大肠杆菌感受态制备方法
大肠杆菌感受态的制备
五、本实验所需要掌握内容
掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休 克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰 浴，冷却1－2分钟。
9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分 钟。
10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的 LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放 置几分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM 的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即 成感受态细胞悬液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存 于-70℃可保存半年。 取其中一份进,轻度摇晃混合 后于冰上放置30分钟。
实验二、大肠杆菌感受态的制备
一、实验原理
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制 备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌， 从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此 条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面， 通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
试剂： 1.LB固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。 5. 待转化质粒。
三、实验步骤
11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。
四、实验注意事项
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时 为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细 胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR. 或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下 进行。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。
下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。
通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。
感受态大肠杆菌制备方法
感受态大肠杆菌制备方法四川大学生命科学学院试剂配制：A液：1M，MnCl2；mol/LB液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液：称取CaCl20.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。
将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
TB缓冲液：方法步骤：1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，3、其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，4、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10×8，好时可到10×9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。
无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备1. CaCl2法1）从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有5ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时。
2）将培养物接种到200ml LB培养基中，37℃培养至OD约为0.3到0.5，然后置于冰浴中20分钟。
3）用预冷的30ml管收集菌体，4℃6000rpm 离心5分钟。
4）弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
5）用预冷的0.1M CaCl210ml重悬菌体，4℃6000rpm 离心5分钟；弃上清，于超净台中倒置10－20秒，控干管壁上的液滴。
6）重复步骤5）7）加入预冷的0.1MCaCl2 1ml/管，重悬菌体，置于4℃。
8）立即取100μl新鲜制备的感受态细胞转化质粒或连接产物。
9）转化结束后14小时左右观察转化平板，检测转化效率。
10）取出置于4℃的感受态细胞，加入等体积的－20℃预冷的0.1M CaCl2－甘油（由0.1MCaCl和甘油等体积混合后高压蒸汽灭菌而成），混匀后以150μl/管分装至－20℃预冷的无菌微量离心管中，立即置于－70℃保存。
2.细菌电转化感受态细胞的制备1）将新鲜的菌落或细菌菌种冻存物接种于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养8－12小时，然后转接含400ml LB培养基的1L摇瓶中，37℃振荡培养至OD600约为0.8，将细菌培养物置于冰浴20－60分钟。
2）用预冷的30ml离心管于4℃6000rpm离心5分钟。
收集菌体，弃上清。
3）用预冷的10％甘油（10％超纯甘油加90％去离子水，高压蒸汽灭菌）轻轻重悬菌体，4℃6000rpm离心5分钟，弃上清。
4）重复步骤3）两次，最后合并至1支30ml管中。
5）弃上清后，用1ml无菌、预冷的10％甘油轻轻重悬菌体，分装至无菌预冷的微量离心管中，每管20μl，保存于－70℃。
用该方法制备的细菌感受态细胞转化效率比CaCl2法高出100倍左右。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：①从野生Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中至少30分钟（目的：抑制大肠杆菌生长）③于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中，冰浴放置40分钟；CaCl2④4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl（含210%甘油）重悬细胞，以每管100-200µl分装备用。
不及时使用的各管于-80℃保存。
注：细胞重悬时动作要尽量轻柔，切忌用枪吹打。
新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好（2）热激转化感受态取感受态细胞，加入外源连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中，90秒-2分钟立刻转到冰浴，冷却2分钟加入900UL培养基，37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟，弃上清，留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上，倒置平皿，37培养过夜，菌落长出。
注：转质粒加入质粒1-2ul即可，且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。
原理：其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理和操作步骤
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
实验大肠杆菌感受态细胞制备及铺平板筛选转化子
大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化及铺平板筛选转化子一、实验目的了解大肠杆菌感受态细胞制备、质粒转化大肠杆菌、转化子筛选的原理和一般方法。
二、实验原理质粒是基因工程的常用载体，携带外源基因的质粒可进入经过一定处理、容易接受外源基因的受体细胞，即感受态细胞，并在受体细胞内扩增（基因克隆）或表达外源基因（基因表达）。
质粒载体或携带外源基因的质粒进入受体细胞的过程称为转化，质粒转化的受体细胞称为转化子。
（一）制备感受态细胞常用方法：1.电击法（电穿孔法）。
电转法需要仪器，超螺旋质粒转化效率大于109转化子 /μgDNA)。
2.化学诱导法：a. CaCl2法：CaCl2试剂便宜、易得，超螺旋质粒转化效率大约为106－108转化子 /μgDN。
b. PEG法：PEG法制备方法更简便（一步完成），超螺旋质粒转化效率大约为106－108 转化子 /μgDNA。
（二）关于质粒：1.质粒是一种寄生于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA分子。
2.质粒的特点a.在宿主细胞中，质粒一般以超螺旋共价闭环DNA分子b.能自主复制、但其复制受到宿主细胞的控制，需要利用宿主的酶系统。
c.复制产物可正确分配给子代细胞3.质粒的用途: 主要作为基因重组的一种载体。
4.提取质粒的大致过程：扩增宿主菌：加适宜的抗生素（特异抗生素、氯霉素）。
裂解宿主菌：碱处理法、加热处理法、去污剂处理法、酶法。
提取质粒：变性沉淀其他物质、分离质粒。
纯化质粒：琼脂糖凝胶电泳、离子交换层析、氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心。
5.选择裂解方法原则选择裂解方法主要取决于质粒的大小。
(1)大质粒(大于15kb)选用缓和裂解法。
用溶菌酶和EDTA进行处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解原生质体。
(2)小质粒用较剧烈的方法分离。
在加入EDTA后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。
受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，使外源DNA能够进入；进入受体细胞的DNA分子可表达其携带的某些基因（如抗生素抗性、酶等选择标记基因），使转化细胞在选择培养基上表现出不同于未转化细胞的特征，从而可将转化细胞选择出来。
大肠杆菌化转感受态制备
大肠杆菌化转感受态制备大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，具有广泛的生物学功能和应用价值。
化转感受态制备是一种常用的方法，通过改变大肠杆菌的遗传物质，使其表达特定的转基因产物。
本文将介绍大肠杆菌化转感受态制备的原理、方法以及应用。
一、大肠杆菌化转感受态制备的原理大肠杆菌化转感受态制备是利用大肠杆菌的自然特性和遗传工程技术，将外源DNA导入大肠杆菌细胞内，并使其稳定表达。
大肠杆菌细胞通过自身的DNA复制和转录机制，将外源DNA整合到自身的基因组中，从而使外源基因在大肠杆菌中得以表达。
1. 质粒转化法：将质粒DNA与大肠杆菌细胞一起处理，使质粒DNA 进入大肠杆菌细胞内，并通过质粒DNA上的选择标记基因筛选转化成功的细胞。
2. 噬菌体转染法：利用噬菌体作为载体，将外源DNA导入大肠杆菌细胞内，并通过噬菌体的复制和感染机制，使外源DNA稳定表达。
3. 电穿孔法：利用高压电脉冲使大肠杆菌细胞膜发生破裂，外源DNA得以进入细胞内，并通过细胞自身的修复机制，使外源DNA稳定表达。
4. 钙离子转化法：利用钙离子与外源DNA形成复合物，通过渗透作用使其进入大肠杆菌细胞内，并通过细胞自身的代谢机制使外源DNA稳定表达。
三、大肠杆菌化转感受态制备的应用1. 蛋白表达：通过将目的基因导入大肠杆菌细胞内，使其表达目的蛋白，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
2. DNA克隆：利用大肠杆菌的高效复制和转录机制，将目的DNA片段插入质粒中，并通过质粒在大肠杆菌中的复制和传递，实现DNA 的克隆和扩增。
3. 突变分析：通过外源DNA的插入、缺失或替换，研究大肠杆菌基因的功能和调控机制，为进一步研究生物学问题提供重要工具。
4. 基因敲除和敲入：通过将外源DNA的特定片段插入大肠杆菌基因组中，实现对目的基因的敲除或敲入，研究基因功能和调控网络。
5. 抗生素筛选：利用大肠杆菌对抗生素的敏感性，通过将目的基因导入大肠杆菌中，筛选抗生素抗性基因。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
在科学研究中，大肠杆菌常被用作实验模型，因其生长迅速、培养简便，以及对环境因素的敏感性等特点。
为了更好地研究大肠杆菌的感受态细胞，需要进行细胞的制备工作。
大肠杆菌感受态细胞的制备工作通常包括以下几个步骤：1. 培养基的准备：首先，需要准备适合大肠杆菌生长的培养基。
常用的培养基包括Luria-Bertani（LB）培养基和M9培养基等。
这些培养基含有适量的营养物质，可以提供大肠杆菌生长所需的营养。
2. 菌液的接种：将已保存的大肠杆菌菌株接种到含有培养基的试管中。
接种前需要将试管和接种环进行高温灭菌处理，以消除外源性污染。
接种时应注意使用无菌技术，避免细菌污染。
3. 培养条件的控制：接种完成后，需要将试管放入恒温摇床或培养箱中进行培养。
培养的温度通常为37摄氏度，培养时间视实验需要而定。
同时，还需要控制培养基的pH值，保持在适宜的范围内。
4. 细胞的收获：培养一定时间后，可以通过离心的方法将细菌沉淀下来。
离心速度和时间的控制要根据细菌的大小和培养液的体积来确定。
沉淀下来的细菌即为大肠杆菌感受态细胞。
5. 细胞的保存：为了长期保存大肠杆菌感受态细胞，可以将其冻存。
冻存液的配制需要添加一定比例的甘油或DMSO等保护剂，以防细胞在冻存过程中受到损伤。
冻存后的感受态细胞可以在需要时重新复苏。
通过以上步骤，我们可以成功制备出大肠杆菌感受态细胞。
这些细胞可以用于进一步的研究，如基因表达调控、信号传导等方面的实验。
同时，制备大肠杆菌感受态细胞的方法也可以应用到其他微生物的研究中。
大肠杆菌感受态细胞的制备是一项重要的实验工作，它为我们深入研究大肠杆菌的生物学特性提供了基础。
通过合理的实验设计和精确的操作，我们可以获得高质量的感受态细胞，为科学研究的进展做出贡献。
希望本文的内容能够对相关研究人员有所帮助，推动科学的发展和进步。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物技术领域。
在生物技术中，大肠杆菌感受态细胞的制备是非常重要的一步。
感受态细胞是指细胞表面有特定的受体，能够感受到外界的信号，从而引发细胞内的反应。
下面将介绍大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
1. 菌株的选择首先需要选择适合的大肠杆菌菌株。
常用的菌株有DH5α、BL21等。
这些菌株具有较高的转化效率和稳定性，适合用于感受态细胞的制备。
2. 受体的构建感受态细胞的制备需要构建受体。
受体是一种蛋白质，能够与外界的信号分子结合，从而引发细胞内的反应。
常用的受体有蛋白激酶、离子通道等。
构建受体需要进行基因克隆、表达、纯化等步骤。
3. 质粒的构建构建受体需要使用质粒。
质粒是一种环状DNA分子，能够在细胞内自主复制。
常用的质粒有pET、pGEX等。
构建质粒需要进行基因克隆、转化、筛选等步骤。
4. 细胞的转化将构建好的质粒转化到大肠杆菌中。
转化是指将外源DNA导入到细胞内，使其表达外源蛋白。
转化需要进行化学转化、电转化等步骤。
5. 细胞的培养转化后的细胞需要进行培养。
培养条件包括温度、氧气、营养物质等。
培养时间需要根据不同的实验目的进行调整。
6. 受体的表达和纯化经过培养后，细胞内的受体会被表达出来。
为了得到纯净的受体，需要进行蛋白质纯化。
常用的纯化方法有亲和层析、离子交换层析等。
7. 受体的功能验证得到纯净的受体后，需要进行功能验证。
功能验证是指验证受体是否能够与外界的信号分子结合，并引发细胞内的反应。
常用的功能验证方法有荧光共振能量转移（FRET）、酶联免疫吸附实验（ELISA）等。
大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行菌株的选择、受体的构建、质粒的构建、细胞的转化、细胞的培养、受体的表达和纯化、受体的功能验证等步骤。
这些步骤需要严格控制，才能得到高质量的感受态细胞。
感受态大肠杆菌制备方法.
感受态大肠杆菌制备方法A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。
将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。
取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。
无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP 管冰箱即开始转化。
大肠杆菌感受态细胞制备
E.coli Top10感受态细胞制备（CaCl2法）一、实验材料准备灭菌材料（提前2天）：一盒1.5mL EP管，6支50mL离心管（用四个），无菌大板小板，LB固体培养基，200mL LB液体培养基（100mL LB/500mL锥形瓶，现配，超纯水），0.1M CaCl2（现配50mL）、0.1M CaCl2+15%甘油（现配50mL）。
二、菌种活化无菌枪尖吸5μL感受态细胞（菌种也可）在新鲜的LB琼脂平板划线，37℃培养12-16小时。
注：划线尽量长、多，这样才可分出单菌落；如果早上做尽量早点接种划线，最好9点之前，否则就前一天晚上划线过夜培养；单个LB板（选用大板）如果用100mL倒平板，可先倒一个LB板（按15mL计算），剩余LB再加抗生素制成抗性平板。
三、预培养从LB平板上挑取一个分隔良好(处于线上形态圆润)的单菌落，转到一个含5mL LB的试管中，37℃，150rpm,12h。
此处过夜培养注：此处用两支试管，挑2个单菌落，但后面只用一个试管，好处防止某个管不长。
四、培养至对数期第二天早上从5mL菌液中各吸取1mL转接入2个100mL LB/500mL锥形瓶，37℃，200rpm，培养约2h，使OD达到0.4~0.6。
转接前吸取2mL LB培养基作空白对照。
在一个半小时时就测OD600，然后每隔10分钟测一次，接近0.4时每隔2分钟测一次。
注：开始接种时就把50mL和 1.5mL离心管放在-20℃冰箱，0.1M CaCl2、0.1MCaCl2+15%甘油、整盒蓝黄枪尖放在4℃。
培养1h时打开分光光度计预热，离心机预冷至4℃。
五、感受态细胞制备1.无菌条件下，将菌液转移到4个预冷的50mL圆底离心管中，在冰上放置10min。
2.4℃，1500g（尖底离心管1300rpm），离心10min，去上清，用枪吸尽残存培养基。
3.10mL预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，放置冰上，10min。
大肠杆菌感受态细胞制备实验(CaCl2法) (PDF)
大肠杆菌感受态细胞制备实验（CaCl2法）细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenent cells）。
1实验方法原理：带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
2实验材料、试剂、仪器耗材：E. coli DH5α菌株LB固体培养基、LB液体培养基、CaCl2、硫酸镁、SOB、TFB等培养皿、恒温摇床、聚丙烯管、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、烧瓶、恒温水浴锅、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪、锥形瓶、试管等3实验步骤：1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB 或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6、于4 ℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
大肠杆菌感受态细胞制备
大肠杆菌感受态细胞制备试剂与材料：0.1mol CaCl2含15%甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液1.5 ml离心管，枪头（都用新的，不要回收的）仪器：无菌操作台，恒温摇床，分光光度计，离心机，超低温冰箱（遗传实验室，冻存感受态细胞）。
（1）从37 o C培养16-20 h的平板中用接种针刮取一个单菌落，沾入一个含100 ml LB培养基的烧瓶中。
于37 o C剧烈振摇培养2-3 h，（摇菌2h后测定OD600，即600 nm下的吸光度，每隔15 min测定一次，用玻璃比色皿即可），当OD值达到0.4时，菌处于对数生长期，可进行感受态制备。
（当OD值达到标准后要马上进行感受态制备），整个过程要严格无菌操作避免污染杂菌！！！。
（2）将菌液转入1.5ml离心管中，每管1ml，冰上放置15 min（制备10管，剩余的菌弃掉，离心管不要用回收的）。
（3）然后于4 o C下5000 rpm（rpm即“转/min”）离心10 min弃上清。
（注意看离心管底有无沉淀，若无沉淀则需加大离心转速）（4）每管加入600 μl预冷的CaCl2（0.1mol/L），将菌体均匀悬浮（用移液枪轻轻吹打），冰上放置30 min。
（5）4 o C下，5000 rpm离心10 min，弃上清。
（6）每管加入40 μl 含15% 甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液，即为感受态，冻存于-70 o C。
（若立即使用则加入0.1 mol/L CaCl2溶液即可）。
注意：（1）整个过程都要在冰上进行（除4o C离心过程），此为制备成功的关键。
（提前用制冰机制冰）（2）注意离心管内溶液不要冻住，细胞反复冻融会死亡。
（3）整个过程需严格无菌操作！！！，需在无菌操作台进行，将酒精灯与感受态细胞分别置于操作台的两端，感受态细胞喜冷。
（5）操作过程戴手套，避免污染。
溶液配制：0.1mol CaCl2：称取0.2219 g CaCl2定容至20 ml（高压灭菌）含15%甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液：称取0.2219 g CaCl2，加3 ml甘油（丙三醇），用蒸馏水定容至20 ml。
实验10、大肠杆菌感受态的制备
实验十、大肠杆菌感受态细胞的制备【实验目的】熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。
【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠，无水CaCl2，蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α, pUC18质粒【实验步骤】1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。
2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2 h）。
大肠杆菌感受态的制备
大肠杆菌感受态的制备原理: 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。
转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。
材料：Top10、pcDNA3.0, TB buffer（现用现配）、超纯水、碎冰。
LB液体培养基200 ml（不含AMP）、LB固体培养基（含AMP）、LB固体培养基（不含AMP）10ml圆底离心管（玻璃或塑料）、100ml锥形瓶、2.0 ml离心管、各型号枪头, 刻度移液管均需灭菌处理甘油：100ml (高压灭菌)氨苄（母液100mg/ml，终浓度为100ug/ml）： 1ml母液需氨苄100mg 过滤除菌。
仪器：滤器、0.22um微孔滤膜、刻度吸量管、恒温摇床、恒温培养箱, 分光光度计、比色杯、低温离心机、制冰机、超净工作台, 移液器。
步骤：1）从冻存的E.coli .Top 10, 划线接种至LB固体培养基（不含AMP）. 37℃培养O/N, 16h左右。
2) 从新活化的E.coli .Top 10菌平板上挑取一单菌落，接种与2ml LB液体培养基（10ml圆底离心管）中，37℃振荡培养O/N, 16h左右。
备注: E.coli . Top 10, 20%无菌甘油, －70℃保存。
3)将该菌悬液以(400UL)1:100～1:50转接于20 ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液明显混浊后，2.5~3小时后测一次OD(600nm)，至OD600nm≤0.6时停止培养.摇菌期间, 配TB buffer，开制冰机。
TB buffer置于冰上预冷(20~30分钟). 低温离心机预冷(20~30分钟)以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4）细菌置于冰上,10min。
5）取12管, 1.5 ml细菌培养液3000 g 4℃离心5min,弃上清。
6) 每管加200 ul 预冷的LB，轻轻混匀, 均成2管, 置冰上20~30分钟，3000 g 4℃离心5min,弃上清。
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
所用的 CaCl2 等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于 ⑶、防止杂菌和杂 DNA 的污染
4 ℃。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿， 如离心管， 移液枪头等最好是新的， 并经
高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、
DNA 酶或杂 DNA 所污染，
否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入。
OD600 控制。对
TG1 菌株， OD600 为 0 ． 5 时，细胞密度在 5×107 个 /ml 左右。（应注意 OD600 值与细
胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体
细胞一般应是限制 -修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并
且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 ⑵、试剂的质量
上摇动 10min, 弃去染色液 .
③ 加入约 50ml 的水 , 再加热至沸腾后保持沸腾状态
30-60s, 停止加热后在摇床上要
5-10min, 换水可完成脱色 .
④ 若要得到无背景的染色胶 ,可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜 .
镍柱。 用不同浓度的咪唑洗脱。 因为咪唑和组氨酸都带正电， 可在咪唑逐渐加大浓度的条件 下洗脱目的蛋白。 protocol 里有啊。
（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。） (1) 将菌液转入 50mL 离心管中，冰上放置 10min 。 (2) 在 4 ℃下， 4000r/min 离心 10min 。弃去上清，将管倒置 1min 以便培养液流尽。 (3) 用冰上预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液 10mL 轻轻悬浮细胞，冰上放置 30min 。 (4)0 ～ 4℃ 4000r/min 离心 10min ，弃去上清， 加入 2mL 预冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液， 轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。 （注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制 备）
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大肠杆菌感受态制备方法
1. 从37℃培养16~20 h 的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1 ml 新鲜的16~20 h过夜培养物，转到一个含有100ml LB培养基的1 L 或500 ml 培养瓶中（1:100）。
于37℃振摇培养约2~3 h（旋转摇床200~300 r/min），每隔20~30 min 值≈0.4。
测量OD
600
2. 在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50 ml 聚丙烯离心管中，冰浴10~20 min。
3. 于4℃4000转/分离心10 min，回收细菌细胞。
4. 将管倒置1 min（或用枪头吸干），以使最后残留的培养液流尽。
5. 用10 ml冰预冷的0.1 mM CaCl2重悬每份沉淀，放于冰上，4℃4000转/分离心10 min，回收细菌细胞。
重悬操作要轻柔！
6. 每50 ml 初始培养物用2 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2（20%甘油）重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。
重悬操作要轻柔！。