４ ０２年 Ｏ卷 第 ３期
２ ２１
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生物素亲和素系统在 Ｅ Ｐ的实验效能 Ｃ
赵俊芳
摘要
王学谦
生物素-亲和素系统elisa法
生物素-亲和素系统ELISA法是一种基于生物素和亲和素之间高度特异性和高亲和力的免疫检测方法。
这种方法利用生物素和亲和素之间的结合反应，将抗原或抗体与生物素结合，再通过亲和素与生物素之间的结合反应，将抗原或抗体固定在固相载体上。
在ELISA中，生物素-亲和素系统可以用于提高检测的灵敏度和特异性。
首先，亲和素与生物素之间的结合反应非常稳定，可以减少非特异性结合，提高检测的特异性。
其次，每个亲和素可以结合4个生物素，使得反应信号放大，提高检测的灵敏度。
生物素-亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式，包括用于固相化抗体或抗原的制备、用于ELISA终反应的放大等。
在固相化抗体或抗原的制备中，先将亲和素（或链霉亲和素）包被于固相载体，抗体或抗原也先与生物素结合，然后通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。
在ELISA终反应的放大中，用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物（BA-ELISA）、或亲和素及酶标生物京（BAB-ELISA）或ABC试剂（ABC-ELISA），从而使反应信号放大，提高检测灵敏度。
总之，生物素-亲和素系统ELISA法是一种灵敏度高、特异性好的免疫检测方法，可以用于各种抗原或抗体的检测。
生物素亲和素
生物素亲和素生物素亲和素是一类非常有用的分子，它们能够与特定的蛋白质结合，用于生物体内的过程和分子交互。
在最近的几十年，生物素亲和素的工作原理和作用的研究已经取得了显著的成就。
这篇文章将介绍生物素亲和素的来源、结构特征、结合模式和生物学功能，并对其在分子互作中的作用做出评价。
一、生物素亲和素的来源生物素亲和素是生物体中一类常见的分子，主要存在于植物，动物和微生物中。
在植物中，它们主要发现于汁液和植物细胞外层，是植物抗病能力的重要组成部分。
在动物体中，它们主要存在于表皮和血液，参与多种免疫反应。
而在酵母中，生物素亲和素主要由细菌提供，从而帮助酵母附着到其他表面上。
二、生物素亲和素的结构特征生物素亲和素是一类结构简单的分子，它们由一个非常小的亲和素结构和一个相应的生物素结构组成。
亲和素部分由一个结构稳定的细胞膜吸附物，其由亚硫酸盐和脂肪酸构成，从而与相应的蛋白质结合。
生物素部分主要由糖苷和酰胺构成，其中包含一个氨基酸序列，这个氨基酸序列是它们的特异性结合的关键。
三、生物素亲和素的结合模式生物素亲和素可以与许多类型的蛋白质结合，其结合模式可以分为有特异性和非特异性两种。
与特异性结合的生物素亲和素可以与蛋白质的特定部位亲和结合，一旦结合，它们就不会被其他物质所分解。
非特异性结合的生物素亲和素则可以与蛋白质的任何部位亲和结合，它们可以被其他化学物质分解。
四、生物素亲和素的生物学功能生物素亲和素对生物体有重要的作用，它们可以参与多种生物学过程。
比如，它们可以帮助细胞活动、促进免疫反应和代谢，甚至可以抑制病原体的生长和繁殖。
生物素亲和素还能够改变细胞表面的表现，从而也可以影响其他细胞的发育过程。
五、评价生物素亲和素已经成为生物学中的一项重要的研究对象，它们可以解释许多生物体内的分子互作，并可以作为潜在的生物药物靶点。
未来，研究者们可以继续研究这类分子，以期更好地了解它们在机体功能调节中的作用，并利用它们来改善人类的健康。
生物素-亲和素
生物素-亲和素生物素－亲和素系统（Biotin-Avidin System，以下简称BAS）是半个世纪前发现的一种新型生物反应放大系统。
生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏，生物素－亲和素系统目前已广泛用于抗原、抗体的定性、定量检测及定位观察研究。
生物素（D-biotin）分子结构见图，分子量244.31Da．生物素分子有两个环状结构（如下左图），其中咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位；噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素（如下右图）亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD。
4个相同的亚基使每个亲和素能最多可结合4个分子的生物素。
生物素与亲和素之间具有极强的亲和力，比抗原与抗体间的亲和力高得多。
并且，二者的结合稳定性好、专一性强。
生物素－亲和素系统有哪些优点：灵敏度生物素易与蛋白质、核酸类及其他生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且具有多价性。
此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物。
因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
特异性亲和素与生物素间的结合呈高度特异性。
因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。
而且，BAS结合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响。
因此，在实际应用中可**限度地降低反应试剂的非特异作用。
稳定性亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白水解酶以及有机溶剂均不影响其结合。
因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。
生物素-亲和素
该技术将BA技术与免疫印迹技术相结合,进一
步提高检测灵敏度。
免疫印迹技术是在蛋白凝胶电泳和固相免疫
测定基础上发展起来的一种新的免疫学技术。是 凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异性、 敏感性、稳定性及可重复性的有机结合。
5. BA -组织化学技术
利用BA 技术将染料浓聚于靶细胞表面， 使其更利于观察， 提高了检测灵敏度。 Xia Y1 等在生物素化黑皮质素与黑色素瘤
性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生 物有生物素酰肼（BHZ）及肼化生物素 （BCHZ）。
亲和素（ Avidin ）－抗生物素蛋白、抗生物素
是从鸡蛋清中提取的一种糖蛋白， 它由四个相同的氨基酸亚基组成， 亚基之间通过二硫键连接，亲和素 的每一个亚基含有一个与生物素结 合的位点，并与生物素或其衍生物 形成高度稳定的复合物。
1. BA-酶免疫技术
原理
亲和素可预包被在酶标板孔内，然后再 将生物素化抗体Ab(或抗原Ag)包被于孔
内。通过BA将免疫复合物与酶连接起来，
能有效地放大EIA法，使其灵敏性增强。
优点
生物素对抗体和酶的标记率高，又不影响其 他活性。 生物素亲和素的结合极为稳定，不会在孵育 和各种洗涤过程中脱落。 每个亲和素分子能结合4个生物素，能耦合 更多的联结生物素的酶分子，提高EIA的敏感 性。
۞ Morag
G.等使用硝基-(链霉)亲和素吸附于分离柱 上,分离提纯兔抗血清中的免疫球蛋白、抗-转移因 子等,每一例均可在解离生物素化探针后,恢复分离 柱的生物学特性。
۞在制备特异性破骨细胞cDNA库时,加入 生物素化的mRNA,然后通过固相亲和素提取。 用斑点印迹法分析,发现在此提取物中, 高度聚集了特异性破骨细胞cDNA。
生物素-亲和素免疫放大技术
第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。
二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。
（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。
（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。
标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。
三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。
2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。
3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。
亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。
四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。
生物素亲和素系统
生物素亲和素系统
生物素亲和素系统是一种常见的分子生物学工具，用于检测和分离含有生物素标记的蛋白质、核酸或其它小分子。
它基于生物素和亲和素之间的高亲和力结合，可以实现精确、高效地分离和纯化目标分子。
生物素亲和素系统包括生物素标记和亲和素基质两个部分。
生物素标记可以通过不同的方法引入到目标分子中，例如化学标记、基因工程技术等。
而亲和素基质则是一种具有高亲和力的固相材料，用于捕获含有生物素标记的目标分子。
在实验中，通常将亲和素基质填充到柱子中，通过流动相将样品经过柱子，利用亲和素与生物素之间的结合作用，将含有生物素标记的目标分子捕获。
最后，可以通过洗脱等步骤将目标分子从亲和素基质上纯化出来。
生物素亲和素系统具有操作方便、灵敏度高、选择性好等优点，被广泛应用于分子生物学及其它领域的研究。
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亲和素 链霉亲和素 生物素 生物素衍生物及配体连接 生物素亲和素系统的应用 链霉亲和素磁珠制备 链霉亲和素包被板制备 生物素连接抗原/抗体实验 生物素—链霉亲和素系统在项目的试验
郑州安图生物 2008年
亲和素(Avidin)
一、来源： 亲和素主要存在于鸡蛋清中，可通过离子交换和分子筛方法提 纯，从1L蛋清中可提取纯亲和素15-25mg。亲和素可以在PH 5-7的高盐 缓冲液中结晶出来，但没有报道在等电点附近的缓冲液中可以结晶析出。
三、活性：SA 和AV 的活性都是结合生物素的量来表示，1mg蛋白结合生物 素的微克数就是该蛋白的活性单位。从分子量计算，AV的最高活性是 15u，完整SA是14u，核心SA 的分子量较低，最高活性可达l8u，但由于 1分子蛋白都结合4分子生物素，故它们的应用效果相同。
AV的活性基团是肽链中的4个色氨酸残基，SA 的活性基团也是肽链中的色 氨酸残基，当用对色氨酸特异的Koshlands试剂处理后，SA就丧失了和生 物素结合的能力。最近实验又显示，酪氨酸残基对蛋白的活性也有作用， AV的每条肽链中只有一个酪氨酸残基(Tyr)，硝基苯磺酰氟(Nbs-F)只要平 均修饰它的0.5个Tyr，就可使其完全失去活性。SA的每条肽链中含6个Tyr 残基， Nbs-F也修饰其中的一半即3个可便SA失去结合生物素活性。 四：等电点： PH= 6.0
温度、盐的影响：游离亲和素在85℃就会失活，但是生物素-亲和素复合物可 在短时间内耐受132 ℃的高温。生物素-亲和素复合物对热的耐受能力依赖于 盐的存在，在没有盐存在时， 100 ℃10分钟约有88%的生物素-亲和素复合物 解离，但在有盐存在的条件下，需120 ℃15分钟复合物才能完全解离。
PH、变性剂影响：生物素-亲和素复合物在PH 2-13或8M盐酸胍（中性）条件 下不会受到影响，并可以用硫酸锌沉淀，但是沉淀出的复合物用70%蚁酸处 理1小时会使亲和素不可逆失活。
二、分子量：亲和素由四个相同的亚单位组成，每个亚单位的肽链中有128个 氨基酸残基，其中每条肽链含4个甘露糖，3个氨基葡糖，含糖量达1O%。 每个亚单位的分子量约为15600，整个亲和素分子的分子量66000-69000。
三、亲和力：亲和素的每个亚单位可结合一个生物素分子，即一个AV可结合4 个生物素分子，二者之间的亲和力极强，亲和素常数（Ka）为10^15Ｌ
／ mol，比抗原与抗体间的亲和力（Ka＝10^5～11L／mol）至少高1万 倍，因此二者பைடு நூலகம்结合特异性高和稳定性好。1mg纯的亲和素的活性约为 13—15U。
三、等电点： PH= 10.5
四、活性基团：亲和素对官能团的修饰不敏感，对其20%的羧基基团进行脂 化和59%的氨基基团进行酰胺化都不会影响其与生物素的结合。但是当 对色氨酸和赖氨酸残基进行修饰时会显著影响其与生物素的结合活性。 即使用对色氨酸特异性的2-hydroxy-5-nitrophenyl bromide试剂对亲和 素每个亚基上的一个色氨酸氧化，亲和素就完全丧失了与生物素的结合 能力。赖氨酸对亲和素与生物素的结合也起着重要作用，氨基特异性试剂 2，4二硝基氟苯与游离亲和素的反应较结合生物素的亲和素反应速度快说 明了这一点。当每个亲和素亚基上引入二硝基基团后，亲和素的活性就会 消失，证明亲和素亚基上的3个赖氨酸残基可能在生物素的结合位点。但是 像三硝基氟苯和丹磺酰氯由于不易接近生物素的结合位点附近的赖氨酸残 基因此不会对亲和素的活性造成影响。
二、分子量：一条完整的SA肽链中有159个氨基酸残基，其中甘、丙氨基酸 含量较大，且又不含任何糖基，分子量为16450。SA 在培养过程中受蛋 白酶的作用，肽链可从N端的lO～l2位和G末端19-21位处断裂，使每条 肽链只含125-127个氨基酸残基，分子量降为13O96～13254，此即核心 SA，核心SA的分子量约54KD。后者的每条肽链仍可结合一个生物素分 子， 即一个完整的核心SA 仍可结合4个生物素分子。
在ELISA 中的应用： 由于SA 的等电点低，表面带的正电荷少，因 此它和聚苯乙烯板载体的静电吸附力弱，SA的阴性对照显色明显比 AV低，这样在ELIsA 上应用SA 可进一步提高方法的灵敏度。
链霉亲和素（SA）结构图
亲和素与链霉亲和素的比较
相同点： 1、生物素结合能力： AV:13-15U, SA:14-18U 2、活性中心依赖于色氨酸-赖氨酸： 亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111 两个位点含有色氨酸-赖氨酸，链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两 个位点含有色氨酸-赖氨酸，但是亲和素较链霉亲和素更易于被N-溴代琥珀酰 亚胺氧化。
表面活性剂影响：C14 标记的亲和素与固相生物素的结合不受1% SDS, Tween 20, Tween 40, Triton X-100和两性表面活性剂的影响。而生物素化蛋白与固 相亲和素的结合会受这些表面活性剂的影响而减弱，易于解离。因此将生物素 化蛋白从固相亲和素上解离使用SDS和高温（95.6）即可。暗示亲和素与生物 素化分子的结合会受表面活性剂的影响而降低。
七、亲和素与生物素结合的随机性：尽管亲和素与生物素结合时需要亲和素亚基间 的相互作用，但是多种实验证据表明亲和素与生物素的结合是随机的，即当一个亚 基结合生物素后不会对其他亚基与生物素的结合造成影响，而链霉亲和素与生物素 的结合具有协同效应。
链霉亲和素(Streptavidin)
一、来源：链霉亲和素是Streptomyces avidinii菌培养过程中的分泌产 物，主要通过2一亚氨基生物素亲和层析法提纯，1L培养液中含蛋白 10-60mg；目前也有基因重组技术表达的链霉亲和素。
五、稳定性：亲和素对6M尿素和3M盐酸胍有耐受性，当盐酸胍浓度至3.5M时 其生物素结合能力下降，至6M时四聚体降解为单体，但是当盐酸胍浓度再 降低至3M时其结合生物素的能力又能恢复。亲和素与生物素的结合能力很 强，在8M盐酸胍PH1.5条件下，亲和素与生物素可以完全解离。
六、亲和素-生物素复合物稳定性：生物素-亲和素是已知的蛋白和配体间非共 价结合的最强作用力（Ka=10^15M-L)，生物素和亲和素间的结合很迅速， 而且一旦结合，不易受PH，温度，有机溶剂及蛋白酶的影响。