实验六-酵母蔗糖酶的粗讲义提及其比活力测定
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告一、实验目的本实验旨在学习酵母蔗糖酶的提取方法，并掌握其酶活力的测定方法。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种重要的生物催化剂，广泛应用于食品工业、医药工业等领域。
其提取方法主要包括细胞破碎法和超声波法。
细胞破碎法是将酵母细胞经过离心、洗涤后，在低温下使用高压均质机或超声波仪器进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
而超声波法则是将细胞悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
三、实验步骤1. 酵母菌体培养：将活性酵母菌体接种到含有10%蔗糖和0.5%酵母粉的液体培养基中，在30℃下静置48小时。
2. 细胞破碎：将培养好的菌体通过离心后洗涤两次，然后在低温下使用高压均质机进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
3. 超声波处理：将菌体悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
4. 酶活力测定：取一定量的提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，在37℃下反应30分钟后用硫酸铜试剂测定还原糖的含量。
四、实验结果通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，测得其酶活力分别为10.5 U/g和12.8 U/g。
五、实验分析1. 细胞破碎法和超声波法都可以用于酵母蔗糖酶的提取，但是超声波法更加快速、高效。
2. 酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意培养基成分和温度等因素。
3. 酵母蔗糖酶的测定方法可以采用硫酸铜法，但是也可以采用其他方法，如比色法和光度法等。
六、实验结论本实验通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，并测定了其酶活力。
结果表明，超声波法更加高效。
同时，酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意调整培养条件。
最后，硫酸铜法可以用于测定酵母蔗糖酶的活力。
酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定的改进方法
一、背景介绍酵母蔗糖酶是一种重要的酶类，它在葡萄糖代谢途径中起着关键作用。
酵母蔗糖酶的提取纯化及酶活测定是生物化学与分子生物学研究中常见的实验操作。
在这个过程中，酵母蔗糖酶的纯化程度和酶活测定的准确性直接影响着后续的实验结果。
二、传统提取纯化及酶活测定方法存在的问题1. 低纯度：传统的提取纯化方法往往不能够完全去除其他蛋白质或杂质，导致提取的酵母蔗糖酶纯度较低。
2. 酶活测定不精准：常见的酶活测定方法对于活性较低的酶样本测定效果较差，难以得到准确的酶活性数据。
3. 操作繁琐：传统方法需要多次离心、沉淀和洗涤等步骤，耗时且操作繁琐。
三、改进方法鉴于传统方法存在的问题，我们提出了一种改进的酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定方法，主要包括以下几个关键步骤：1. 酵母蔗糖酶提取（1）酵母细胞破碎：采用超声波破碎或高压破碎技术，将酵母细胞有效破碎，释放出蔗糖酶。
（2）蛋白质沉淀：利用差速离心法或特定沉淀剂沉淀出目标蛋白质，提高酶的纯度。
2. 酶活测定（1）比色法测定：采用改良的Folin-Phenol比色法，提高对酶活性的测定准确性。
（2）酶活性计算：采用新的酶活性计算公式，更准确地反映酶的活性水平。
四、结果与讨论我们采用改进方法对酵母蔗糖酶进行提取纯化及酶活测定，得到的结果表明，与传统方法相比，改进方法在以下几个方面有了显著改善：1. 提取纯化效果显著：采用改进方法提取的酵母蔗糖酶纯度明显提高，杂质含量大幅降低。
2. 酶活测定更准确：采用改进方法测定的酶活性数据更为准确可靠，对活性较低的酶样本也能够进行精准测定。
3. 操作简便高效：改进方法简化了提取纯化的操作步骤，减少了操作时间，提高了实验效率。
五、结论我们的改进方法在酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定中取得了良好的效果，显著提高了酶的纯度和活性测定的准确性，为相关领域的研究提供了重要的实验技术支持。
该方法的推广应用将有助于推动相关研究领域的发展，促进酵母蔗糖酶的深入研究和应用。
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
实验十四 酵母蔗糖酶
分离、 纯化、活力测定、电泳检测
蔗糖酶的提取纯化
一、实验目的和要求：
了解离子交换层析的基本原理。 掌握蔗糖酶的提取纯化及离子交换层析的基本步骤。 熟悉有关生化技术的操作方法。
二、实验原理
蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它催化蔗糖水解为等 量的葡萄糖和果糖。因此，每水解1 mol 蔗糖， 就生成2 mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法， 如Nelson 比色法、斐林试剂法等。 本实验用干酵母为原料，通过破碎细胞，热处理， 乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶 （invertase），并对其性质进行测定。
五、实验主要仪器
722分光光度计 恒温水浴 试管 移液管
六、实验操作流程
标准曲线制作→蛋白浓度测定→酶活力分析
七、实验操作关键步骤
1、标准曲线的制作： 取9支试管，按下表加入试剂：
管号 试剂
1
2
3
4
5
6
7
8
9
葡萄糖1g/L （ml）
蒸馏水 (ml) 3,5-二硝基水 杨酸(ml)
三、实验主要材料
上一实验通过离子交换获得的蔗糖酶液。
酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓和酶活力测定
蛋白总量 = 蛋白浓度×总体积 总酶活 = 酶活×校正体积 比活力（Unit/mg）＝总酶活力/总蛋白 纯化倍数 = 比活力之比 回收率 = 总酶活之比
分实验四：离子交换柱层析纯化蔗糖酶
一、实验目的 学习掌握离子交换柱层析的原理与操作
二 、实验原理
离子交换是指液相中的离子与固相交换 基团中的离子可逆反应。离子交换剂有阳离子 交换剂（如：羧甲基纤维素：CM-纤维素）和阴 离子交换剂（如：二乙氨基乙基纤维素： DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经 离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电 荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改 变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来 。
➢在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。 ➢葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。 ➢氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原
糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂 磷钼酸试剂 葡萄糖标准溶液 0.2mol/L蔗糖溶液 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9
将2-3mL醇级分2用移液管沿着管壁轻轻加到 层析柱中，注意不要扰动柱床，上样后，用大约 30ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，当A280nm 值降低稳定后，可用恒流泵及梯度混合器进行梯度 洗脱 [梯度混合器左侧放入50ml 0.02 mol/L pH值 为7.3的Tris-HCl缓冲液（含1 mol/L NaCl）， 右侧放入等量0.02 mol/LpH值为7.3的Tris-HCl 缓冲液]。
10 ──反应10min
B ──每管加入酶液mL数 原始酶液的酶活力 E = (E′/2)×稀释倍数
分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 （G-250法）
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告酵母蔗糖酶的提取实验报告1. 引言酵母蔗糖酶是一种重要的酶，在许多生物过程中起着关键作用。
通过提取酵母蔗糖酶，我们可以深入了解其结构和功能，以及其在实际应用中的潜力。
本实验旨在通过一系列步骤，从酵母细胞中提取酵母蔗糖酶，并评估其活性和效果。
2. 方法和材料2.1 材料- 新鲜酵母菌浆液- 蒸馏水- 磷酸缓冲液- 蔗糖溶液- 高速冷离心机- 低速冷离心机- 离心管- 离心管架- 塑料吸管- 双室温度计- 分光光度计- 试管2.2 实验步骤步骤1：制备酵母酶提取液a) 将10ml新鲜酵母菌浆液倒入离心管中，并以1500rpm的速度在低温下离心10分钟。
b) 将上清液转移至另一个离心管中，再次进行高速离心，以去除细胞碎片。
步骤2：沉淀酵母蔗糖酶a) 将上一步中得到的上清液倒入一个含有7ml蔗糖溶液的试管中。
b) 在室温下孵育搅拌2小时，让酵母蔗糖酶与蔗糖结合形成沉淀。
c) 用低速离心将沉淀分离。
收集上清液备用。
步骤3：测定酵母蔗糖酶活性a) 在分光光度计中设置波长为540nm。
b) 取1ml上清液和1ml磷酸缓冲液混合，作为空白对照。
c) 另取1ml上清液和1ml含20%蔗糖溶液的试管中，作为实验组。
d) 在不同时间点（例如0、1、2、3、4分钟）测定两个试管的吸光度，并记录数据。
e) 计算酵母蔗糖酶的活性。
3. 结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地提取了酵母蔗糖酶，并可以测定其活性。
根据测定结果，我们观察到酵母蔗糖酶在一定时间范围内对蔗糖的降解表现出线性增加的趋势。
这表明酵母蔗糖酶在一定程度上具有稳定的催化作用。
通过本实验，我们还可以根据酵母蔗糖酶的活性表征其在不同条件下的稳定性、催化效率和适应性。
我们可以改变温度和pH值，观察对酵母蔗糖酶活性的影响，从而了解其最适宜的操作条件。
通过进一步的研究，我们还可以探索酵母蔗糖酶在生物制药、食品加工和能源生产等领域的应用潜力。
总结回顾：通过酵母蔗糖酶的提取实验，我们深入了解了酵母蔗糖酶的结构、功能和应用前景。
酵母蔗糖酶实验报告
一、实验目的1. 学习酵母蔗糖酶的提取方法。
2. 掌握酶活力测定的原理和方法。
3. 了解酶的专一性及其影响因素。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶，并在一定条件下测定其活力，以了解其催化活性。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母粉2. 蔗糖3. 缓冲液4. 斐林试剂5. 旋光仪仪器：1. 电子天平2. 研钵3. 移液器4. 恒温水浴锅5. 烧杯6. 试管7. 离心机四、实验步骤1. 酵母蔗糖酶的提取- 称取适量酵母粉，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆转移至离心管中，离心分离，收集上清液即为酵母蔗糖酶提取液。
2. 酶活力测定- 取适量提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，置于恒温水浴锅中保温。
- 定时取样，用斐林试剂检测反应液中的还原糖含量。
- 根据还原糖含量计算酶活力。
3. 酶的专一性实验- 将提取液分别与蔗糖、淀粉等底物反应，观察酶的催化活性。
- 对比实验结果，分析酶的专一性。
4. 影响酶活力的因素实验- 分别在酸性、中性、碱性条件下进行酶活力测定，观察pH对酶活力的影响。
- 分别在不同温度下进行酶活力测定，观察温度对酶活力的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定- 酵母蔗糖酶提取液在37℃、pH 6.8条件下，酶活力最高，约为0.5单位/毫升。
2. 酶的专一性实验- 酵母蔗糖酶对蔗糖具有特异性催化作用，而对淀粉无催化活性。
3. 影响酶活力的因素实验- 酶活力受pH和温度的影响较大。
在pH 6.8、37℃条件下，酶活力最高；在酸性或碱性条件下，酶活力明显降低；在低温条件下，酶活力较低。
六、实验结论1. 成功提取了酵母蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 酵母蔗糖酶具有特异性催化作用，对蔗糖具有高效催化活性。
3. 酶活力受pH和温度的影响较大，适宜的pH和温度有利于提高酶活力。
七、实验讨论1. 本实验中，酶活力的测定方法较为简单，但结果准确可靠。
酵母蔗糖酶的提取及其性质研究 ppt课件
外酶 27万 50% 双 26mM
150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60℃
内酶13.5万 ＜3% 双 25mM
150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60℃
实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗 糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量 定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位 数。
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层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、紫外检测 仪、部分收集器、梯度洗脱器。
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层析设备
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
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低 温 层 析 柜
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柱上操作
裂，此法多适用于微生物材料。
5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠
（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处
理效果更好。
6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低
溶质的溶解度使其沉淀被析出。
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操作步骤
（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及少量二氧化硅， 放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 （3）量取预冷的去离子水6ml（分两次）缓慢加入酵母中， 边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的 效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的10ml去离子水，每次加2ml左右，边 加边研磨，至少用10分钟。 （5）将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机 离心，4℃，8000rpm，10min。如果中间白色的脂肪层厚，说
蔗糖酶提取实验报告
1. 掌握从酵母中提取蔗糖酶的基本方法。
2. 了解酶的提取、纯化及活力测定的原理和操作。
3. 掌握酶活性测定的方法。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验采用酵母作为原料，通过破碎细胞、离心、沉淀、透析等步骤提取蔗糖酶，并对其进行活力测定。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母（安琪酵母粉）2. 蔗糖3. 葡萄糖4. 果糖5. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）6. 3，5-二硝基水杨酸（DNS）仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 恒温水浴锅4. 分光光度计5. 试管6. 烧杯7. 移液器1. 酵母细胞的制备：- 称取1g酵母粉，加入10ml磷酸盐缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 将保温后的酵母悬液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
2. 酶液的提取：- 向上清液中加入等体积的50%饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜。
- 将沉淀物以3000r/min离心10分钟，收集上清液即为粗酶液。
3. 酶液的透析：- 将粗酶液置于透析袋中，置于磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中透析过夜，以去除硫酸铵等小分子杂质。
4. 酶液的活力测定：- 取1ml蔗糖溶液（2%蔗糖溶液），加入1ml透析后的酶液，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 取0.5ml反应液，加入2ml DNS试剂，沸水浴5分钟。
- 取出后，加入4ml蒸馏水，在540nm波长下测定吸光度。
五、实验结果与分析1. 酶液活力测定结果：- 通过DNS试剂显色，根据吸光度计算出酶的活力。
2. 结果分析：- 通过对比不同处理条件下的酶活力，分析提取、纯化过程中酶活力的影响因素。
六、实验结论1. 通过本实验，成功从酵母中提取了蔗糖酶。
2. 酶的提取、纯化过程中，酶活力受到pH、温度、离子强度等因素的影响。
3. 透析法是一种有效的酶纯化方法，可以去除小分子杂质，提高酶的纯度。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化——生化实验文档资料文档
实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化原理蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。
一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）2. 石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）3. 95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）4. Tris-HCl （pH7.3）缓冲液 （四）操作步骤 1. 提取＋ H 2O 蔗糖酶O HH O（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。
生物化学实验论文 从啤酒酵母中提取蔗糖酶
题名：酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定姓名：***学院：长三角绿色制药协同创新中心班级：绿色国际班学号：************2013 年12 月 27日填酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定浙江工业大学绿色制药协同创新中心宋烙摘要：采用自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶，通过离心、热提取、95%乙醇沉淀提取、Q Sepharose-柱层析法来对蔗糖酶进行纯化。
至于活力的测定，首先利用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定5min内酶能催化生成葡萄糖的量来对得到的各个提取液进行蔗糖酶活力的测定。
然后再通过Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量，之后就可以计算出各个提取液的比活力。
最后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蔗糖酶的相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；提取纯化；酶活力；蛋白质含量；相对分子质量The Extraction Method of Beer Yeast Sucroseand Vitality TestZhejiang University of Technology Green Pharmacy Xietong Chuangxin CentreSong LuoAbstract:The autolysis extracts sucrose from beer yeast. Then, purifying the sucrose by centrifugalization, hot extraction, 95% ethanol sediment extraction, and Q-Sepharose-column chromatography. As for calculate the radio of live, first of all, using 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)to calculate the each extracting solution’s radio of live by measure how much sucrose the sucrose can catalysis. After that, calculating the content of sucrose by using Lowry method., so it’s available to calculate each extracting solution’s specific activity. Finally, we used SDS-polyacrylamide gel eletrophoresis to measure the sucrose’s relative molecular mass.Keyword: sucrose；extraction；vitality；specific activity；relative molecular mass前言：本实验的是一个综合性的教学实验，主要是为了让学生养成规范的科学实验习惯，树立严谨的科研作风。
蔗糖活力测定实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解蔗糖酶的活力测定原理和方法。
2. 掌握分光光度计的使用技巧。
3. 通过实验，掌握如何测定蔗糖酶的活力。
二、实验原理蔗糖酶活力测定是通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖的速率来衡量酶的活力。
在本实验中，采用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖含量，进而计算蔗糖酶活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蔗糖酶- 蔗糖- 3,5-二硝基水杨酸- 碳酸钠- 氢氧化钠- 硫酸铜- 碘化钾- 硫酸铁铵- 水浴锅- 分光光度计- 烧杯- 容量瓶- 移液管- 秒表2. 实验仪器：- 分光光度计- 烧杯- 容量瓶- 移液管- 秒表四、实验步骤1. 配制反应液：- 称取0.1g蔗糖酶，加入1ml蒸馏水溶解。
- 称取0.5g蔗糖，加入5ml蒸馏水溶解。
- 将蔗糖溶液和蔗糖酶溶液混合，总体积为10ml。
2. 水解反应：- 将混合液放入水浴锅中，设定温度为50℃，反应时间为30分钟。
3. 还原糖测定：- 取3ml反应液，加入3,5-二硝基水杨酸溶液2ml，混匀。
- 将混合液放入水浴锅中，加热至沸，反应时间为2分钟。
- 冷却至室温，用蒸馏水定容至10ml。
4. 比色：- 使用分光光度计，以蒸馏水为参比，测定混合液在540nm处的吸光度值。
5. 结果计算：- 根据标准曲线，计算还原糖含量。
- 根据还原糖含量和反应液体积，计算蔗糖酶活力。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：- 以不同浓度的葡萄糖溶液为标准，绘制标准曲线。
2. 蔗糖酶活力计算：- 根据实验数据，计算蔗糖酶活力。
3. 结果分析：- 通过比较不同实验条件下蔗糖酶活力，分析影响酶活力的因素。
六、实验结论通过本实验，我们成功掌握了蔗糖酶活力测定的原理和方法。
实验结果表明，在一定条件下，蔗糖酶活力与还原糖含量呈正相关，说明蔗糖酶具有催化蔗糖水解的能力。
七、实验注意事项1. 实验过程中，注意保持反应液的温度恒定。
2. 使用移液管时，注意避免气泡产生。
《酵母蔗糖酶》PPT课件
12
精品医学
实验结果
计算酶活力
将吸光值代入还原糖标准曲线，得到水解液中还原糖的质量。 Y=0.67X+0.027（Y：吸光值；X：还原糖的质量（mg）） 蔗糖酶活力定义：在一定实验条件下，在规定时间内释放1mg还原糖的酶量 为一个活力单位。 酶活力（U/mL）＝还原糖毫克数×3.5（水解液体积）÷1.0（酶液体积）
0.5
－
0.5
0.5 2.0
－
精品医学
2、DNS法测定还原糖量
试剂
水解液 （mL）
粗酶液组
测定组1 对照组1
1.0
1.0
纯酶液组
测定组2 对照组2
1.0
1.0
蒸馏水
1.0
1.0
1.0
1.0
（mL）
DNS液
1.0
1.0
1.0
1.0
（mL）
沸水浴5min，自来水冷却，稀释至10mL，以对照组调零，记 录测定组OD540nm。
实验二、酵母蔗糖酶的提取和 酶活测定
1
精品医学
实验目的
学习提取酵母蔗糖酶的方法； 测定蔗糖酶活力的方法。
2
精品医学
实验材料
材料：活性干酵母粉、石英砂； 试剂：95％冰乙醇、DNS液、PBS（pH7.2）、
5％蔗糖溶液、1N NaOH溶液； 仪器：水浴锅、离心机、722型分光光度计。
3
精品医学
10
精品医学
酶活测定 1. 蔗糖酶将蔗糖水解为还原糖
试剂
（均35度预 热）
粗酶液组 测定组1 对照组1
酶液（mL）
1.0
1.0
纯酶液组 测定组2 对照组2
1.0
酵母蔗糖酶的制备与活力测定
酵母中蔗糖酶的制备及活力测定一、目的要求1、学习一种酵母中蔗糖酶的制备方法。
2.掌握3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）测定酶活力的原理和方法。
3. 掌握还原糖测定的基本原理和721分光光度计的操作。
二、实验原理蔗糖酶（invertase）（β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。
还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸(DNS)则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在520nm波长下测定光密度(OD)值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。
酶活力单位的定义：在一定条件下，反应5分钟每产生1mg还原糖所需的酶量为一个活力单位（U）。
三、仪器与试剂1. 仪器研钵，天平，离心机，721型分光光度计，恒温水浴，具塞试管25ml，沸水浴，移液器（1000ul、200 ul）2. 试剂市售酵母干粉，石英砂，丙酮（预冷）, 1mg/ml葡萄糖溶液，pH4.5醋酸缓冲液, 10%蔗糖溶液，3,5-二硝基水杨酸溶液。
四、实验方法1. 蔗糖酶制备称取10g酵母干粉和少量石英砂放入研钵中，加适量蒸馏水，用力研磨30分钟成糊状，再加蒸馏水100ml，搅匀，6层纱布过滤，滤液加2倍体积冷丙酮搅匀，静置5分钟，离心管中，平衡后3000 rpm离心10 min，弃上清取沉淀。
沉淀用2倍体积丙酮重复操作一次。
沉淀真空干燥后称重。
再称取25mg酶粉加入少量蒸馏水研磨5分钟，用蒸馏水定容至40m l作为酶应用液备用。
2. 蔗糖酶活力测定（1）制作葡萄糖标准曲线取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。
蔗糖酶分离纯化与活力测定
考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理
考马斯亮兰G 250在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。 考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。 在酸性溶液时呈茶棕色 465nm 当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，在10当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm， 10595nm 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比 蛋白质浓度范围内成正比； 100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比； 测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲 测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数， 线的直线范围内 根据所测定的A595nm值 在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量， 根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量， A595nm 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL) 从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)
热处理和乙醇沉淀
预先将恒温水浴调到50℃ 将盛有粗级分I 50℃， (1) 预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥 下保温30分钟， 地放入水浴中，50℃下保温30分钟 地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻 摇离心管。 摇离心管。 取出离心管， 冰浴中迅速冷却， 4℃，10000rpm， (2) 取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离 10min。 心10min。 将上清液转入小烧杯中，放入冰盐浴（ (3) 将上清液转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒 入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇 ），逐滴加入等体积预冷至 乙醇， 入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇， 同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟， 30分钟 10分钟 同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟， 以沉淀完全。 4℃，10000rpm，离心10min 倾去上清， 10min， 以沉淀完全。于4℃，10000rpm，离心10min，倾去上清， 并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口， 并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然 后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ ）。 后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“级分Ⅱ”）。
实验六-酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定
• 蔗糖酶活性及比活性测定原理
蔗糖酶
+
蔗糖酶的酶活单位：在40℃水浴反应10min，测 定吸光值A540，增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶 活力单位（U）。 蔗糖酶比活力测定：每毫克蔗糖酶蛋白所具有 的活力单位，对同一种酶来说，酶的比活力越高，酶 的纯度越高。
试剂
实验方法
（一）粗提取酵母蔗糖酶 （1） 量取5g的面包酵母，分几次研磨（加入少 量石英砂）至粉状，再加入10-12ml的0.01mol/LPBS （pH 6.0），搅拌混合。置于小烧杯中。
（2） 置于－20℃冰箱中，反复冻融1-2次。
（二）热提取酵母蔗糖酶 （3） 解冻，然后置于离心管中，离心，转速 11000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表2、3 方法分别测蔗糖酶A的活性及蛋白含量（蛋白含量略）。 （4） 将上述上清液置于45℃的恒温水浴锅中， 用玻璃棒缓慢搅拌30min，然后置于冰浴中迅速冷却 5min。然后装入离心管中，离心，转速11000r/min条 件下离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方法分 别测蔗糖酶B的活性及蛋白含量。
A540 酶活（U） 酶比活力（U/mg ） 酶比活力平均值（U/mg ）
5
0 0 0 0
5
5
5
5
5
5
摇匀，以对照管作空白
注意：
对照管的颜色不能太深，如果太深，需要重新配蔗糖 溶液。
实验结果分析
4 思考题：
（1）比较哪种蔗糖酶的粗提方法使酶的活性及纯度较高。 （2）本实验中有哪些影响蔗糖酶活性的因素。
0 0.1
0.2
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0.2
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试剂
（一） 蔗糖酶的粗提及活性测定 （1）冰冻无水乙醇：1瓶/班 （2）0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer，2000ml （全班共用） （3）0.01mol/L蔗糖, 用0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer配制， 200ml （大组共用） （4）2 mol/L NaOH， 1000ml （全班共用） （5）3,5-二硝基水扬酸(DNS)试剂：可配300ml （全班共用） 19.2克酒石酸钾钠溶于50ml水中（电炉加热溶解，不用沸腾）， 把.0.63克3,5-二硝基水杨酸(DNS)和26.2ml2 mol/L NaOH 加到酒 石酸钾钠的热溶液中，电炉加热溶解，冷却到50-60℃，再加0.5 克苯酚和0.5克亚硫酸钠．搅拌使溶解．冷却后加水定容至100ml， 过滤，贮于棕色瓶中。
（2）将沉淀用15ml的0.01mol/L的PBS（pH6.0） 搅拌溶解30min，溶液为浑浊液，再离心，转速 10000r/min条件下离心10min，离心后取上清液， 按下表2、3方法分别测蔗糖酶C的活性及蛋白含量。
试剂 0.1mol/L蔗糖（ml） 2 mol/L NaOH（ml）
各组酶液（ml）
表1 酵母蔗糖酶酶活性及比活力测定
对照管 粗提A1 粗提A2 热提B1
0.2
0.2
0.2
0.2
0.1
0
0
0
40℃恒温水浴准确保温10min
0.1
0.1
0.1
热提B2 0.2 0
0.1
醇提C1 0.2 0
醇提C2 0.2 0
0.1
0.1
0.01 mol/L pH6.0 PBS（ml） 0.1
2 mol/L NaOH（ml）
实验六-酵母蔗糖酶 的粗提及其比活力测
定
• 蔗糖酶活性及比活性测定原理 蔗糖酶
+
蔗糖酶的酶活单位：在40℃水浴反应10min，测 定吸光值A540，增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶 活力单位（U）。
蔗糖酶比活力测定：每毫克蔗糖酶蛋白所具有的 活力单位，对同一种酶来说，酶的比活力越高，酶的 纯度越高。
对照管的颜色不能太深，如果太深，需要重新配蔗糖 溶液。
THANKS
实验方法
（一）粗提取酵母蔗糖酶
（1） 量取5g的面包酵母，分几次研磨（加入少量 石英砂）至粉状，再加入10-12ml的0.01mol/LPBS（pH 6.0），搅拌混合。置于小烧杯中。
（2） 置于－20℃冰箱中，反复冻融1-2次。
（二）热提取酵母蔗糖酶
（3） 解冻，然后置于离心管中，离心，转速 11000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表2、3 方法分别测蔗糖酶A的活性及蛋白含量（蛋白含量 略）。
（4） 将上述上清液置于45℃的恒温水浴锅中，用 玻璃棒缓慢搅拌30min，然后置于冰浴中迅速冷却 5min。然后装入离心管中，离心，转速11000r/min 条件下离心10min，离心后取上清液，按下表2、3方 法分别测蔗糖酶B的活性及蛋白含量。
（三）乙醇提取酵母蔗糖酶
（1）取上述第4步中的上清液10ml，缓慢加入 10ml的冰冻的无水乙醇（乙醇的终浓度为50％）， 并轻轻的搅拌5min，此过程在冰浴中进行。然后装 入离心管中，转速3000r/min条件下离心5min，离心 后弃上清液，离心管倒置于滤纸上，尽可能去除乙醇 残液。留沉淀。
40℃恒温水浴中准确反应10min
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
DNS（ml） 蒸馏水（ml）
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
100℃沸水浴准确加热5min，立即冷却
5
5
5
5
5
摇匀，以对照管作空白
A540
0
酶活（U）
0
酶比活力（U/mg ）
0
5
5
5
注意：