HPLC分析方法开发与验证
HPLC分析方法的开发
溶 液 稳 定 性
色 影谱 响条
件 的
耐用性
溶液配制
标准要求
需报告内容 溶液配制 色谱条件 标准要求 需报告内容
系统适应性溶液；标准品溶液；供试液
系统适应性溶液：如分离度符合要求
标准溶液：主峰峰面积与0 h相比应在0.9~1.1之间； 供试液：总杂含量与0 h相比应在 0.9~1.1之间； 各原单杂含量的极差≤0.05%；不得出现大于0.05% 的新杂质。 主峰面积变化可以增加，重点考虑杂质峰。
增敏溶液标准要求空白溶液在供试液和标准品溶液中主峰rt不干扰供试液和标准溶液已知单杂及主峰rt与相邻峰的r15供试液和标准溶液中主峰及已知杂质的rt保持一致供试液与标准品溶液中主峰的峰纯度因子990增敏溶液与系统适应性溶液中的已知杂质rt保持一致增敏溶液与供试液相比已知杂质rt处峰面积增强需报告内容分离度
实际测得值；理论值；单个回 收率，平均回收率
耐用性
溶液配制
标准要求
溶液稳定性 需报告内容
色谱条件的
溶液配制 色谱条件
影响
标准要求
需报告内容
系统适应性溶液；标准 品溶液；供试液
系统适应性溶液：如分离度符合要 求
标准品溶液及供试液：各时间点主 峰含量（或峰面积）与0h相比应在 98.0%~102.0% ； ； 主 峰 纯 度 因 子 ≥990。 系统适应性要求：主峰含量（或峰 面积）及峰纯度因子；各时间点含 量（或峰面积）与0 h的比值；符合 要求测试点的RSD。 系统适应性溶液；标准品溶液
系统适应性要求：主峰含量（或峰面积），RRT； 各时间点含量（或峰面积）与0 h的比值；单杂含量及 极差；总杂含量与0h的比值。
HPLC有关物质分析方法验证
HPLC有关物质分析方法验证HPLC（高效液相色谱）是一种常用的物质分析方法，广泛应用于药品、食品、环境等领域。
为了保证分析结果的准确性和可靠性，对HPLC方法进行验证是非常必要的。
HPLC方法验证包括了准确性、精密度、线性范围、灵敏度、特异性和系统适应性等方面的评估。
首先，准确性是衡量方法是否精确地测量目标物质含量的能力。
方法准确性的验证包括添加回收试验、标准品浓度重现性试验以及样品稀释后的测试。
通过添加已知浓度的目标物质到待测样品中，在不同浓度下测定回收率，可以评估方法的准确性。
其次，精密度是衡量方法在短期内进行重复实验的一致性。
精密度的验证包括了重复测定试验以及系统精密度试验。
通过重复测定同一样品多次，计算相对标准偏差，可以评估方法的精密度。
线性范围是指方法在一定浓度范围内的目标物质含量与测定结果之间的关系。
验证线性范围时，需要测试少量目标物质的浓度，以及相对较高的浓度，测定结果在一定限度内应与浓度成比例关系。
灵敏度是指方法在检测限下测定目标物质的能力。
灵敏度的验证包括了检测限试验和定量限试验。
检测限试验是通过在基质中添加多个不同浓度的目标物质溶液，确定出检测限。
定量限试验是通过在基质中添加不同浓度的目标物质溶液，确定出定量限。
特异性是指方法所测定的目标物质与其他干扰物之间的选择性。
特异性的验证包括了干扰物试验和选择性试验。
通过加入干扰物到目标物质溶液中，然后进行测定，确定干扰物是否对结果产生影响。
选择性试验是通过测定其他可能存在的相关物质浓度，确定是否与目标物质有影响。
最后，系统适应性主要是验证HPLC仪器和设备的稳定性和可靠性。
系统适应性的验证包括了仪器精度试验和仪器稳定性试验。
精度试验是通过测定标准品溶液的浓度，评估仪器的精度。
稳定性试验是在一定时间范围内，对同一样品进行多次测定，评估仪器的稳定性。
在进行HPLC方法验证时，需要根据相关规范文件，制定详细的验证计划和方案，确保验证方法的全面性和科学性。
高效液相色谱仪验证方案
高效液相色谱仪验证方案引言高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析技术，它在药物分析、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用。
为了确保HPLC仪器的准确性和可靠性，以及测试结果的可信度，对HPLC仪器进行验证是非常重要的。
本文将介绍一种高效液相色谱仪验证方案，以确保仪器的正常运行和测试结果的准确性。
1. 验证目的HPLC仪器验证的主要目的是评估仪器是否满足预定的性能要求，包括准确性、精密度和线性范围等指标。
通过验证，可以确保仪器在正常使用过程中能够提供准确和可靠的测试结果，以满足相关的法规和质量标准要求。
2. 验证内容HPLC仪器验证的内容包括以下几个方面：2.1 仪器安装和传感器校准在验证之前，首先需要确保HPLC仪器已正确安装，并且各个传感器和检测器已进行校准。
校准过程应按照仪器的操作手册进行。
2.2 仪器性能参数验证仪器性能参数验证是验证HPLC仪器在运行过程中是否符合规定的性能要求。
主要包括以下几个方面：•准确性验证：通过添加已知浓度的标准溶液，并测定其浓度来评估仪器的准确性。
•精密度验证：通过重复测定同一样品，评估仪器的精密度。
可以使用相对标准偏差（RSD）来评估测量结果的一致性。
•线性范围验证：通过逐渐增加样品浓度，测定仪器的线性范围。
应选取不同浓度的标准溶液进行测试，并绘制曲线来评估仪器的线性关系。
2.3 方法验证方法验证是验证HPLC方法是否可用于定量分析的过程。
主要包括以下几个方面：•特异性验证：通过检测样品中其他成分的干扰来评估方法的特异性。
可以使用纯溶液和样品添加物进行测试。
•精密度和重复性验证：通过重复测定同一样品，评估方法的精密度和重复性。
可以使用RSD来评估测量结果的一致性。
•准确性验证：通过添加已知浓度的标准溶液，并测定其浓度来评估方法的准确性。
3. 验证计划为了有效进行HPLC仪器的验证，需要制定详细的验证计划。
验证计划应包括以下几个方面：3.1 验证目标和范围明确验证的目标和范围，确定需要验证的仪器性能参数和方法。
HPLC_方法开发
HPLC_方法开发HPLC（High Performance Liquid Chromatography）是一种广泛应用于分析领域的色谱技术，其具有快速、高效、灵敏、精确、重复性好等特点。
在HPLC方法开发过程中，需要考虑样品的物理性质、化学性质、目标分析物的特性以及后续分析的要求等因素。
首先，在HPLC方法开发的初期，需要对样品进行初步的理解和调查。
这包括确定目标分析物的性质和目标浓度范围，了解样品中可能存在的干扰物和杂质，分析样品的溶解度和稳定性等。
这些信息的获得可以通过文献调研、产品说明书、预实验等方法来进行。
接下来，选择合适的色谱柱和移动相是HPLC方法开发中的重要步骤。
色谱柱的选择主要考虑目标分析物的物理化学性质，如极性、分子量、官能团等。
根据需要可以选择反相、离子交换、凝胶渗透等不同类型的色谱柱。
移动相的选择则要考虑到目标分析物和干扰物在移动相中的溶解度和保留时间，以及保留度和分离度的平衡。
通常会进行试错法来优化移动相的配比。
优化流速和梯度程序是HPLC方法开发中的另一个关键步骤。
流速的选择需要平衡分析时间和分离度之间的关系。
流速较快可以缩短分析时间，但会降低分离度，而流速较慢可以提高分离度，但会延长分析时间。
梯度程序的优化则是为了在尽可能短的时间内同时实现目标分析物的分离和扫描。
检测器的选择也是HPLC方法开发过程中需要考虑的因素之一、常见的检测器包括紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
检测器的选择要考虑目标分析物的特性以及对灵敏度和选择性的需求。
在方法开发的过程中，还需要进行一系列的验证实验，包括系统峰形度、重复性、线性范围、检测限、定量限等方面的验证。
这些验证实验能够评估方法的可靠性和准确性，为后续的样品分析提供可靠的依据。
最后，在方法开发完成后，需要进行合适的样品前处理和样品制备方法的优化。
样品前处理步骤可以包括溶解、提取、过滤、稀释等。
样品制备方法的优化则是为了提高样品中目标分析物的得率和纯度。
HPLC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用
HP6LC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用
第6页
方法验证-系统适用性
• 系统适用性试验内容
– 在分析未知样品之前或期间，检验系统以确保系 统之性能到达要求要求
– 塔板数，拖尾因子，分离度 – 确定重现性（%RSD）
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法一部分
方法转移
非法定检验方法在试验室之间传递文 件化过程
HP4LC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用
第4页
试验室取得方法及利用过程
方法验证
- 用一个性质明确物质来挑战建立分析方法
方法确认
- 用一个确定方法来挑战现实分析环境
- 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ
- 普通不需要进行线性，范围，耐用性试验
HP2LC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用
第2页
分析方法学开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 试验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品
分析一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。
第20页
固定相
传统硅胶颗粒基质
硅羟基
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
H2P1LC及HPLCMS析方法的开发及其在药物析中的应用
Polyethoxysilane
Tetraethoxysilane (TEOS)
第21页
固定相
端基封口基团 合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
HPLC分析方法开发与验证
HPLC分析方法开发与验证HPLC（High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法）是一种常用的分析技术，广泛应用于药物研发、环境监测、食品检测等领域。
本文将从方法开发和验证两个方面介绍HPLC分析方法。
一、方法开发方法开发是确定分析物检测条件的过程。
以下是HPLC方法开发的步骤：1.确定分析目标：确定待分析的物质以及其化学性质，如分子量、分子结构等，以便选择正确的色谱柱和检测方法。
2.选择色谱柱：根据分析物的特性选择合适的色谱柱，如反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
3.优化流动相：选择适当的流动相组成，如有机溶剂和缓冲液的混合物，以实现分离效果的最大化。
4.优化柱温：通过改变柱温度来控制分析物的保留和分离，可以提高分离效果和峰形。
5.选择检测波长：根据分析物的特性选择最佳的检测波长，以最大化检测灵敏度和选择性。
6.确定流速和进样体积：通过改变流速和进样体积来优化分离效果和检测灵敏度。
7.优化pH值：对于离子化合物，通过改变缓冲液的pH值可以改变分离效果。
8.创建方法文件：根据上述优化结果，建立最终的分析方法文件，记录分析条件和步骤。
二、方法验证方法验证是确保分析方法可靠和准确的过程，以下是HPLC分析方法验证的主要内容：1.线性范围：检测浓度在一定范围内的线性关系，通过测定不同浓度的标准品并绘制标准曲线来确定。
2.精密度和重复性：通过重复测定样品的相对标准偏差（RSD）来评估分析方法的精密性。
3.准确度：通过添加已知浓度的标准品到已知浓度样品中并测定含量，评估分析方法的准确性。
4.特异性：分析物是否受其他物质的干扰，通过对混合标准溶液进行测定来评估色谱方法的特异性。
5.检出限和定量限：标准曲线下限和浓度下限的浓度，测定方法的灵敏度。
6.系统适应性：测试HPLC仪器系统的重复性和稳定性，包括波长准确性、峰对称性和分离效果。
7.样品稳定性：评估样品在一定时间和条件下的稳定性，包括溶液稳定性和冷冻/解冻稳定性。
HPLC分析方法验证指导原则
HPLC分析方法验证指导原则产品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求。
在建立产品质量标准时，分析方法需经验证；在产品生产工艺变更、配方的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。
方法验证理由、过程和结果均应记载在产品标准起草说明或修订说明中。
需验证的分析项目有：鉴别试验，杂质定量检查或限度检查，有效成分含量测定，以及其他成分（如防腐剂等）的测定。
验证内容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。
视具体方法拟订验证的内容。
附表中列出的分析项目和相应的验证内容可供参考。
方法验证内容如下：一、准确度准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。
准确度应在规定的范围内测试。
1．含量测定方法的准确度原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。
制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。
如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定结果进行比较。
如该分析方法已经测试并求出了精密度、线性和专属性，在准确度也可推算出来的情况下，这一项可不必再做。
2．杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。
如不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。
在不能测得杂质或降解产物的响应因子或对原料药的相对响应因子情况下，可用原料药的响应因子。
应明确表明单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（%）或面积比（%）。
3．数据要求在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价，例如，设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。
应报告已知加入量的回收率（%），或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信限。
HPLC分析方法的建立与开发
食品检测中的应用
食品添加剂检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的防腐剂、色素、甜味剂等添加剂的含量，确保食品的 安全性。
食品营养成分分析
通过HPLC技术，可以对食品中的蛋白质、脂肪、糖类等营养成分进行分离和定量，评估 食品的营养价值。
食品中有害物质检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的农药残留、重金属、生物毒素等有害物质，保障人们 的饮食安全。
流动相选择
根据目标化合物的极性和色谱柱的性质选择合适 的流动相，如甲醇、乙腈、水等，以及合适的流 动相比例和梯度洗脱程序。
色谱条件优化
通过调整流动相比例、流速、柱温等参数，优化 色谱分离效果，提高目标化合物的分辨率和峰形 。
检测方法确定
检测器选择
根据目标化合物的性质选择合适的检测器， 如紫外检测器、荧光检测器、蒸发光散射检 测器等。
合物充分溶解。
样品净化
02
通过固相萃取、液液萃取等方法去除干扰物质，提高目标化合
物的分离效果。
样品浓缩
03
采用蒸发、旋转蒸发等方法将提取液浓缩至合适体积，便于后
续进样分析。
色谱条件选择
1 2 3
色谱柱选择
根据目标化合物的性质选择合适的色谱柱，如 C18、C8、硅胶等，确保目标化合物在色谱柱上 有良好的保留和分离效果。
06
HPLC分析方法的挑战 与展望
复杂样品分析挑战
样品前处理
对于复杂样品，如生物样品或环境样品，需要进行繁琐的 样品前处理步骤，如提取、净化、浓缩等，以消除干扰物 质并提高目标化合物的检测灵敏度。
分离效果
复杂样品中往往存在多种化合物，其理化性质相近，难以 在HPLC分析中实现有效分离，导致分析结果不准确。
hplc 方法开发流程
hplc 方法开发流程HPLC方法开发流程HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析方法，广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域。
开发一个有效的HPLC方法是保证分析准确性和可靠性的关键步骤。
本文将介绍HPLC方法开发的基本流程。
第一步是确定分析目标。
在开发HPLC方法之前，需要明确要分析的目标物是什么。
这可能是一种药物成分、环境中的某种化合物或食品中的营养成分等。
确定目标物的性质和特征对于后续的方法开发至关重要。
第二步是选择适当的色谱柱。
根据目标物的性质，选择合适的色谱柱是至关重要的。
常见的色谱柱有反相柱、正相柱、离子交换柱等。
选择合适的色谱柱可以提高分离效果和分析速度。
第三步是优化流动相。
流动相的组成对于HPLC分离的效果有很大影响。
在这一步中，需要选择合适的溶剂和添加剂，并优化它们的浓度和比例。
同时，还要考虑流动相的pH值，以保证分析目标物在色谱柱上有良好的保留和分离效果。
第四步是确定最佳的进样条件。
进样是样品在HPLC中进行分析的重要步骤。
确定最佳的进样条件可以提高分析的准确性和灵敏度。
在这一步中，需要考虑进样体积、进样方式和进样速度等因素。
第五步是优化检测条件。
检测器是HPLC中的关键设备，能够提供分析目标物的信号。
在这一步中，需要优化检测器的参数，如波长、灵敏度和线性范围等。
同时，还需要选择合适的检测器类型，如紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
第六步是验证方法的准确性和可靠性。
在开发HPLC方法之后，需要对其进行验证。
验证方法包括评估方法的线性范围、灵敏度、精密度和准确度等。
通过验证可以确保方法的可靠性和可重复性。
最后一步是编写分析方法报告。
在完成HPLC方法开发和验证后，需要撰写详细的分析方法报告。
报告应包括分析目标、色谱条件、进样条件、检测条件以及方法的准确性和可靠性验证结果。
报告的编写应遵循科学的逻辑和规范，以便他人能够复制和验证该方法。
总结起来，HPLC方法开发流程包括确定分析目标、选择适当的色谱柱、优化流动相、确定最佳的进样条件、优化检测条件、验证方法的准确性和可靠性以及编写分析方法报告。
液相及液质分析方法学的开发及验证
液相及液质分析方法学的开发及验证液相及液质分析方法学的开发及验证是化学分析领域中非常重要的研究内容。
液相分析方法学主要研究如何选择适当的试剂、溶剂、分析柱等条件，使样品溶解、分离、测定和定量变得更加准确、灵敏和可靠。
液质分析方法学则是在液相分析方法学的基础上，通过耦联质谱等仪器进行检测和分析，可以获得更高灵敏度和更好的特异性。
液相及液质分析方法学的开发和验证通常需要以下的步骤和方法。
首先，基于需求和目标，确定研究对象和分析目标。
确定所需分析的化合物或成分，并有清晰的分析目标，比如检测限、灵敏度、准确度等，以指导后续研究。
其次，选择合适的试剂和溶剂。
根据被测样品的性质和分析目标，选择合适的试剂和溶剂，以提高分析的准确性和灵敏度。
试剂应具有高纯度和稳定性，以确保试剂本身不会引入干扰物质。
溶剂的选择要考虑溶解能力、流动性以及对仪器的兼容性。
然后，进行样品制备和前处理。
根据被测样品的性质和分析目标，选择合适的样品前处理方法，如液液萃取、固相萃取等，以提高分析样品的纯度和准确性。
样品前处理的步骤要具有高效性、选择性和稳定性，以确保获得准确的分析结果。
接下来，选择合适的分析仪器和方法。
根据分析目标和样品性质，选择适合的分析仪器和方法，如高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、质谱等。
根据仪器的参数和分析方法的要求，进行合理的调整和优化，以获得最佳的分析条件。
在开发出一套满足分析要求的方法后，需要进行验证。
验证的目的是评估方法的可靠性和适用性。
验证通常包括准确度、精密度、选择性、线性范围、检测限等方面的评估。
通过在不同条件下进行重复性试验，并进行统计分析，评估方法的精准性和可重复性。
同时，通过对样品添加不同浓度的目标物质或干扰物质进行检测，评估方法的选择性和准确度。
此外，还需要进行方法的稳定性和恢复率等评估。
最后，将开发和验证的方法应用于实际样品的分析。
根据实际的需求和样品的性质，进行实际样品的分析。
在实际分析中，要注意方法的适应性和准确性，并进行合理的质量控制措施，以确保获得可靠、准确的分析结果。
HPLC仪器验证方案
HPLC仪器验证方案HPLC（高效液相色谱）仪器验证是确保仪器正常运行和产生可靠结果的重要步骤。
以下是一个1200字以上的HPLC仪器验证方案，包括设备验证、性能验证和方法验证。
一、设备验证设备验证是验证HPLC仪器的各个组成部分和设备参数是否符合规定要求的过程。
以下是设备验证的主要内容：1.仪器校准：校准仪器的参数（如流速、温度、压力）并与参考值进行比较，以确保精确度和准确性。
2.设备清洁和维护：定期清洁仪器的各个部件，如针尖、柱头和流动通道，以确保仪器正常运行和消除污染的风险。
3.电源和地线：检查电源接头和插头是否正常连接，并确保地线连接良好，以避免电气故障和触电风险。
4.仪器参数设置：根据标准和方法要求，设置仪器的参数，如波长、检测器灵敏度和积分时间等，以确保仪器能够正确执行分析过程。
5.故障检测和保护：测试仪器的自动诊断和保护功能，如温度过高、压力异常和泄漏等故障的检测和报警系统，以及自动停止流程和保护仪器。
二、性能验证性能验证是验证HPLC仪器的参数和性能是否符合规定要求的过程。
以下是性能验证的主要内容：1.流速准确性：使用标准物质，验证仪器的流速准确性，测量仪器的流速与参考值之间的偏差。
2.重复性和精密度：通过多次重复测量相同样品，并计算测量结果的变异系数以验证仪器的重复性和精密度。
3.检测限和线性范围：使用标准物质，测量仪器的检测限和线性范围，并与规定要求进行比较。
4.分离度：使用混合物标准物质，检验仪器的分离度和分辨率，并与规定要求进行比较。
5.峰对称性：使用对称性标准物质，检验仪器的峰对称性，并与规定要求进行比较。
三、方法验证方法验证是验证HPLC仪器的分析方法是否能够正确、准确和可靠地分析样品。
以下是方法验证的主要内容：1.选择合适的标准物质：选择能够准确、快速和可靠地分析样品的标准物质，并制定合适的样品前处理方法。
2.优化分析方法：通过调整仪器参数和条件，优化分析方法，使得样品能够在较短的时间内获得准确的结果。
hplc方法学开发和验证 -回复
hplc方法学开发和验证-回复HPLC方法学开发和验证是化学分析领域中常用的技术之一。
HPLC（高效液相色谱）是一种基于液相色谱原理的分析方法，其通过流动相的流动速度和静相的特性分离和测定复杂混合物中的化合物。
在本文中，我们将一步步回答关于HPLC方法学开发和验证的问题。
第一步：方法开发在HPLC方法开发的初期，首先需要明确分析目标和要求。
我们需要确定所要分析的样品类型、目标化合物的特征，并制定分析目标和要求。
例如，我们可能需要确定目标化合物的浓度范围、分离度要求、分离时间和检测灵敏度等。
第二步：样品预处理在样品进入HPLC仪器之前，通常需要进行某些预处理步骤。
这些步骤可以包括样品提取、样品净化、样品稀释等。
这些预处理步骤可以帮助去除干扰物、提高分离效果和检测灵敏度。
第三步：柱的选择选择合适的柱是成功分析的重要因素。
柱的选择应该根据目标化合物的特性、分析目标和样品类型来进行。
一般来说，柱的选择应该包括柱材料、柱尺寸、柱填料和柱温等方面。
第四步：流动相的选择流动相的选择是HPLC方法开发中的关键步骤之一。
在选择流动相时，我们需要考虑目标化合物的极性、溶解度、分离度要求和分离时间等方面。
通常，流动相是由溶剂和缓冲剂等组成的混合物。
第五步：分离条件的优化优化分离条件是使分析目标物分离出来的关键。
在此过程中，我们可以调整流速、温度、柱温、流动相浓度梯度等参数，以获得更好的分离效果。
同时，还可以通过试验不同的柱和流动相组合来优化分离条件。
第六步：检测方法的选择和优化在HPLC方法开发中，检测方法的选择和优化也是重要的一步。
常用的检测方法包括紫外光吸收检测器、荧光检测器和质谱检测器等。
根据目标化合物的特性和分析目标，选择合适的检测方法，并进行方法的优化，以提高检测灵敏度和选择性。
第七步：方法验证在方法开发完成后，需要对方法进行验证。
方法验证的目的是确保方法的可靠性、准确性和精密度。
常用的验证参数包括线性范围、准确度、重复性、选择性和灵敏度等。
HPLC测定有关物质和含量方法验证解析
HPLC测定有关物质和含量方法验证解析HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的分析技术，在药品分析、环境监测、食品安全等领域有着广泛的应用。
在HPLC测定有关物质和含量方法验证解析中，可以从方法验证的目的、内容和步骤等方面展开。
方法验证的目的主要是验证所采用的分析方法是否可靠、精确、准确且具有可重复性，以保证在日常分析中的可靠性和可应用性。
方法验证的内容包括系统适用性、灵敏度、线性度、准确度、精密度、稳定性等，可以通过一系列实验和分析来进行验证。
方法验证的步骤一般包括以下几个方面：1.系统适用性验证：通过对样品的系统性能参数进行验证，包括压力、回峰时间、分离度和理论板数等。
通过调整仪器条件和操作参数，使得方法能够恰当地适用于所测定的物质。
2.灵敏度验证：通过测定不同浓度的标准品，确定方法的最小测定限和最小检测限。
灵敏度的验证可以通过信噪比、回归方程等指标进行评估。
3.线性度验证：通过测定一系列浓度已知的标准品，绘制浓度与峰面积或峰高的线性关系图，确认方法的线性范围和相关系数。
4.准确度验证：通过加标回收实验，比较样品中已知添加量与实际回收量的差异，评估方法的准确度。
5.精密度验证：通过同一样品的多次测定，计算相对标准偏差（RSD）来评估方法的精密度。
6.稳定性验证：通过不同储存条件下样品的测定，包括短期和长期稳定性试验，评估方法的稳定性。
在方法验证的解析中，需要对上述步骤进行详细的数据处理和结果分析。
对于系统适用性验证，需要报告各项系统性能参数的测试结果，并说明是否符合要求；对于灵敏度验证，需要计算最小测定限和最小检测限，并评价方法的灵敏度；对于线性度验证，需要绘制线性关系图，并计算回归方程的相关系数；对于准确度和精密度验证，需要计算回收率和相对标准偏差，并进行统计学分析；对于稳定性验证，需要比较不同条件下测定结果的差异。
此外，在HPLC测定有关物质和含量方法验证解析中还需要注意的是，要同步验证色谱柱的适用性、短柱、长柱分析的差异，以及可能的干扰和修正因子等因素。
液相色谱仪HPLC分析方法验证 液相色谱解决方案
液相色谱仪HPLC分析方法验证液相色谱解决方案为了保证分析检测结果精准、牢靠，必需对所接受的分析方法的精准性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。
从本质上讲，方法验证就是依据检测项目的要求，预先设置确定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所接受的分析方法符合检测项目的要求。
方法验证在质量掌控上有紧要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是订立质量标准的基础。
方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、精准度、精密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不尽相同。
1.专属性专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为选择性。
对于纯度检测，可在标准品中加入产品中的已知杂质，或者直接用粗品，考察产品峰是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪，可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。
必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。
一般要求产品和杂质之间的分别度大于2.0、2.线性线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原材料或产品的浓度呈线性关系的程度。
线性是定量检测的基础，需要定量检测的项目都需要验证线性。
一般用储备液经过精密稀释，或分别精密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5个以上），按浓度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用zui小二乘法进行线性回归计算，考察分析方法的线性。
3.范围范围指在能够达到确定的精准度、精密度和线性时，样品中被分析物的浓度区间。
简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度zui大值和zui小值。
需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80%～120%。
4.精准度精准度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做真实度，需要定量得分析方法均需要验证精准度。
精准度应在规定的范围内建立，对于原材料药可用已知纯度的标准品或符合要求的原材料药进行测定，必要时可与另一个已建立精准度的方法比较结果。
HPLC有关物质分析方法验证
HPLC有关物质分析方法验证HPLC（高效液相色谱法）是一种常用的物质分析方法，它通过溶剂在高压推动下通过色谱柱，实现溶剂和待测物分离的过程。
在物质分析中，验证方法的准确性和可靠性非常重要，下面将对HPLC的物质分析方法验证进行介绍。
物质分析方法验证是确保分析方法正确、可靠、准确和重现性的一系列测试和验证过程。
验证的目的在于确定HPLC方法是否能够满足所需的性能要求和质量标准。
在验证过程中，需要关注方法特异性、灵敏度、线性范围、准确性、重现性、稳定性和健全性等因素。
物质分析方法验证的步骤包括：方法开发、选择代表性样品、确定方法的性能参数和特性、验证方法的准确性和可靠性，并最后进行验证报告的编写。
首先，在方法开发阶段，需要确定待测物及其可能的成分、样品基质、分离柱、检测器和溶剂等。
在选择样品时，应确保样品代表性和可再现性，包括质量、纯度、同质性和稳定性等方面。
选择合适的分离柱和检测器也是至关重要的，它们应具有足够的分离效能和灵敏度，能够满足该分析方法要求。
其次，确定方法的性能参数和特性是验证的关键步骤。
对于HPLC方法，常见的性能参数包括特异性、灵敏度、线性范围、准确性、重现性、稳定性和健全性。
特异性是指方法对待测物能够进行准确、可靠、细致的分离和测定，不受其他成分的干扰。
灵敏度是指方法能够检测和量化的待测物的最小浓度，通常使用限量、定量限和峰高度等参数进行评估。
线性范围是指方法的测量范围，包括线性关系和线性回归方程的斜率和截距。
准确性是方法测定结果与真实值之间的一致性，常用于确定分析方法仪器的准确性。
重现性是指方法在不同条件下重复测定的结果的一致性，包括仪器重复性、操作员重复性和时间重复性。
稳定性是指方法能够保持一段时间内相对稳定的分离和测定效果。
健全性是指方法的可操作性和稳定性，包括方法的容错性、反应条件的合理性和降低人为误差的措施。
最后，进行方法验证。
在验证过程中，应按照一定的计划和流程进行，包括仪器和预处理方法的验证、分离和检测方法的验证、准确性和可靠性的验证以及整体性的验证。
HPLC验证方案
HPLC验证方案HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析测试技术，广泛应用于各个行业，包括制药、化工、环境监测、食品安全等领域。
为了确保HPLC的可靠性和准确性，需要进行验证实验。
1.仪器验证：验证仪器的性能是否符合要求。
包括泵的流量准确性、进样系统的精密度和准确性、检测器的灵敏度和线性度等方面。
可以使用标准样品进行验证，比较测试结果与标准结果的偏差。
2.HPLC柱验证：验证柱的性能是否符合要求。
柱的选择对于HPLC分析测试非常重要，柱的质量直接影响分析结果的准确性和重复性。
柱验证可以通过一系列的测试来完成，比如测试分离效果、压力、回收率等指标。
3.方法验证：验证分析方法的准确性和可靠性。
分析方法验证是确保分析结果的准确性和可靠性的重要环节。
常用的方法验证包括线性性、准确性、精密度、重复性、特异性、检出限和定量限等。
4.校准曲线的建立：建立标准曲线，用于定量分析未知样品。
标准曲线是通过一系列已知浓度的标准溶液测定其响应后得到的，可以用于测定未知样品的浓度。
5.系统适用性：检验该分析方法对所需测定物质的准确性和可靠性。
可以进行类似方法验证的测试，比如线性性、准确性、精密度等。
6.选择合适的峰区和背景区：峰区应选在不邻近拐点和峰尾上升区域，以避免与其他成分重叠；背景区应选在物质浓度较低处，以避免与干扰物质重叠。
以上是HPLC验证方案的主要内容，具体实施时需要根据实际情况进行调整。
验证实验的结果应进行分析和总结，确保验证结果的可靠性和准确性。
并且，验证实验应定期进行，以便及时发现和解决问题，确保测试的可靠性和准确性。
HPLC验证方案
HPLC验证方案HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分离和分析技术，广泛应用于药品、化妆品、食品、环境监测和生物制药等领域。
HPLC验证方案是为了确保仪器设备和方法的准确性和可靠性，提高数据的可信度，从而得出准确的分析结果。
本文将介绍一种基本的HPLC验证方案，包括设备验证和方法验证。
设备验证设备验证是指对HPLC仪器设备进行全面的测试和验证，以确定其性能是否符合要求。
设备验证的主要目的是检验仪器设备是否正常工作，能够产生准确和可靠的分析结果。
设备验证包括以下几个方面的内容：1.设备检查：包括检查仪器设备的外观、标志和附件是否完好；检查电源、气源和冷却系统是否正常工作；检查阀门、泵、控制器、检测器等部件是否正常工作。
2.温度控制验证：对于具有温度控制功能的HPLC仪器，需要验证温度控制的准确性和稳定性。
可以使用温度控制仪器或温度传感器对仪器设备进行温度校准和稳定性测试。
3.流量精度验证：对于流量控制系统，需要验证其流量范围和流量精度是否符合要求。
可以使用标准流量计或标准溶液对流量进行校准和验证。
4.压力验证：对于压力传感器和控制系统，需要验证其准确性和稳定性。
可以使用标准压力表或标准溶液对压力进行校准和验证。
5.检测器验证：对于检测器，需要验证其灵敏度、线性范围和选择性。
可以使用标准溶液对检测器进行校准和验证，以确定其性能是否符合要求。
方法验证方法验证是指对HPLC分析方法进行验证，以确定其准确性、可靠性和适用性。
方法验证的主要目的是检验分析方法是否能够得到准确和可靠的分析结果。
方法验证包括以下几个方面的内容：1.选择适当的基质和样品：根据待分析物的特性和分析目的，选择适当的基质和样品。
基质应具有与待分析物相似的特性，样品应真实代表待分析物的特性。
2.方法准备：准备HPLC分析方法，并确定分析参数，如流速、柱温、检测波长等。
确保方法能够有效分离目标物和干扰物，同时满足分析的准确性和灵敏度要求。
3.溶液准备：根据待分析物的特性和分析方法的要求，准备标准溶液和样品。
HPLC有关物质分析方法验证
数据要求：需报告平均值，RSD。
6、精密性
• 报告数据：
• 1、回收率、 • 2、平均回收率、 • 3、RSD
• 评价：
• 1、回收率应为90%~110% • 2、RSD不得不小于10%
7、溶液稳定性
• 供试溶液与对照溶液分别放在室温和冷 藏下保存，分别在不同步间测定HPLC
RSD S 100% x
6、精密性
1. 反复性:
A、在相同条件下，由同一种分析人员测定所得成果旳精密度； 在要求旳范围内，至少用9次测定成果评价，如制备三个不同 浓度样品各测三次或 （回收率法） B、把被测物浓度看成100%，至少测6次进行评价。 （样品测定法）
6、精密性
2. 中间精密度 同一试验室，不同步间 由不同分析人员用不同设备所得成果旳精密 度。
如不能测得杂质旳相对响应因子，可在线测定杂 质旳有关数据，如采用二极管阵列检测器测定紫外光 谱，当杂质旳光谱与主成份旳光谱相同，则可采用原 料药旳响应因子近似计算杂质含量（本身对照法）。
5、响应因子
已知杂质相对与主成份在HPLC上旳响应比值
计算措施：
(1)可直接用主成份对照品及杂质对照品进行测定。
2、敏捷度
LOD试验措施
•空白溶剂 •系统合用性溶液5针 •杂质对照品溶液进1针 •根据上一针杂质对照品旳S/N值进行稀释进样 •直到S/N为约3时，平行进样3针。 •系统合用性溶液1针 •图谱打印： •杂质对照溶液及其稀释液均要以performance+noise格式打印。 系统合用必至少有一针用extend performance格式打印
1、专属性 报告数据：
液相色谱方法的开发
液相色谱方法的开发
液相色谱（HPLC）方法的开发通常包括以下几个步骤：
1. 选择合适的色谱柱：根据分析样品的性质和目标成分，选择合适的色谱柱，包括填充物和柱尺寸。
填充物的选择通常考虑分离效果、保留度、选择性等因素。
2. 优化流动相组成：根据样品的特性以及目标成分的极性、溶解度等因素，优化流动相组成，包括溶剂选择、添加剂和缓冲剂的使用等。
通过试错法和理论分析方法，确定最佳的流动相组合。
3. 确定色谱条件：包括进样量、流速、检测波长等。
进样量通常根据分析样品的浓度和柱容量进行确定。
流速的选择与分离效果、分析时间和柱压有关。
检测波长通常根据目标成分的最大吸收波长或最大荧光波长进行选择。
4. 方法验证：对开发的HPLC方法进行验证，包括精密度、线性范围、准确度、重复性、选择性等指标的测定。
此外，还需要进行仪器的精度、重复性和稳定性测试。
5. 方法应用：将开发的HPLC方法应用于实际样品的分析，验证其准确性和可靠性。
在开发HPLC方法的过程中，需要充分考虑样品的特性、目标成分的分离和检测要求，并进行系统的实验设计和优化。
不同的样品和分析目标可能需要不同的方法开发策略，因此开发一个适合的HPLC方法需要一定的经验和专业知识。
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精密度是指在规定条件下，同一均匀样品经多次取样进行一系列检测所得结果之间 的接近程度。精密度一般用相对标准偏差表示，取样检测次数应至少6次。 精密度可以从三个层次考察：重复性、中间精密度、重现性。 a、重复性是在相同的操作条件下、较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结 果的精密度。一般是用100％浓度水平的样品测定6次的结果进行评价。 b、中间精密度：同一实验室，在日期、分析人员、仪器等内部条件改变时，测定 结果的精密度。 c、重现性：指不同实验室之间不同分析人员测定结果的精密度。
有时需要对分析方法进行全面或部分的再验证。当原料药合成工艺发生改变时，可 能引入新的杂质，杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证，以证 明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成份的含量测定 应无干扰。当分析方法发生部分改变时，如检测波长发生改变，则需要重新进行检 测限、专属性、准确度、精密度、线性等内容的验证，以证明改变后的分析方法的 合理性、可行性。
• 在缓冲盐做流动相时，出峰太早、峰形很差、相似结构的化合物峰因为拖 尾或峰型太宽而不能达到基线分离时，可以考虑使用离子对试剂，常用的 离子对试剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐，但是流动相里使用离子 对试剂时，系统需要的平衡时间长，样品保留时间不是很稳定，因为离子 对试剂的背景吸收基线会很差，且做完样品后需要长时间清洗，所以我们 尽量不使用离子对试剂。 使用缓冲盐时要注意流动相混合以后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致 基线漂移严重的问题，可以考虑在乙腈里加入10%的水，水中预先加入10 倍水溶液浓度的缓冲盐，这样梯度中A、B两项盐的浓度相同，可以避免基 线漂移严重的问题。 原料药一般结构式比较大，分子构成比较复杂，开发分析方法时用水加磷 酸效果可能效果不好，通常还要求最少尝试2和6.5两个pH值的磷酸盐缓冲 溶液，并依据结果对流动相进行pH优化，如效果不理想再进一步尝试其它 缓冲盐溶液。开发中间体或者IPC的分析方法时可以根据经验酌情简化流动 相的选择过程。
离子交换树脂的分离机理
离子交换色谱概述
• 适用于离子型化合物的分离
• 分离基于离子的带电特性
• 洗脱次序受多种因素的影响
– 填料（离子交换树脂）的种类∶阴/阳，强/弱，交换基团
– 样品分子特性 – 盐的种类、浓度 – 温度及pH值
S P C S P C t S P
9.系统适用性试验
液相色谱分析方法主要依赖高效液相色谱仪和色谱柱，在做方法验证时，有必要将 高效液相色谱仪、色谱柱、流动相与实验操作、待测样品等一起当作完整的系统进 行评估，并将系统适用性作为分析方法的组成部分，系统适用性便是对整个系统进 行评估的指标。一般系统适应性的要求为：分析方法能够达到0.05%的检出限，主 峰的拖尾因子0.5<Tf<2.5，主峰与杂质的分离度大于2.0，空白干净，主峰处无系 统峰干扰。
7a 回收纯化物质
7b 定量校正
7c 定性方法
8 方法论证进入常规实验室
流动相的选择
有机相：
常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈：
甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生 反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏 度；
乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很 少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截 止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂 质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有 时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的选 择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。
2.线性
线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原料或产品的浓度呈线性关系的程度。 线性是定量检测的基础，需要定量检测的项目都需要验证线性。一般用贮备液经过 精密稀释，或分别精密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5个以上），按浓 度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归计 算，考察分析方法的线性。
1 了解样品的有关情况，明确分析目的 2 是否需要样品预处理，是否有特殊的步骤
3 选择仪器类型，确定检测器及其参数
4 选择液相色谱分离类型，色谱柱，流动相，其他相关条件（如波长等），进行预实验，估计最佳条件
5 优化分离条件，选择最佳检测器参数、色谱柱、流动相比例等
6 检查出现的各种现象和问题(包括仪器、样品稳定性等）选择解决办法和特殊步骤
• 分离基于样品的极性差异。 • 洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱 • 常用的流动相∶
– 非极性有机溶剂，如己烷 – 乙酸等为添加剂
• 常用固定相∶
– 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。
分配色谱的分离机理
分配色谱概述
• 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 • 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 • 常用的流动相：
水溶液中添加0.1%（体积）的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左 右，用作流动相正好抑制硅羟基的活性，所以开发液相分析方法时 流动相首选水加0.1%的磷酸，然后再以此为基础做优化。 在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是 ：简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调pH值时要有相应的 酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，再有就是醋 酸盐，常用的盐浓度在10~20mM左右。流动相里有时会需要调节 pH值到碱性，具体pH要视色谱柱的耐受范围而定。
分析方法验证
分析方法验证 方法验证，说白了就是对方法进行一次全身体检
为了保证分析检测结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的准确 性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要 求，这就是分析方法验证。
方法验证在质量控制上有重要的作用和意义，只有经过验证的分析方 法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是制订质量标准的基础。 方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检 出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不 尽相同。
波长的选择
首先考虑流动相的截止波长：甲醇截止波长为205nm;乙腈截止波长为190 nm;一般而言,大于上述波长都可以,但有时候为了保证灵敏度,高于20nm。 对于中间体或终产品液相方法中波长选择一般是将杂质和目标产物混合到 仪器进样，采用DAD全波段扫描，对比杂质及目标产物光谱吸收曲线，尽 量在目标产物最大吸收附近兼顾杂质吸收，得出最优吸收波长，当一些杂质 与主峰或其他几个杂质吸收差异比较大时考虑使用双波长检测法。
6.检出限
检出限是指样品中的被分析物能够被检测到的最低量，不需要准确定量。检出限体 现了分析方法的灵敏度。检出限的测定可以通过对一系列已知浓度被测物的试样进 行检测，以能准确、可靠检出被测物的最小浓度来确定，也可把已知浓度样品的信 号与噪声信号进行比较，以信噪比为3：1时的浓度确定检出限，一般要求能够达到 进样浓度的0.05%。
– 有机溶剂
S 样 品 P 填 料
分析方法开发
选HPLC参数时的基本考虑
• 溶解度 - 选择流动相的条件 • 分子量 - 在样品预处理时有用 • 官能团 - 有否离子化基团 保留特性如何 • 检测特性 - 有否紫外吸收 荧光 • 找出样品中不同组份之间的差异
– 摸索条件的重要线索
HPLC方法建立的步骤
磷酸盐pK2
7.2
羟甲基甲胺 8.3
氨
9.2
硼酸盐
9.2
甘氨酸Байду номын сангаас
9.8
1-甲基-哌啶 10.3
四氢化吡咯 10.5
二乙胺
10.5
三乙胺
10.7
磷酸盐pK3
12.3
pH范围
1.1~3.1 2.1~4.1 2.8~ 4.8 3.7~5.7 3.8~5.8 4.4~6.4 6.2~8.2 7.3~9.3 8.2~10.2 8.2~10.2 8.8~10.8 9.3~11.3 9.5~11.5 9.5~11.5 9.7~11.7 11.3~13.3
1.专属性
专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为选择性。对于纯度检测 ，可在标准品中加入产品中的已知杂质，或者直接用粗品，考察产品峰是否受到杂 质的干扰，对于过程跟踪，可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。必要 时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。一般要求产品和杂 质之间的分离度大于2.0。
3.范围
范围指在能够达到一定的准确度、精密度和线性时，样品中被分析物的浓度区间。 简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度最大值和最小值。需要定 量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80％ ～120％。
4.准确度
准确度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做真实度，需要定量得 分析方法均需要验证准确度。准确度应在规定的范围内建立，对于原料药可用已知 纯度的标准品或符合要求的原料药进行测定，必要时可与另一个已建立准确度的方 法比较结果。
液相柱---保留值与pH的关系
方法稳定区
中性组份 酸性组份
方法波动区(pKa+1.5)
方法稳定区
碱性组份
反相HPLC常用缓冲液
pH < 2.5
磷酸 0.1% 三氟乙酸 0.1%
缓冲液
pKa
磷酸盐pK1
2.1
柠檬酸盐pK1 3.1
甲酸盐
3.8
柠檬酸盐pK2 4.7
乙酸盐
4.8
柠檬酸盐pK3 5.4
水相：
对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加 盐，从而改善峰形、提高分离度。
流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三 氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸 和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长 下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长 下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，而 做液质就要考虑首选三氟乙酸了。