生化技术复习资料

生化制备概论

一制备主要对象及特点

蛋白质：易降解易变性多样性多种因素影响活性

核酸：分子量大，易被机械切割力破坏（基因组DNA）易降解（酶解）特别是RNA 常与核蛋白质结合

多糖：成分复杂多样，分析困难，糖苷同样也会被多种酶降解

脂类：种类多，成分复杂，分析仪器要求较高

二物质的提取与缓冲溶液

针对蛋白质的操作一般要注意的问题：

基本原则：防止生物分子变性、降解

1．控制适当的pH

2．控制低温

3．注意提取过程中的溶液环境

4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基

1 低温0~4度。

2 缓冲溶液提取操作，适度的离子(盐)浓度。

3加保护剂\酶抑制剂，如巯基乙醇、DTT,，Vc,PVP,重金属络合剂，酶的底物蛋白酶抑制剂等等

4操作连续，尽量快速。

5 避免剧烈搅拌。

蛋白质的溶液提取（抽提）

水溶液提取：

大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。

稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大，是提取蛋白质的最常用溶剂。

盐浓度

等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L 磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。

0.15mol/L 氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L 碳酸氢钠

液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合，也

常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低，如

脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L 以上氯化钠液提取PH 值：

蛋白质提取液的PH 值首先应保证在蛋白质稳定的范围内，即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧，酸性蛋白质选择偏碱一侧，以增大蛋白质的溶解度，提高提取效果

●细胞破粹方法：1、高速组织捣碎：将材料剪小，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，

将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等

●2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移

动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

●3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此

法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100 毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量

的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感物质和核酸应慎用。

●4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒

形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去

氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

6渗透冲击：用蒸馏水冲击细胞或经过高渗液处理（平衡）过的细胞，让细胞内容物释放出来

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入对苯甲基磺酰氟（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部。

表面活性剂的利用：

对于某些与脂质结合的蛋白质和酶，也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（Triton X-100 、NP-40等）、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。非离子型表面活性剂比离子型温和，不易引起酶失活，使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构，己广泛采用胆酸盐处理，两者形成复合物，并带上净电荷，由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时，较喜欢用非离子型表面活性剂。

膜蛋白提取注意事项常用去垢剂：SDS Tween 20 40 …Triton X-100 CHAPS

三蛋白质的基本操作

盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析

分段盐析，有机溶液沉淀

目的纯化浓缩保存

注意事项

影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%

。应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

样品保存

●溶液状态冷藏保、冷冻保存、液氮保存

●干粉状态真空干燥、喷雾干燥、冰冻干燥、脱脂样品、丙酮干粉

蛋白质含量的测定

变性不溶解蛋白质凯氏定氮法“可溶”蛋白质（蛋白质溶液）

1 双缩脲法（Biuret assay）

2 劳里反应（Lowry assay）Folin-酚法

3 巴福得测定法（Bradford assay ）标准曲线

4 UV(紫外分光光度)法

●Absorbance assays

●Absorbance at 280 nm

–Range: 20 micrograms to 3 mg

–Volume: Depends on cuvette - volumes range from 200 microliters to 3 ml or greater

–Accuracy: Fair

–Convenience: Excellent, if equipment available

–Major interfering agents: Detergents, nucleic acids, particulates, lipid droplets

●Absorbance at 205 nm

–Range: Roughly 1 to 100 micrograms

–Volume: Depends on cuvette - volumes range from 200 microliters to 3 ml or greater

–Accuracy: Fair

–Convenience: Very good

–Major interfering agents: Detergents, nucleic acids, particulates, lipid droplets

●Colorimetric assays

●Modified Lowry

–Range: 2 to 100 micrograms

–Volume: 1 ml (scale up for larger cuvettes)

–Accuracy: Good