蛋白质测定的主要原理、方法及三聚氰胺的检测方法
三聚氰胺检测方法
三聚氰胺检测方法三聚氰胺（Melamine）是一种有机化合物，常用于合成树脂、塑料和樹脂胶合板等产品。
然而，三聚氰胺被发现存在食品中，由于其高氮含量，有些不法商家为了提高奶粉等食品的蛋白质含量，将三聚氰胺掺入产品中，导致大量食品安全问题。
为了及时准确地检测食品中的三聚氰胺，许多研究机构和实验室开发了各种检测和分析方法。
本文将介绍几种常见的三聚氰胺检测方法。
一、高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）高效液相色谱法是目前最常用的三聚氰胺检测方法之一、该方法基于样品中三聚氰胺在流动相（溶剂）中的溶解度和与固相（填料）相互作用，通过分离并检测样品中的三聚氰胺。
使用该方法，可以快速、准确地检测食品中的三聚氰胺含量，并得到可靠的结果。
然而，由于设备和试剂的成本较高，需要专业的技术人员进行操作和维护，因此在实际应用中可能存在一定的限制。
二、质谱法（Mass Spectrometry，MS）质谱法是通过将样品中的三聚氰胺分解成离子，并通过质谱仪测定离子的质荷比，来分析和检测样品中的三聚氰胺。
该方法具有高灵敏度、高选择性和准确度的优点。
质谱法可以与液相色谱法（LC-MS）或气相色谱法（GC-MS）等技术相结合，提高检测效果和检测速度。
质谱法需要高精密度的设备和样品处理步骤，因此需要专业的技术人员进行操作。
三、免疫学分析方法免疫学分析方法是利用抗体和抗原之间的特异性结合来检测三聚氰胺。
通过将样品中的三聚氰胺与抗体结合，然后使用标记有酶、放射性同位素或其他检测物质的二抗来检测特异性结合的抗原-抗体复合物，从而达到检测三聚氰胺的目的。
该方法具有简单、快速和灵敏的优点，被广泛应用于三聚氰胺检测，特别适合大批量样品的筛查。
然而，免疫学分析方法也存在一定的局限性，例如可能受到其他物质的干扰，准确性和特异性可能较低。
除了上述常见的方法外，还有一些新型的三聚氰胺检测方法，如表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）、纳米材料的应用、电化学法等。
饲料中真蛋白检测
蛋白质的检测方法多于17种。
目前主流、常用的蛋白质检测方法有三种：凯氏定氮法、杜马斯燃烧法等，这些方法均有不同标准予以支撑。
然而2008年，三聚氰胺事件的爆发，使现行的蛋白质检测方法多被诟病。
主要原因是凯氏定氮法和杜马斯燃烧法主要是检测氮元素的含量，然后乘以一定的系数，测算蛋白质的含量。
这种方法计算结果是粗蛋白的含量，不能排除非蛋白氮物质的影响，造成蛋白质含量虚高。
然而由于其低成本，以及检测方法成熟等特点，仍在被广泛使用。
GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法
原理：样品消解转化成氨气被吸收，然后滴定测定出总氮元素含量，最后转化成蛋白质含量。
GB/T24318-2009杜马斯燃烧法
原理：样品经完全燃烧后转变为氮气，后经测定出总氮含量后转化为蛋白质含量。
GB/T18868-2002近红外测定法
原理：利用样品中蛋白质组分的特征红外吸收强度来测定蛋白质含量。
第 1 页 / 共 1 页。
蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理蛋白质是生物体内重要的基础结构和功能分子，其含量的测定对于生物学和医学研究具有重要意义。
目前常用的蛋白质含量测定方法主要包括生物化学法、生物物理法和免疫学法等。
下面将对这几种方法的原理进行详细介绍。
1. 生物化学法：生物化学法通过酶促反应或化学反应，将蛋白质转化成可以测定的可溶物或在一定条件下呈现特定吸光度的产物，从而测定蛋白质的含量。
常用的生物化学法有Lowry法、Bradford法和BCA法。
(1) Lowry法：Lowry法是1969年由Lowry等人开发的一种蛋白质定量方法。
该方法利用蛋白质与Folin-Ciocalteu试剂在碱性条件下发生氧化反应，生成具有最大吸收峰的蓝色产物，通过测定产物的光密度与一系列标准溶液进行比较，来确定蛋白质的含量。
(2) Bradford法：Bradford法是Bradford于1976年提出的一种测定蛋白质含量的方法。
该方法基于蛋白质与染料(Coomassie Brilliant Blue G-250)之间的特异结合，蛋白质和染料形成一个蛋白质-染料复合物，该复合物的吸光度变化与蛋白质的浓度呈正相关。
通过测定复合物的光密度与一系列标准溶液进行比较，来确定蛋白质的含量。
(3) BCA法：BCA法是一种在碱性条件下，将蛋白质还原成具有强吸收的蓝色离子的方法。
BCA试剂(含有琥珀酸铜II配合物和增强剂)能与蛋白质中的酸性氨基酸残基(尤其是含有两个以上连续胺基的肽键)发生氧化还原反应，生成具有强吸收的蓝色离子。
利用光密度测定产生的蓝色离子与一系列标准溶液进行比较，即可确定蛋白质的含量。
2. 生物物理法：生物物理法是通过光学原理，利用蛋白质溶液对光的吸收、散射或旋光等性质进行测定，来间接推算蛋白质的含量。
常用的生物物理法有紫外吸收光谱法、比色法和荧光法等。
(1) 紫外吸收光谱法：紫外吸收光谱法是通过蛋白质在紫外光区域的吸收特性来测定蛋白质的含量。
三聚氰胺检测方法
创新点
• 目前测定三聚氰胺 的方法已有高效液相法和气相-质谱法， 目前也有液相色谱-质谱法的报道。这些方法，存在试验需要衍 生、操 作繁琐、过程冗长、试剂用量较大及灵敏度低等缺 点。 本研究中采用萃取柱净化，离子色谱-电导法 和离子色谱-紫外法 分别检测化肥中阴离子和三聚 氰胺的含量，无需衍生，操作简单， 一次进样即可测 试多种离子，方法实用可靠，可满足化肥生产和 使用 安全检测的需要
流程
• 2.1色谱条件 离子色谱-电导检测器测阴离子 条件：SH-AP-1 阴离子色 谱柱（250 mm×4.0 mm）为 亲水性阴离子色谱柱；淋洗液为淋洗液 发生器产生 的高纯氢氧化钾溶液，梯度洗脱及浓度见表 1，流量 0.8 mL/min，进样量 25 μL，柱温和检测器池温均为 35 ℃，SHY-6型抑制 器，抑制电流 120 mA，系统压力 10.2 MPa。以保留时间定性，峰面 积定量。
特点
• (1）高压。检测中流动相由于是液体，经过色谱柱阻力较大。为了可 以顺利通过色谱柱，对载液要高压处理。
• （2）高效。实施分离过程的高效能。可以采用固定相与流 动相以保 证分离效果处于最佳，分离效能可以提高出许多倍。
• （3）高灵敏度。采用紫外检测器的应用，精度达到了0.01ng, 检测中 进样量可以达到μL数量级的精度。
• 4.2 提取溶液 对于 3 份加入了 1.0μg/g 三聚氰胺的样品依次用高氯酸 0.2mol/L（A 方法）、三氯乙酸 1%+乙腈（B 方法）、三氯乙酸 1% （依据标准 GB/T22388－2008）提取。根据三种试验结果表明， 回收 率依次为 71.5%，64.7% 和 99.3%。实验提取溶液使用 1% 三氯乙酸。
称取 7 g 三氯乙 酸，用超纯水定
三聚氰胺检测原理
三聚氰胺检测原理三聚氰胺（Melamine）是一种常用的化工原料，也被用作合成树脂和涂料的原料。
然而，由于其含氮量高、稳定性好和成本低廉的特点，三聚氰胺也被不法商家添加到食品中，以提高蛋白含量的假象，从而导致了一系列严重的食品安全问题。
因此，对食品中三聚氰胺的检测显得尤为重要。
三聚氰胺的检测原理主要是基于其与过氧化氢酶的催化反应。
过氧化氢酶是一种氧化酶，它能够催化过氧化氢的分解，生成氧气和水。
而三聚氰胺在碱性条件下与过氧化氢酶发生反应，生成氰尿酸和氨气。
通过检测氨气的生成量，就可以间接地确定样品中三聚氰胺的含量。
具体的检测步骤如下，首先，将待检样品与碱性溶液混合，使得样品中的三聚氰胺转化为氰尿酸和氨气。
然后，将过氧化氢酶加入混合液中，启动反应。
在反应过程中，氨气的产生量与样品中三聚氰胺的含量成正比。
最后，通过氨气传感器或其他相关仪器，测定氨气的含量，从而计算出样品中三聚氰胺的含量。
三聚氰胺检测原理的关键在于通过化学反应将三聚氰胺转化为氨气，从而间接地测定其含量。
这种方法不仅简单、快速，而且灵敏度高，可以满足对三聚氰胺含量的准确测定需求。
在实际的食品安全监测中，三聚氰胺的检测原理被广泛应用。
通过建立标准曲线，可以准确地测定食品样品中的三聚氰胺含量，从而保障食品安全。
此外，该方法还可以应用于其他领域，如环境监测和医药领域，具有广泛的应用前景。
总的来说，三聚氰胺的检测原理是基于其与过氧化氢酶的催化反应，通过测定氨气的产生量来间接测定样品中三聚氰胺的含量。
这种方法简单、快速、灵敏度高，被广泛应用于食品安全监测和其他领域。
通过对三聚氰胺检测原理的深入了解，可以更好地保障食品安全，维护人民群众的身体健康。
三聚氰胺的检测方法ppt课件
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
4. 洗板：孔内液体甩干，每孔加洗涤液250µl，洗涤4-5次， 最后用吸水纸拍干；
5. 显色：加显色液A、B各50µl，混匀，盖板避光反应10min; 6. 测定：加终止液50µl，混匀，在酶标仪450nm读OD值。 7. 结果判定：标准品、样品输入软件计算
一、概要
• 三聚氰胺（Melamine）简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合 物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水、对 身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。长期或反复大量摄入对 肾与膀胱产生影响，导致产生结石。
• 检测方法：①气相色谱质谱法（GC-MS） ②液相色谱串联质谱法（LC-MS-MS） ③高效液相色谱法(HPLC) 准确；成本高、操作复杂 ④ELISA——试剂盒检测 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
四、注意事项
1. 试剂盒选用不同，操作过程不同，请按购买试剂盒 说明操作；
2. 室温低于20℃或试剂及样本未回到室温20-25℃， 会导致OD偏低；
3. 每加一种试剂前要将其摇匀； 4. 不同批号试剂盒不要混用；
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
三聚氰胺的检测技术一
● 以目标物测定浓度为横坐标，目标物与对应同位素内标峰面积比为纵坐标，绘制三聚氰胺标准曲 线，在2.5～100.0 ng/mL线性关系良好，回归方程为y=0.998 266x+0.041 23，相关系数r为 0.999 3，符合检验对标准曲线的要求。
回收率实验
● 分别向空白样本中添加标准工作液、同位素内标工作液，按照1.3.1步骤处理并检测。添加水平为 0.01 mg/kg、0.03 mg/kg、0.10 mg/kg 3个水平，每个浓度6份平行样本，检测结果见表2。方 法回收率为82.8%～102.3%，相对标准偏差为3.2%～5.6%，回收率和精密度良好，符合检测方 法要求，适合液体乳中三聚氰胺的检测
● 检出限测定以空白牛奶样品为基质，一个阳性添加浓度C(10.0µg/g)，按照上述优化过的方法来 前处理和上机，所得信噪比S/N=19.49，可计算检出限为0.001 5µg/g。计算公式如下
● 检出限(method detection limit,MDL)(μg/g)=3C/(S/N)
● 回收率和精密度的确定以空白牛奶作为基质，进行相应的加标回收试验，加标浓度为 10µg/kg、 5 0 µg / k g 、 2 0 0 µg / k g 。 每 个 加 标 浓 度 分 别 做 6 个 相 同 浓 度 的 平 行 试 样
结论
● 本研究探索优化了一种基于高效液相色谱-串联质谱法的内标法测定液态奶 中三聚氰胺的分析方法。该方法通过用含10%二乙胺的乙腈水溶液充分提 取，取上清液进行氮吹浓缩后，定容上机测定，最后，该方法的检出限达 到了0.001 5μg/g，能灵敏的检测低含量基质，同时，液态奶试样在按 10μg/kg、50μg/kg、200μg/kg 3个浓度添加情况下根据该试验方法进行 前处理和仪器检测，结果回收率为87.79%～104.54%，相对标准偏差为 2.39%～5.07%。该方法具有前处理简单便捷、检出结果精密度高定量结 果准确且重复测试较为稳定等特点，大大提高了液态奶中三聚氰胺的检测 效率，方便对此类药物的监督管控对有效的倒逼生产养殖端按规定使用该 类药物起到积极推动作用
三聚氰胺检测原理
三聚氰胺检测原理
三聚氰胺是一种有机化合物，其检测原理主要是基于其与蛋白质的相互作用。
在三聚氰胺检测中，常用的方法包括光谱法、色谱法、质谱法等。
其中，光谱法是最常用的一种方法，其原理是利用三聚氰胺与蛋白质形成的复合物在特定波长下吸收光线的特性来进行检测。
在光谱法中，常用的检测方法包括紫外-可见光谱法和荧光光谱法。
紫外-可见光谱法是利用三聚氰胺与蛋白质复合物在特定波长下吸收光线的特性来进行检测，通过测定吸光度的变化来确定三聚氰胺的含量。
而荧光光谱法则是利用三聚氰胺与蛋白质复合物的荧光特性来进行检测，通过测定荧光强度的变化来确定三聚氰胺的含量。
除了光谱法外，色谱法也是一种常用的三聚氰胺检测方法。
色谱法主要包括气相色谱法和液相色谱法两种。
气相色谱法是将样品中的三聚氰胺通过气相色谱柱进行分离，再通过检测器进行检测，从而确定其含量。
而液相色谱法则是将样品中的三聚氰胺通过液相色谱柱进行分离，再通过检测器进行检测，从而确定其含量。
此外，质谱法也是一种高灵敏度的三聚氰胺检测方法。
质谱法是将样品中的三聚氰胺通过质谱仪进行分析，通过测定其分子离子的质荷比来确定其含量。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高准确性的特点，是目前三聚氰胺检测中较为常用的方法之一。
综上所述，三聚氰胺的检测原理主要是基于其与蛋白质的相互作用。
常用的检测方法包括光谱法、色谱法和质谱法。
不同的方法具有各自的特点和适用范围，可以根据实际情况选择合适的方法进行检测。
希望本文能够对三聚氰胺检测原理有所了解，有助于相关领域的研究和实践工作。
三聚氰胺 检测方法
三聚氰胺检测方法
三聚氰胺是一种有机化合物，常用于制造塑料、胶粘剂和涂料等工业产品。
然而，由于其毒性较高，三聚氰胺被广泛用作食品和饲料中的掺假物质，这对人和动物的健康构成了威胁。
因此，需要采用有效的方法进行三聚氰胺的检测。
以下是几种常用的三聚氰胺检测方法：
1. 高效液相色谱法（HPLC）：这是一种常用的分析方法，可以在饲料和食品中测定三聚氰胺含量。
样品经过净化、提取和洗脱等步骤后，通过高效液相色谱进行分离和定量分析。
2. 饲料掺假检测：主要通过检测饲料中的蛋白质含量来排除三聚氰胺的掺假情况。
由于三聚氰胺会增加饲料样品中的蛋白含量，因此检测饲料中的蛋白质含量可以间接检测三聚氰胺。
3. 红外光谱法（IR）：通过测量样品在红外光谱范围内的吸收和散射特性来确定三聚氰胺的存在。
这种方法需要先将样品制备成片状，然后使用红外光谱仪进行测量和分析。
4. 酶联免疫吸附测定法（ELISA）：这是一种基于抗体-抗原特异性反应的分析方法，可以快速准确地测定三聚氰胺的含量。
ELISA方法可以用于快速筛查食品和饲料样品中的三聚氰胺。
这些方法都具有各自的优缺点和适应范围，选择合适的方法应根据实际需求和样品性质进行综合考虑。
关于三聚氰胺的论文
生活中的食品健康问题历史文化与旅游学院旅游管理专业093班黄姣 0摘要:三聚氰胺由双氰(酰)胺与氨在高温下反应或由尿素直接在高温高压下制得。
食品工业上普遍采用的国家标准凯氏定氮法是一种很准确的测定蛋白质含量的方法。
但如果样品中还有其他化合物含有氮，凯氏定氮法就不准确了。
毒奶粉事件”的发生，就是不法分子在原料中掺水，以增加重量牟取利益。
关键词:三聚氰胺;原理;测定;健康安全正文:氰胺，一个我们非化学专业学生很陌生的术语，在三鹿婴幼儿配方奶粉事件发生后，一时间成为媒体和人们关注的焦点，成为街头巷尾谈论的话题。
三聚氰胺到底是什么物质？怎么会出现在我们日常生活的必需品——乳制品中呢？三聚氰胺分子式C3H6N6。
又称蜜胺、2 ，4 ，6- 三氨基-1，3，5-三嗪。
白色单斜棱晶，无味，微溶于水和热乙醇，微毒，三聚氰胺呈弱碱性（pKa=8），可与多种酸反应生成三聚氰胺盐。
其盐遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。
是一种重要的氮杂环有机化工原料。
工业上三聚氰胺由双氰(酰)胺与氨在高温下反应或由尿素直接在高温高压下制得，后者成本低，较多采用。
我们日常饮用的鲜牛奶其蛋白质含量按国家检测标准应为100毫升≥2.9克。
实际上生鲜牛奶的蛋白质含量一般在3%以上，所以一般都能达到国家标准，为防止往原奶中兑水，收购生鲜牛奶时检测蛋白质的含量。
食品工业上普遍采用的、被定为国家标准的是凯氏定氮法。
原理很简单：蛋白质含有氮元素，用强酸处理样品，让蛋白质中的氮元素释放出来，测定氮的含量，就可以算出蛋白质的含量。
如牛奶蛋白质的含氮率约16%，根据国家标准，把测出的氮含量乘以6．38，就是蛋白质的含量。
所以凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量，而是通过测氮含量来推算蛋白质含量，因为食物中的主要成分只有蛋白质含有氮，其他主要成分（碳水化合物、脂肪）都不含氮，因此凯氏定氮法是一种很准确的测定蛋白质含量的方法。
快速检测酸奶及蛋白饮料中三聚氰胺—高效液相色谱法
高效液相色谱法检测酸奶及蛋白饮料中三聚氰胺蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30％，而三聚氰胺的分子式含氨量为66％左右。
通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。
科标生物检测中心结合最新国家标准，凭借资深技术专家带领技术团队通过高效研发，应用国际领先的仪器检测设备和先进的技术准且分析出食品中三聚氰胺的含量。
三聚氰胺是非常亲水的小分子，在常规的反相色谱中不保留，因此不能与其他物质进行分离。
一般情况下，对于亲水性的化合物可以在溶剂中加入离子对试剂，使样品在反相柱上保留，与其他杂质进行分离。
在对三聚氰胺的检测中，加入的是辛烷磺酸钠(sodiumOC—tanesulfonate)。
但是国标方法检测需4个小时，现在介绍一种利用高效液相色谱法检测原料乳中的三聚氰胺的快速方法，本方法的定量限为2mg／kg。
1、原理试样中三聚氰胺经水和乙腈提取后，用高效液相色谱测定，外标峰面积法定量。
2、试剂①乙腈：色谱纯。
②柠檬酸：分析纯。
③辛烷磺酸钠：色谱纯。
④甲醇水溶液：准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用。
⑤三聚氰胺标准品：CAS108—78～O1，纯度大干99．O％。
⑥三聚氰胺标准储备液：精密称取三聚氰胺O．01OOg，用甲醇水溶液(2-4)溶解并定容至1OOmL的容量瓶中，混匀，即得1OOug／mL三聚氰胺标准储备液。
于4℃避光保存。
保存期1个月。
⑦微孔滤膜：0-45um，有机相。
3、仪器和设备①高效液相色谱(HPLC)仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
②分析天平：感量为0．0001g和0．01g。
③离心机：转速不低于400Or／min。
④超声波水浴。
⑤涡旋混合器。
⑥具塞塑料离心管：50mL。
4、结果计算试样中三聚氰胺的含量按下式进行计算：X=C×V／m／1000×1000式中：X—式样中三聚氰胺的含量，单位为mg／kg；C—经查标准曲线计算所得进样液的浓度，单位为mg／kg；V一试样总稀释体积，单位为mI；m—样品量，单位为ml。
三鹿奶粉掺杂三聚氰胺为什么可以提高蛋白质的含量
三鹿奶粉掺杂三聚氰胺为什么可以提高蛋白质的含量？鲜奶在温度提高后，三聚氰胺的溶解度也会大大提高，制作过程都是先提温，三聚氰胺的分子就和乳脂蛋白等大分子结合，温度再冷却下来后就比直接在常温时加的溶解度高了。
此外，鲜奶的蛋白质含量本身就比较小，三聚氰胺只需加一点就可以提高很大的蛋白质检测值。
检测蛋奶粉中的白质含量最普遍的方法是采用经典的凯氏定氮法.该方法的原理是将待测物质(如奶粉）在硫酸铜（CuSO4）催化下，用浓硫酸（H2SO4）消化分解，使各种形态的含氮化合物（蛋白质、氨基酸等）全部转化为铵离子（NH4+）一种形态，这样采用经典的酸碱滴定法即可定出氮含量，再乘以一定换算系数即为蛋白质含量。
正因为三聚氰胺含有超过百分之六十六的氮素,把它掺杂在奶粉中就可以提高奶粉的含氮量,从而提高蛋白质的检测含量.看看下面这段摘要可能会找到更准确的答案：先介绍一下蛋白含量的测定原理。
食品中（不光是牛奶）蛋白质含量是一个重要指标（我们如果去超市买食品，注意一下包装袋就知道了），本来最为准确的方法应该是采用现代仪器分析法，如光谱法、色谱法等进行分析，但这种方法过程较为复杂，使用仪器较为昂贵，而且不同仪器的测定有一定误差，因此现在绝大多数厂家（至少国内是）仍采用经典的凯氏定氮法（Kjeldal Method）。
该方法的原理是将待测物质（如奶粉、面粉、大米粉等）在硫酸铜（CuSO4）催化下，用浓硫酸（H2SO4）消化分解（即将所有有机物用浓硫酸分解为透明溶液），使各种形态的含氮化合物（蛋白质、氨基酸等）全部转化为铵离子（NH4+）一种形态，这样采用经典的酸碱滴定法（大一分析化学即学过）即可定出氮含量，再乘以一定换算系数即为蛋白质含量。
不同物质其换算系数稍有区别，一般奶制品类6.38、大米5.95、花生5.46、面粉5.70、玉米、高粱为6.24，大豆及其制品为5.71、肉与肉制品为6.25、大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83、芝麻、向日葵为 5.30（这与其中的蛋白质结构有关）。
三聚氰胺的检测方法 PPT
6
四、注意事项
1. 试剂盒选用不同，操作过程不同，请按购买试剂盒 说明操作；
2. 室温低于20℃或试剂及样本未回到室温20-25℃， 会导致OD偏低；
3. 每加一种试剂前要将其摇匀； 4. 不同批号试剂盒不要混用；
三聚氰胺的检测方法
7
5. 试剂盒2-8℃保存； 6. 0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质； 7. 加入底物液A、B后，一般显色10min，若颜色较浅
三聚氰胺的检测方法
5
4. 洗板：孔内液体甩干，每孔加洗涤液250µl，洗涤4-5次， 最后用吸水纸拍干；
5. 显色：加显色液A、B各50µl，混匀，盖板避光反应10min; 6. 测定：加终止液50µl，混匀，在酶标仪450nm读OD值。 7. 结果判定：标准品、样品输入软件计算
三聚氰胺的检测方法
• 检测方法：①气相色谱质谱法（GC-MS） ②液相色谱串联质谱法（LC-MS-MS） ③高效液相色谱法(HPLC) 准确；成本高、操作复杂 ④ELISA——试剂盒检测，快速、简便、准确、灵敏度高
三聚氰胺的检测方法
3
二、原 理
• 采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被三聚氰胺 抗原，样本残留的三聚氰胺和微孔条上预包被的抗原竞争三聚 氰胺抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与 其残留物三聚氰胺成负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应 的稀释倍数，即可得出样本中三聚氰胺的含量。
可延长反应时间到15min，但不可超过20min，反 之则减短反应时间； 8.每种液体加入速度尽量一致、快。
三聚氰胺的检测方法
8
• 1ppm=1000ppb • 1ppb=1000ppt • ppm即：mg/L（毫克/升） • ppb即：ug/L（微克/升） • ppt即：ng/L（纳克/升）
三聚氰胺的性质及检测方法
三聚氰胺旳性质及检测措施2023级食工一班郭佳 11 三聚氰胺旳理化性质三聚氰胺（英文: Melamine）分子式为C3H6N6,分子量为126.12,俗称密胺、蛋白精, IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”, 是一种三嗪类含氮杂环有机化合物, 为白色单斜晶体,无毒、无味,不可燃烧,可溶于甲醇、甲醛、乙酸、甘油及吡啶等,微溶于水、乙醇,不溶于苯、乙醚、四氯化碳。
相对密度为1.573g/cm3,熔点为354℃高温下可分解产生含氢化氰、氮氧化物和氨等有毒和刺激性旳烟雾。
三聚氰胺呈弱碱性,在中性或弱碱性环境下能与甲醛缩合形成多种羟甲基三聚氰胺,但在微酸性(pH值5.5~6.5)环境下,可以与羟甲基旳衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。
此外,三聚氰胺三种同系物:三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺。
三聚氰胺是一种用途十分广泛旳有机化工原料, 对身体有害, 不可用于食品加工或食品添加物。
三聚氰胺部分物理性质:熔点(℃): >300（升华）相对密度（水=1）: 1.573相对蒸气密度（空气=1）: 4.34饱和蒸气压(kPa): 6.66水中溶解度(20℃): 0.33g2 三聚氰胺旳毒性动物长期摄入三聚氰胺会导致生殖、泌尿系统旳损害,膀胱、肾部出现结石,并可深入诱发膀胱癌对于肾脏, 短期高浓度接触后会引起肾结石、急性肾衰, 长期接触还会导致肾脏组织损伤。
三聚氰胺同系物具有三聚氰胺同样旳毒性效应,诸多研究都将它们作为三聚氰胺复合物(MCs)进行总体毒理学评价。
3 第一法高效液相色谱法（HPLC）3.1 原理试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取, 经阳离子互换固相萃取柱净化后, 用高效液相色谱测定, 外标法定量。
3.2 试剂与材料除非另有阐明, 所有试剂均为分析纯, 水为GB/T 6682规定旳一级水。
甲醇乙腈氨水三氯乙酸辛烷磺酸钠甲醇水溶液三氯乙酸溶液（1％）氨化甲醇溶液（5％）离子对试剂缓冲液三聚氰胺原则品三聚氰胺原则储备液阳离子互换固相萃取柱定性滤纸海砂微孔滤膜氮气3.3 仪器和设备高效液相色谱（HPLC）仪分析天平离心机超声波水浴固相萃取装置氮气吹干仪涡旋混合器具塞塑料离心管3.4 样品处理3.4.1 提取3.4.1.1 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等称取2 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中, 加入15 mL 三氯乙酸溶液和5 mL 乙腈, 超声提取10 min, 再振荡提取10 min后, 以不低于4000 r/min离心10 min。
食品中三聚氰胺的检测方法
食品及饲料中三聚氰胺的检测方法麻丽华（江苏常州轻工职业技术学院，江苏常州213164）摘要：近年来，在食品和饲料中频频出现三聚氰胺，给食品安全带来了威胁，对食品和饲料中三聚氰胺的检测已成为必须。
文章对国内外检测食品和饲料中三聚氰胺的分析方法进行了综述。
关键字：食品；饲料；三聚氰胺；检测食品中三聚氰胺的检测方法由于食品检测中测定蛋白质含量一般都是使用凯氏定氮法，这种方法其实是通过测定氮含量后，再根据蛋白质的含氮量（15%～17%）来折算成蛋白质含量，所以，当食品中添加了三聚氰胺，采用该法是不能测出其是否存在及含量的。
目前，国内外对检测三聚氰胺的方法报道较少，我国有国标方法———重量法、高效液相色谱法和电位滴定法，但这些方法均为针对化工产品中的常量三聚氰胺的测定，而食品及动物饲料中产品的基质复杂，用以上方法检测干扰因素多，不能得到准确结果。
国际上报道的测定三聚氰胺的方法，一般都是使用气相色谱法[2]、气相色谱—质谱法（GC—MS）[8]、液相色谱法（HPLC）[1-4-5-6]、液相色谱—质谱法[4]、酶联免疫吸附法（ELISA）[7]等来进行测定。
气相色谱—质谱法方法原理：试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，提取液经离心后由混合型阳离子交换固相萃取柱净化，净化后的洗脱液用氮气吹干，用N，O—双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，以气相色谱—质谱联用仪器进行定性和定量检测。
利用气相色谱法或气相色谱—质谱法测定时，需对试样进行衍生化，前处理比较复杂，一般检测一个样品需要4～5 h，前处理的效果对检测结果影响较大，检出限较高（] 5 mg/kg 或更高），仅能检测简单基质。
实验部分: 将三聚氰胺标准品和三聚氰酸标准品用二乙二乙胺乙腈水溶液为提取溶剂。
加入二乙胺有利于提高三聚氰胺和三聚氰酸的萃取率，加入乙腈有利于沉淀水溶性蛋白，减少干扰。
实验发现，二乙胺!乙腈!水溶液可有效地沉淀牛奶样品中的蛋白质和脂肪，提取和净化同时完成，滤液澄清，滤液吹干迅速，缩短了样品前处理时间.HP5MS毛细管色谱柱(30×0.25mm×0.25um）；进样口温度（250℃）脉冲不分流进样，脉冲压力275.8 KPa ；载气为高纯氦气（纯度为99.999％）流速1.3ml/min程序升温以75℃保持一分钟再以没30℃升一次温至300℃再以50℃升温至315℃。
三聚氰胺的检测方法——HPLC
三聚氰胺的检测方法——HPLC一研究背景及内容（一）研究背景今年三月中旬以来，美国发生多起宠物猫、狗中毒死亡事件。
美国食品药品管理局(FDA)从江苏和山东两家公司出口美国的部分小麦蛋白粉和大米蛋白粉中检出三聚氰胺成分，并初步认为宠物食品中含有的三聚氰胺是导致猫、狗中毒死亡的原因。
不法厂商在植物蛋白粉中添加三聚氰胺的前提之一是，三聚氰胺物理性状为“白色单斜晶体、无味”，这与蛋白粉相仿。
前提之二，此物质易于购买，也易于生产，成本很低。
符合这两个前提的化学物质较多，而三聚氰胺含氮量高才是最根本原因。
据业内专业人员介绍，目前，国际上使用最多的饲料蛋白质含量检测办法为“凯氏定氮法”，即测定受检饲料中氮所占的比例，再乘以一定系数得到蛋白质含量。
南京大学高分子化学教授谌东中解释说，蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%,而三聚氰胺的分子式显示，其含氮量为66％左右。
由于“凯氏定氮法”只能测出含氮量，并不能区别饲料中有无合规添加剂或违规化学物质，所以，加了三聚氰胺的饲料理论上可以测出较高的“蛋白质含量”。
但是，三聚氢胺本身无法替代蛋白质，几乎没有任何营养价值。
加了这种物质，造成的只是蛋白质含量提高的假象。
三聚氰胺并非惟一的替代添加物，很多厂商用三聚氢胺拉高饲料蛋白质含量后，再加入低价的淀粉等，作低蛋白质含量。
以上两种操作，从经济上讲都有较大套利空间。
出于相同的原理，只要含氮量大于普通植物蛋白质的化学物质，且性状和价格具备条件，在理论上都存在被不法厂商利用的可能性。
《精细有机化工原料及中间体手册》显示，三聚氰胺“本品低毒，无刺激性……高温下可能分解产生氰化物（有较大毒性），故应避免高温”。
由国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》（第三卷），对三聚氰胺则有如下描述：“长期或反复接触作用：该物质可能对肾发生作用”。
（二）研究内容本论文主要以三聚氰胺为研究对象，选择大豆蛋白、面粉、小麦粉、薄立粉、饲料面粉为研究体系，研究复杂基体的处理方法和高效液相色谱对三聚氰胺的检测技术。
乳制品中三聚氰胺的含量的测定(高效液相色谱法)实验报告
2009级化学教育仪器化学综合性与设计性实验指导老师：曹** 2011年 5月 30号一、实验目的1．通过分析化学综合性实验、设计性实验，培养学生初步的解决分析化学实际问题的能力，培养学生的创新意识与创新能力。
2．学习查阅参考文献、综合参考资料、设计小型分析化学实验。
3．复习和巩固有关理论基础知识并用于指导实践。
4．进一步熟练掌握实验操作技术。
①实验题目：乳制品中三聚氰胺的含量的测定（高效液相色谱法）②摘要、关键词：[摘要]为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法, 通过超声提取, 离子交换萃取小柱净化, 结合高效液相色谱进行样品测定。
色谱条件: A液：0.9508 g 辛烷磺酸钠（5 mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。
色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×250mm，5 µm），检测波长：239 nm结果表明: 三聚氰胺标准曲线为y = 4495951x +18978.83, 相关系数R = 0.9999693, 在0.17～110.0 mg/L范围内线性关系良好, 方法检出限为0.12 mg/L, 两个样品三个水平的加标回收率分别为96.34 % (RSD = 4.76)、84.86 % (RSD = 7.21) 、104.29 % (RSD = 7.63) 和95.31 %(RSD = 4.39) 、89.25 % (RSD = 3.88) 、92.59 % (RSD = 5.27)。
[关键词]高效液相色谱; 三聚氰胺; 乳制品③引言一、目前有关三聚氰胺在乳制品中的概述：三聚氰胺(melamine) ）（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“1,3,5-三嗪-2,4,6-三氨基”，是一种重要的氮杂环有机化工原料, 通常用于塑料制品中合成树脂的生产[ 1 ] 。
三聚氰胺与蛋白质
三聚氰胺与蛋白质2008年9月，中国爆发三聚氰胺奶粉事件，一年前曾作为饲料非法添加剂诱发美国宠物死亡事件的三聚氰胺，摇身一变为婴儿的口粮，导致食用受其污染奶粉的婴幼儿患上了肾结石病症。
随后，国家质检总局紧急在全国开展了婴幼儿奶粉三聚氰胺含量专项检查。
此次专项检查对其余109 家企业进行了排查，共检验了这些企业的491 批次产品。
阶段性检查结果显示，有22 家婴幼儿奶粉生产企业的69 批次产品检出了含量不同的三聚氰胺。
三聚氰胺事件再次引起政府和民众高度关注，一时间成为媒体和食品安全部门调查的焦点，政府及时对市场上尚存的相关乳制品产品采取全部下架停售措施，各方媒体纷纷开始质疑乳制品行业产品质量与安全。
造成以上所有的一切。
原因却是不法分子为了增加原料奶或奶粉的蛋白质含量而人为加入三聚氰胺。
一、三聚氰胺与蛋白质三聚氰胺（英文名Melamine），是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。
主要作为生产三聚氰胺甲醛树脂（MF）的原料，可以制作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。
不法者在食品中渗三聚氰胺的动因，主要是由于其分子中含有大量氮元素。
用普通的全氮测定法测饲料和食品中的蛋白质数值时。
根本不会区分这种伪蛋白氮。
添加在食品中，可以提高检测时食品中蛋白质检测数值。
据1945 年的一个实验报道：将大剂量的三聚氰胺饲喂给大鼠、兔和狗后没有观察到明显的中毒现象。
动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。
然而。
2007 年美国宠物食品污染事件的初步调查结果认为：掺杂了w 6.6 %三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因，为上述毒性轻微的结论画上了问号。
但为安全计，一般采用三聚氰胺制造的食具都会标明“不可放进微波炉使用”。
蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的含氮量为66%左右。
通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高，从而使劣质食品通过食品检验机构的测试，有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加1%，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1／5。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质测定的主要原理、方法及三聚氰胺的检测方法蛋白质是复杂的含氮有机化合物，相对分子质量很大，大部分高达数百万，它们由20中氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，所含的主要化学元素为C、H、O、N，在某些蛋白质中含微量的P、Cu、Fe、I等元素。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种蛋白质的含氮量也不同。
根据蛋白质的性质和成分，测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质的含量；另一种是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团等测定蛋白质含量。
目前常用的有四种经典方法，即凯氏定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中考马斯亮蓝法（Bradford 法）法和Folin－酚试剂法（Lowry法）法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比双缩尿法（Biuret法）法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
一、常量凯氏定氮法1.原理：（1）消化：样品与硫酸一起加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在酸性溶液中。
（2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程。
此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。
其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。
加速了有机的分解。
但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。
为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。
但为了防止污染通常使用硫酸铜。
所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。
（3）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。
（4）吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。
半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。
2.操作步骤：准确称取样品中0.50-2.00g→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30分钟→至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却→加200ml水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在凯氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加热→至到凯氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗→用0.1N HCl滴定。
3.计算：总氮量%= （N(V2-V1)×0.014）/W × 100二、双缩脲法（Biuret法）1.原理：脲小心加热至150~160 摄氏度时，两个分子的脲脱去一个氨分子生成双缩尿，可于铜离子形成有色复合物，成为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有两个以上的肽键，与双缩脲的结构相似，也由双缩脲反应（而氨基酸中没有此结构），因此，在碱性溶液中蛋白质与二价铜离子（如硫酸铜）形成可溶性的紫色复合物（在540~560nm波长范围有最大吸收），在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的分子质量及氨基酸成分无关。
2.操作步骤：试剂：（1）甘油作为稳定剂：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO450ml。
（2）酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO4液40ml。
配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。
标准曲线绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质。
按蛋白质含量40、50、60、70、80、90、100和110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样与8支50ml 纳氏比色管中，然后各加入1ml四氯化碳，然后再用试剂（1）或（2）准确稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上层清液离心5分钟，取；离心5分钟，取离心分离后的透明液与比色皿中，在560nm波长下一蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定个溶液的吸光度，以蛋白质的含量为从坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线。
样品的测定：准确称取样品适量（即使得蛋白质含量在40~110mg之间）于50ml纳氏比色管中，加入1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测定其吸光度。
用所测得的吸光度在标准曲线上即可查得蛋白质mg数，进而求得蛋白质含量。
3.计算X=(m1*100)/m式中：X为蛋白质的含量（mg/100g）m1为由标准曲线上查得的蛋白质毫克数（mg）m为样品质量（g）三、Folin－酚试剂法（Lowry法）1.原理：这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
2.操作步骤：试剂：试剂甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）。
溶解于500毫升蒸馏水中。
（B） 0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。
稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。
牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。
（1）标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。
用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。
再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。
这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。
然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。
以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。
全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。
待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。
每分钟测一个样品。
（2）样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。
通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。
即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。
如上表中的8、9、10试管根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意：由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。
因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
四、紫外吸收法1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。
蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。
通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。
由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。
下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。