核酸的琼脂糖凝胶电泳

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九、操作步骤 1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成 0.5×TBE稀释缓冲液,待用。 2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶 中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电 炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂 糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼 脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份 蒸发。 3、 胶板的制备：将融化的琼脂冷却至50-60℃，而后 到 入 制胶模具 （ 预先插上样 品梳子）中， 待 胶 完 全 凝 固后拨出梳子 ，取出胶块，放入加有0.5×TBE 电泳缓 冲液的电泳槽内。
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六、材料 前期实验中提取的基因组DNA和质粒DNA，琼脂糖 (Agarose) 七、设备 水平式电泳装置,电泳仪, 微量移液枪, 微波炉或电炉, 紫外透射仪或凝胶成像系统。 八、 试剂 1、 5×TBE电泳缓冲液：称取 Tris 54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至 1000ml。 2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液（或30 ％ 甘油），贮存于 4℃。 3、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用 铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。
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5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA, 染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口 的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降 低15％。 6、 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳 迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶), 电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液 中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热, 严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
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3、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离 不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量 的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度 是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移 动最慢。 4、 电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压 成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将 缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所 加电压不得超过5v/cm。
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四、电泳指示剂： 核 酸 电 泳 常 用 的 指示剂 有两 种 ，溴 酚 蓝 （ bromophenol blue, Bb ）呈蓝紫色；二甲苯晴 （ xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携带的电荷 量 比 溴 酚蓝 少，在凝胶中的 迁移率比 溴 酚蓝 慢。 胶浓（%） 溴酚蓝 二甲苯青 0.6 1 1.4 2 1kb 0.6kb 0.2kb 0.15kb 2kb 1.6kb
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思考题： 1. 琼脂糖凝胶电泳的适用范围？ 2.当两条碱基数相差不大（比如50bp)的双链DNA 分子混在一起时，电泳时将采取什么措施将两 条DNA分子分开？
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4 、 加样：取 8μlDNA 样 品 与 2μl 6×载样液混 匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。 5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电 源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。 电泳方向由负极向正极，当溴酚蓝条带移动到距 凝 胶 前 沿 约 2cm 时 , 停 止 电 泳 。 6 、 染 色 ： 未 加 EB 的胶 板 在电泳 完毕 后 移 入 0.5μg/ml 的 EB 溶液 中 , 室温 下染色 20-25 分 钟 。 7、 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外 灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光 灯 下 观察 时 应戴上防护眼镜 或 有 机玻璃面罩 , 以 免损伤眼睛。
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二、实验原理： 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎 不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电 泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为 电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和 构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从 而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分 子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可 观察到核酸片段所在的位置。
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核酸的琼脂糖凝胶电泳
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一、琼脂糖凝胶电泳的功用 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片 段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分 辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分 离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴 化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光 下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确 定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电 泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的 克隆操作。
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五、影响凝胶电泳的因素 在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其 迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移 速率与DNA分子量对数成反比。 2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同 浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数 与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分 子的大小。
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三、琼脂糖电泳分离DNA的范围 琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。 琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度 琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA 片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定 的电场下电泳。