植物表达载体构建与遗传分析
F3′5′H基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化
F3′5′H基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化司爱君;祝建波;李吉莲;邓福军【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2008(017)005【摘要】类黄酮3′5′羟基化酶(Flavonoid-3',5-'hydroxylase; F3′5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键性酶,能使花色素的合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素.从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总RNA , 利用RT-PCR技术克隆得到了约1.7kb的F3′5′H片段.F3′5′H的 cDNA序列分析结果表明,克隆得到的序列与原序列同源性达到99.34 %,开放读码框为1 521 bp,编码507个氨基酸.将推算的氨基酸序列与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,发现与文献报道的存在2个氨基酸差异,氨基酸同源率为99.6 %.将此基因构建到含有35S启动子的植物表达载体PBI-F3′5′H上, 并通过农杆菌介导法对粉红色矮牵牛进行了遗传转化,初步鉴定获得了转基因植株.【总页数】5页(P306-309,329)【作者】司爱君;祝建波;李吉莲;邓福军【作者单位】石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子,832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子,832003;石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,新疆石河子,832003;新疆农垦科学院,新疆石河子,832000;新疆农垦科学院,新疆石河子,832000【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.根癌农杆菌介导反义F3'H基因对矮牵牛的遗传转化 [J], 刘南南;王宝琴;管宇2.矮牵牛F3＇5＇H基因的克隆及其在不同着色花药中的表达 [J], 花庆;王蕾;韦灵林;刘迎团;徐虹3.矮牵牛编码 F3'5'H的蓝色基因表达载体构建及转化 [J], 李莉;祁银燕;解燕;刘雅莉;娄倩4.国槐苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、反义表达载体构建及遗传转化 [J], 许锋;朱俊;张风霞;王燕;程水源;程述汉5.中间锦鸡儿fad2基因片段克隆、反义表达载体构建及遗传转化初步研究 [J], 汪阳东;李春秀;齐力旺;张守攻因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实验十五、、表达载体的构建
选择表达载体应考虑的因素
(4).所产生的融合蛋白是否需要切割加工以及如何切割 加工。对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载体 序列间应有适当的切割识别序列。 (5).是否需要用强启动子提高表达水平。当需要提高表 达水平时，可选用强启动子。但在某些情况下，由 于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主不 利，可选用诱导型载体，只有经诱导后，蛋白质才 能被表达。
实验十二、表达载体的构建及鉴定 实验十二、
基因工程中使用的表达系统类型
一、基因来源： 基因来源： 原核生物 真核生物 二、原核表达系统 原核表达系统： 1、原核表达系统： 遗传背景清楚，易改造，培养容易，费用 低，蛋白质表达水平高。但在原核中表达后所合 成的蛋白无自我修饰如糖基化等，或因折叠的方 式不正确或折叠效率的低下，最后产生的蛋白质 其生物活性很低。 2、真核表达系统
原核表达系统类型
大肠杆菌表达系统 大肠杆菌
遗传背景很清楚，基因操作的方法非常完善，很容易大 规模培养产生大量的目的蛋白质。 但大肠杆菌表达的蛋白质大多不分泌到细胞体外，如 要使蛋白分泌到细胞外，必需使目的基因带有信号肽。信 号肽(signal peptide)又称前导肽(1eader peptide)，这是一种 位于分泌蛋白质或输出蛋白质N端上长约15～30个氨基酸的 序列，可被细胞的蛋白质加工机制所识别，使蛋白质通过 细胞膜被分泌出来。
原核表达载体 克隆载体: 克隆载体
通常都带一个松复制子、一个多克隆位点和一个筛选标 记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。
表达载体: 表达载体:
除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位 点(核糖体结合位点,又称SD序列，它是指mRNA分子中核糖 体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面3～12个碱基， 该序列与16S rRNA的互补)、转录起始信号、转录信号、翻 译起始密码子(ATG)和终止密码子等一系列调控序列。
园艺植物遗传转化载体的构建
03
终止子是位于目的基因 下游的一段DNA序列， 能够终止目的基因的转
录。
在园艺植物遗传转化中， 常用的终止子有
CaMV35S终止子和花椰 菜花叶病毒（CaMV）
35S终止子等。
终止子的选择对于目的 基因的表达水平和转录
效率具有重要影响。
复制子
01
复制子是用于在转化细胞中复制目的基因的元件， 通常来源于病毒或质粒。
02
在园艺植物遗传转化中，常用的复制子有来自SV40 的复制子和来自pBR322质粒的复制子等。
03
复制子的选择对于目的基因的拷贝数和表达水平具 有重要影响，同时也应考虑安全性因素。
03
园艺植物遗传转化载体的构建方法
质粒DNA的制备
提取质粒DNA
从宿主细胞中提取质粒DNA是构 建转化载体的第一步，常用的方 法有碱裂解法、煮沸法和高盐沉 淀法等。
纯化质粒DNA
提取的质粒DNA需要进行纯化， 去除杂质和核酸酶，以保证后续 酶切和连接的顺利进行。
检测质粒DNA质
量
通过电泳和紫外分光光度计等方 法检测质粒DNA的质量，确保其 纯度和浓度满足后续实验要求。
限制性酶切和连接
选择限制性内切酶
01
根据目的基因和载体的大小选择合适的限制性内切酶，以确保
酶切位点的准确性和后续连接的效率。
限制性酶切
02
将质粒DNA和目的基因分别进行限制性酶切，获得具有相同黏
性末端的片段。
连接反应
03
将酶切后的目的基因和载体进行连接，形成转化子。连接反应
的条件和时间对转化效率有重要影响。
转化子的筛选与鉴定
转化子筛选
将连接产物转化到受体细胞中，通过抗性筛选、PCR鉴定等方法 筛选阳性转化子。
AtCS25基因过表达载体的构建和拟南芥的遗传转化
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ａｔ Ｓ ５ｉ ｎ ｔ ｎ ｕ ｋ ｏ ｅ ｅ ｉ ｒ ｂ ｄ ｐ ｉ ｔ ａ ｉ ｎ ｓ ｒ ｃ ： Ｃ ２ ｓａ ｆ ｃ ｉ ｎ ｎ ｗｎ ｇ ｎ ｎＡ ａ ｉ ｏ ｓｓ ｈ ｌ ａ．Ａｃ ｏ ｄ ｎ ｅ ａ ａｙ ｉ ｅ ｕ ｔ ｆｂｏ ｎｏ ｍａ ｉｓ ｕ ｏ ａ ｃ ｒ ｉ ｇ ｔ ｔ ｎ ｌ ｓｓｒ ｓ ｌ ｏ ｉｉ ｆｒ ｔ ， ｏｈ ｃ
越 多 的基 因 的功能 被 人 们 所 了解 ， 是 仍 然 有 大 量 但 的功能 未 知 的基 因等待 人们 去探 究 。随着 生物 信 息
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
学、 反向遗传学和现代分子生物学技术 的不断进步 ， 这些 功 能未 知基 因 的 定 位 ， 以及 对 于 它们 的表 达 与 调控 的研 究 ， 引起 了人们极 大 的兴 趣 。
ｔ ｓ ｇ ｎ ａ ｓ ｏ ｉｔ ｔ ｌｅ ｇ ｒ ｉａ ｉｎ ａ ｄ ｕｂ ｒ ｗｔ ． Ｉ ｒ ｒ ｔ ｃ ｖ ｒ ｔ ｅ ｆ ｎｃｉｎ ｏ ｈｓ ｇｅ ｅ， ｔｅ ｆ ｌ ｈｉ ｅ ｅ ｍ ｙ ａ ｓ ｃ ａｅ ｗｉｈ ｐｏｌｎ ｅ ｍ ｎ ｔｏ ｎ ｔ ｅ ｇ ｏ ｈ ｎ ｏ ｄｅ ｏ ｕｎ ｏ ｅ ｈ ｕ ｔｏ ｆｔ ｉ ｎ ｈ ｕｌ
ｌ ｎ ｔ ＤＳ ｏ Ｃ ２ ａ ｃ ｏ ｅ ｉｔ ｏ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｂ ｎ ｒ ｖ ｃｏ Ｂ １ １ ｎ ｓ ｒ ｎ ｆ ｒ ｄ ｎ ｏ ｅ ｇｈ Ｃ ｆＡＴ ５ ５ ｗ ｓ ｌｎ ｄ ｎ ｏ ｖ ｒｘ ｒ ｓ ｉｎ ｉ ａ ｙ ｅ ｔ ｒ ｐ Ｉ ２ ａ ｄ ｗａ ｔ ｓｏｍｅ ｉｔ ｗｉ — ｔｐ ａ ｌ ｄ ｙｅ
植物基因工程的一般步骤
植物基因工程的一般步骤一、目的基因的获取在植物基因工程中，首先需要获取目的基因。
目的基因是指那些对植物性状具有重要影响的基因，通过改变这些基因的表达或功能，可以实现植物的遗传改良。
目的基因的获取通常采用分子克隆技术，从植物基因文库或通过PCR等技术直接从植物组织中克隆目的基因。
二、植物表达载体的构建获取目的基因后，需要构建一个植物表达载体。
植物表达载体是一种将目的基因转移到植物细胞内的质粒或病毒载体，通常包括启动子、终止子等调控元件，以及选择标记基因等。
构建植物表达载体的目的是为了确保目的基因在植物细胞内的正确表达。
三、将目的基因导入植物细胞构建好植物表达载体后，需要将其导入到植物细胞中。
导入方法通常采用基因枪法、农杆菌转化法、花粉管通道法等。
这些方法各有优缺点，应根据目的基因和植物种类选择合适的方法。
四、目的基因整合到植物基因组中导入植物细胞后，目的基因需要整合到植物基因组中才能实现其功能。
这一过程通常需要采用分子生物学技术进行检测和鉴定，以确保目的基因已经正确地整合到植物基因组中。
五、目的基因的检测与鉴定为了确认目的基因是否已经表达以及表达水平如何，需要进行目的基因的检测与鉴定。
这一过程通常采用分子生物学技术，如PCR扩增、DNA测序、Northern blot、Western blot 等，对目的基因的表达进行检测和鉴定。
六、转基因植物的筛选与培育在目的基因成功整合到植物基因组中并表达后，需要筛选和培育转基因植物。
这一过程通常采用抗性筛选、分子检测等技术，对转基因植株进行多代选育，培育出遗传稳定性好、农艺性状优良的转基因植株。
七、转基因植物的遗传稳定性检测为了确保转基因植株的遗传稳定性，需要进行遗传稳定性检测。
这一过程包括对转基因植株的DNA进行多代跟踪分析，以评估目的基因的遗传稳定性及其对后代的影响。
八、转基因植物的安全性评估与环境释放在转基因植物培育成功后，需要进行安全性评估与环境释放。
番茄黄化曲叶病毒 Rep 基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化
番茄黄化曲叶病毒 Rep 基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化裴华丽;刘永光;乔宁;李美芹;薛其勤;杨天慧【摘要】克隆番茄黄化曲叶病毒的复制酶基因（TYLCV－Rep），并构建其植物表达载体，通过农杆菌介导法转入番茄子叶外植体。
经过共培养、潮霉素筛选和分化再生，获得21株潮霉素抗性植株。
PCR检测和Southern Blot检测结果表明，有3株呈阳性检测反应，说明TYLCV－Rep基因已整合到番茄基因组中，阳性率为14．3％。
烟粉虱接种试验结果表明，番茄转基因植株较非转基因植株对番茄黄化曲叶病毒的抗性明显增强。
【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】5页(P41-44,45)【关键词】复制酶基因;黄化曲叶病毒;番茄;遗传转化;表达载体【作者】裴华丽;刘永光;乔宁;李美芹;薛其勤;杨天慧【作者单位】潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700;潍坊科技学院，山东寿光262700【正文语种】中文【中图分类】S436.412.1+1通信作者：刘永光，硕士，讲师，主要从事植物病理方面的研究。
E-mail：****************。
番茄在中国各蔬菜产区均有大面积的种植，在我国蔬菜周年供应中占有非常重要的地位。
随着温室大棚的推广及蔬菜反季节栽培效益的提高，温室番茄栽培面积连年增长，其病害的发生也呈现逐步加重的趋势。
近年来，在番茄主产区相继发现的番茄黄化曲叶病毒，对番茄植株的生长、开花、坐果等方面均产生严重的危害，给当地的番茄生产带来巨大的经济损失[1-6]。
番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)[4-7]，是一类世界范围内广泛发生的单链环状DNA病毒。
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。
通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。
实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。
实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。
同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。
结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。
betA-BADH双价基因植物表达载体的构建及四倍体刺槐的遗传转化
betA-BADH双价基因植物表达载体的构建及四倍体刺槐的遗传转化betA/BADH双价基因植物表达载体的构建及四倍体刺槐的遗传转化引言：随着人类对于资源的需求不息增长和环境问题的日益突出，农作物的培育和改良迫在眉睫。
基因工程技术为农作物品种改良提供了一个新的途径。
本探究旨在构建betA/BADH双价基因植物表达载体，并将其应用于四倍体刺槐的遗传转化，以期提高该物种的耐旱能力和产量。
一、材料与方法1. 构建betA/BADH双价基因植物表达载体本探究使用了pCAMBIA1300载体进行基因的构建，该载体包含了CaMV 35S启动子和nos终止子，可广泛应用于植物基因工程探究。
起首，利用PCR技术将betA和BADH基因从模式植物中扩增得到。
随后，将扩增得到的这两个基因与pCAMBIA1300载体进行酶切毗连，形成betA/BADH双价基因植物表达载体。
2. 四倍体刺槐的遗传转化起首，选择健康的刺槐幼苗作为受体材料。
使用激素处理方法，获得愈伤组织。
将构建好的betA/BADH双价基因植物表达载体引入愈伤组织，通过生物转化方法将外源基因转入植物细胞。
接着，将转化后的愈伤组织进行再生培育，得到转基因幼苗。
将转基因幼苗移植到含有适合营养和激素的生长基质中，进行苗期管理。
最后，将转基因苗移植至田间，并进行长期的观察和鉴定。
二、结果与分析1. 构建了betA/BADH双价基因植物表达载体经酶切毗连，成功将betA和BADH基因与pCAMBIA1300载体进行了毗连，并得到到了目标载体。
2. 四倍体刺槐的遗传转化通过生物转化方法，将构建好的betA/BADH基因植物表达载体成功引入刺槐愈伤组织中，并得到了转化后的愈伤组织。
经过再生培育，转基因幼苗成功获得。
经过一系列的苗期管理，转基因苗良好地生长并逐渐适应田间条件。
三、谈论本探究成功构建了betA/BADH双价基因植物表达载体，并将其应用于四倍体刺槐的遗传转化。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。
这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。
下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。
一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前，首先需要确定目标植物和目标基因。
目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象，而目标基因则是具有特定功能的基因，如抗病性、耐旱性等。
二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。
载体是将目标基因导入植物细胞的媒介，通常由DNA序列构成。
在构建载体时，需要将目标基因插入到适当的表达载体中，并加入其他必要的DNA片段，如启动子、终止子和选择标记基因等。
三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。
目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中，然后利用农杆菌侵染植物组织，将载体导入植物细胞。
基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。
四、筛选转化植株在转化植物细胞后，需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。
为了区分转化植株和未转化的植株，常常会在载体中加入选择标记基因。
选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性，在培养基中添加相应抗生素或除草剂后，只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。
五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后，需要进行培养和繁殖。
通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长，以获得足够数量的转化植株。
六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后，需要对其进行鉴定，确认其是否成功转化。
鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。
通过这些方法，可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。
七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功，就可以进行后续的分子生物学和生理学分析，如基因表达分析、蛋白质功能研究等。
此外，转化植株也可以用于基因工程和农业生产中，如改良作物品质、提高产量等。
几种新型植物基因表达载体的构建方法
几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。
植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。
本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
关键词:Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。
而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。
随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。
传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。
从1969 年Arber 等发现了限制性切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到三段T-DNA、Gateway 等技术延伸出了许多新的载体构建方法。
本文结合自己的实验工作选择介绍了近年来其中几种新型的具有代表性的植物表达载体构建的方法，对其应用的方向、优缺点作出了评估，期望给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。
押广东卷第20题 基因工程(解析版)
押广东卷基因工程1、（2023广东高考）种子大小是作物重要的产量性状。
研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。
通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：（1）拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
（2）用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。
为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________。
（3）转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。
在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________（填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。
【答案】（1）野生型（2）①. 载体（基因表达载体）②. 启动子和终止子（3）①. DAI基因和卡那霉素抗性基因②. 75 ③. 自交④. 100 ⑤. 【解析】【分析】1、基因突变是基因结构的改变，包括碱基对的增添、缺失或替换；基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期；基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
植物表达载体构建
卸甲载体（disarmed vector） 1．Onc-卸甲载体： 所谓的卸甲载体就是无毒的（ non-oncogenic）、即切 除了 Onc 致瘤基因的 Ti 质粒载体。在这种 Onc- 载体中，已 经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取 代。这样，任何适合于克隆在质粒中的外源DNA片段，都 可以通过与 pBR322 质粒 DNA 的同源重组，而被共整合到 Onc-Ti质粒载体上。最常用的 Onc-卸甲载体为pGV3850， 它保留了两个边界和右边界附近的 nos基因（胭脂碱合成酶 基因），可作为鉴别转化细胞的一个标记； T-DNA内部的 Onc 缺失 区被 pBR322 序 列（ 含 Apr 基 因 ）所取 代 。插入 pBR序列可供卸甲载体和中间载体之间实现交换重组形成 共和体，即重组体。 2. Onc+卸甲载体： 不去除Onc基因的卸甲载体，用于特殊用途。
第多种转化系统， 如载体转化系统、原生质体DNA直接导入转化系统、基因 枪DNA导入转化系统，以及利用植物种质细胞如花粉粒等介 导转化系统等等。 其中的载体转化系统是植物基因工程中最重要的一种转化 系统。 载体转化系统中最重要的又是Ti质粒转化载体。
一．植物基因工程载体种类及命名规则： 二．根癌农杆菌Ti质粒的结构和功能： （一）Ti质粒的遗传特性、结构及功能： （二）T-DNA的基因结构与功能： 三．农杆菌Ti质粒的基因转化机理： （一）T-DNA的加工和转移： （二）T链蛋白复合体的形成及VirE的功能： （三）T链复合体通过细菌膜的转运及VirB的功能： （四）T链复合体靶向植物细胞核： （五）T链整合植物基因组的分子机理： （六）农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控： 四．农杆菌Ti质粒的改造及载体构建： （一）Ti质粒的改造及卸甲载体构建： （二）中间载体的构建： （三）中间表达载体的构建： （四）植物基因转化载体系统的构建： （五）载体构建中常用的选择基因和报告基因
植物表达载体构建
2．常用的中间载体及其构建： （1）广谱中间载体： 所谓广谱中间载体是由大肠杆菌广谱质粒克隆 T-DNA片段后 构建而成的。常用的广谱质粒是 RK2 衍生的载体 pRK290 。 由它构建的中间载体既能在大肠杆菌中复制，又能在农杆菌 中复制。
广谱中间载体的构建过程见下图。 ①将选定的T-DNA片段克隆到大肠杆菌质粒上； ②将外源基因连同细菌选择标记（如抗生素抗性）一起插入 到T-DNA片段的限制性切点中； ③将产生的 T-DNA“ 工程”片段亚克隆或共整合到广谱质粒 pRK290。 由于 pRK290 具有在广寄主范围中复制和接合转移的起点， 因而在辅助质粒如 pRK2013 反式动员作用下， pRK290 即可 从大肠杆菌转入根癌农杆菌中。
（ 1 ）共整合系统中间载体：含有与 Ti 质粒 T-DNA 区同源的 序列，此外含有pBR的序列，在其被引入农杆菌后即可高频 地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组；具有一个或多个 细菌选择标记，这将有利于筛选共整合质粒；具有 bom位点 （接合转移位点），在有诱导质粒存在的情况下，bom位点 的存在可使中间载体在不同细菌细胞内进行转移；含有植物 阳性选择标记，例如可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性的新 霉素磷酸转移酶（neomycin phosphoransferase，Npt-II）基 因，以利于转化植物细胞的筛选；含有单一的限制性内切酶 切点，以利于外源基因的插入；无 Ti 质粒的边界序列 ( 见下 图 )。 （ 2 ）双元载体系统中间载体：其与共整合载体的不同之处 是：无同源序列；具有LB和RB；无ColE复制点。
（四）植物基因转化载体系统的构建：
上述构建的中间表达载体仍然不能直接作为植物外 源基因转化的载体，因为中间表达载体仍是一种细菌 的质粒，不能把外源基因转化到植物细胞。因此，必 须进一步把中间载体引入到上述已改造的受体 Ti 质粒 中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体，才能 应用于植物基因的转化。它是由两种以上质粒构成的 复合型载体，故称之为载体系统。
植物中基因组分析与遗传图谱的构建研究
植物中基因组分析与遗传图谱的构建研究植物是地球上最早出现的生物之一，其多样性和适应力使其在地球上占据了重要的生态地位。
为了更好地了解植物的遗传特性及演化历程，科学家们对植物中基因组进行了多年的研究。
本文将从基因组分析和遗传图谱的构建两个方面着手，探讨植物中基因组分析和遗传图谱构建的研究进展。
基因组分析基因组是一个生物所有基因的集合，是遗传信息的载体。
通过对植物基因组的分析，能够深入了解植物的生态、形态和基因的功能等方面的信息。
首先，对植物基因组的测序是了解植物基因组信息的基础。
在过去的几十年里，随着测序技术的不断发展，植物基因组的测序速度和效率也随之提高。
直到2021年，已有超过400个植物物种的基因组被测序，并且还有大量的基因组正在被测序中。
其次，基于植物基因组的热图分析能够帮助我们快速了解植物中基因的表达情况和不同组织间基因表达的差异。
一般而言，我们会对在不同生长阶段的植物各个组织部位的基因表达情况进行分析，以揭示不同组织间基因表达的异同。
通过这样的方法，科学家们能够深入了解植物生长发育的分子机制和基因调控网络。
最后，基于植物基因组的基因家族分析也非常有价值。
基因家族是指具有相似序列和功能的基因集合，在植物中有许多重要的基因家族，如转录因子家族、激素受体家族等。
研究各种植物基因家族的分布、数量和结构，能够深入了解植物中基因相互作用的网络体系，这对于探究植物的生长、发育和适应性具有重要意义。
遗传图谱构建遗传图谱是一种描述基因位点之间相对位置和联系的图表，通常用来研究遗传连锁、遗传多态性等问题。
对植物遗传图谱的构建，能够帮助我们深入了解植物基因与表型表现的对应关系和遗传变异情况，为遗传改良和基因克隆提供依据。
构建植物遗传图谱的方法主要有两种，一种是基于遗传连锁分析，另一种是基于物理定位。
以基于遗传连锁分析的方法来说，通常会以常见的遗传连锁标记——分子标记为代表，比如基因间以100Kb为间隔摆放的SNP标记等。
实验十五、、表达载体的构建
在实验过程中，我们对实验条件进行了优化，提高了实验 的效率和成功率，为今后的实验提供了有益的参考。
研究展望
拓展应用领域
未来可以将该表达载体应用于更多的基因治疗和基因功能研究领域， 为相关领域的发展提供有力支持。
改进表达载体
针对本次实验中存在的不足，可以对表达载体进行进一步的优化和 改进，提高其转染效率和稳定性，以适应更多不同类型细胞的需求。
控机制，为基因治疗和基因功能研究提供更加坚实的基础。
03
拓展应用范围
在未来的研究中，可以尝试将该表达载体应用于动物模型和临床试验中，
以验证其在不同生物体内的应用效果和安全性。
THANKS
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表达载体通常由质粒或病毒DNA改造而来，它们能够将外源基因带入宿主细胞，并 在其中进行复制和表达。
通过构建不同的表达载体，科学家们可以实现基因的异源表达、高表达和定向进化 等目的，为生物制药、农业和工业生产等领域提供有力支持。
02
表达载体的基础知
识
表达载体的定义
表达载体是用于在宿主细胞中复制和 表达外源基因的运载体，它能够将目 的基因导入细胞并使其稳定遗传。
实验十五：表达载体 的构建
目录
CONTENTS
• 引言 • 表达载体的基础知识 • 实验材料与方法 • 实验结果与分析 • 结论与展望
01
引言
实验目的
了解表达载体在基因工程中的应 用。
学会设计并构建基因表达载体。
掌握表达载体构建的基本原理。
01
03 02
实验背景
表达载体构建是基因工程中的关键技术之一，它涉及到将目的基因插入到载体DNA 中，以便在宿主细胞中进行表达。
表达载体是基因工程中的重要工具， 它能够将外源基因在宿主细胞中进行 有效表达，产生所需的蛋白质或代谢 产物。
ubi-1启动子驱动的花生芪合酶基因植物表达载体的构建及玉米遗传转化研究
ubi-1启动子驱动的花生芪合酶基因植物表达载体的构建及玉米遗传转化研究ubi-1启动子驱动的花生芪合酶基因植物表达载体的构建及玉米遗传转化研究近年来，基因工程技术在农作物育种中得到广泛应用，通过基因的转移和表达，可以改进作物的产量、品质和抗逆性。
植物表达载体作为基因转移的载体，在基因工程中扮演着重要角色。
本研究旨在构建ubi-1启动子驱动的花生芪合酶基因植物表达载体，并将其用于玉米的遗传转化研究。
芪合酶是一种重要的植物生物活性物质合成酶，在药用植物中广泛存在，并具有广泛的生理活性。
通过引入芪合酶基因，可以增强植物对环境胁迫的抵抗能力，提高作物的产量和品质。
本研究首先设计了ubi-1启动子，该启动子具有高度活性，在多种作物中都得到有效应用。
ubi-1启动子的序列被引入到表达载体中，以驱动花生芪合酶基因的表达。
接下来，通过PCR技术将花生芪合酶基因的编码序列扩增，并将其连接到ubi-1启动子的下游。
然后，将得到的重组载体转入大肠杆菌中进行扩增。
随后，通过酶切鉴定和测序确认，确保得到的植物表达载体中含有正确的花生芪合酶基因和ubi-1启动子序列。
然后，将得到的植物表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导的遗传转化技术将花生芪合酶基因导入到玉米幼胚中。
接种后的幼胚经过培养和筛选，最终获得了含有花生芪合酶基因的转基因玉米植株。
进一步研究表明，该花生芪合酶基因在转基因玉米中得到了高效表达。
通过Western blot和RT-PCR等分子生物学方法，找到了基因的表达时期和特异性表达位点。
结果表明，在花生芪合酶基因转导后的转基因玉米中，该基因在根、茎和叶片等多个组织中均有表达。
此外，对转基因玉米的抗逆性能进行了评估。
在干旱和盐胁迫条件下，转基因玉米的生长状态和生理特性均明显优于野生型玉米。
这表明花生芪合酶基因的转导可以增强玉米的抗逆性能。
综上所述，本研究成功地构建了ubi-1启动子驱动的花生芪合酶基因表达载体，并将其用于玉米遗传转化中。
植物基因定向表达技术体系的创建思路
植物基因定向表达技术体系的创建思路
植物基因定向表达技术是一种能够实现对植物基因进行精准控制的技术。
它通过构建表达载体，将目标基因与适合的启动子连接，利用基因转化技术将其导入植物细胞中，从而实现对目标基因的特定表达。
植物基因定向表达技术的创建需要遵循以下几个步骤：
1. 确定目标基因
首先需要确定研究的目标基因。
这个基因可以是与特定生物过程相关的基因，也可以是已知的抗病或抗逆基因等。
2. 筛选适合的启动子
接着，需要筛选出适合的启动子。
启动子是基因表达的起点，能够影响基因在不同组织和环境中的表达。
在筛选启动子时，需要考虑到目标基因的表达模式和所在的组织类型。
3. 构建表达载体
将筛选出的启动子与目标基因连接，构建出表达载体。
表达载体是将目标基因导入植物细胞的载体，需要考虑到载体的稳定性和转化效率等因素。
4. 选择适合的基因转化方法
常用的基因转化方法包括农杆菌介导的基因转化和基因枪法。
在选择基因转化方法时，需要考虑到目标植物的物种特性和转化效率等因素。
5. 鉴定表达效果
需要对转化后的植株进行鉴定，确认目标基因的定向表达效果。
鉴定方法包括PCR、南方杂交、Western blot等。
植物基因定向表达技术的创建需要综合考虑多个因素，从而实现对目标基因的精准表达。
这种技术的应用可以为植物基因功能研究以及植物遗传改良等领域提供有力的支持。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定1. 引言植物基因转化是一种重要的生物工程技术，利用这种技术可以引入外源基因或修改内源基因，从而改变植物的性状和功能。
转基因植物是通过植物基因转化技术获得的具有外源基因的植物，具有重要的应用价值。
本文将介绍植物基因转化的基本原理和方法，并探讨转基因植物的分析与鉴定方法。
2. 植物基因转化的基本原理和方法2.1 基本原理植物基因转化利用穿透细胞壁的技术，将外源DNA导入植物细胞，通过细胞的内源机制使其稳定地表达。
常用的植物基因转化方法包括农杆菌介导的转化、生物弹射法和基因枪法等。
2.2 基本方法2.2.1 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是最常用的植物基因转化方法之一。
基本步骤包括构建表达载体、感受剂的处理和遗传转化的选择和鉴定。
构建表达载体时，将目标基因插入适当的载体上，并添加转录和翻译的调控序列，如启动子和终止子，以确保目标基因的表达。
感受剂的处理是将表达载体导入农杆菌中，并通过培养条件的优化，使农杆菌中的表达载体得到高效表达。
遗传转化的选择和鉴定是将感受剂经过适当的处理后，转化到植物细胞中，并通过筛选和鉴定来确定转化成功的细胞株。
2.2.2 生物弹射法生物弹射法是将DNA以高速撞击植物细胞，使其穿透细胞的质壁和细胞膜，进而将外源基因导入细胞内。
生物弹射法通常使用微粒子加速器或毛发管射击法进行。
微粒子加速器是一种将金属微粒或微球与外源DNA一起加速，并将其发射到目标细胞上的设备。
通过微粒的高速撞击，外源基因能够穿透细胞的质壁和细胞膜。
毛发管射击法是将DNA包裹在微小的金属颗粒上，然后使用高压气体将金属颗粒射击到目标细胞上。
这种方法也能够使外源基因穿透细胞膜进入细胞。
2.2.3 基因枪法基因枪法是将外源DNA包裹在金粒或微米级金属颗粒上，并使用高压气体或炮发射器将其穿过细胞质，进入植物细胞。
基因枪法不需要依赖转化菌或细胞融合等辅助手段，直接将外源DNA送入目标细胞，因此具有较高的成功率。
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得
植物基因克隆、表达载体构建及遗传转化实验心得实习生：李宇皓，实习时间为2017年11月27日-12月25日。
这次实习是去农学院，具体是一个专业—园艺科学。
这是我第三次参加此类型的实习了。
前两次都是上课的形式，今天终于亲自动手操作了！还不错吧!这也算是我实践性比较强的一门课了。
实习内容包括有：《植物基因组文库构建》、《植物多样性》、《植物基因组工程与应用》、《植物抗病虫害》。
最后进行分组讨论会，向指导老师汇报成果，感觉很棒啊！从10月30号到12月13号，五天时间里，我们几个同学根据实际情况，做好各项准备，完成了毕业设计的前期任务，并在第六周开始正式着手整个课题的研究工作，可谓万事俱备只欠东风了！
实验目的和要求：1.掌握植物基因组文库构建方法2.掌握外源基因在大肠杆菌中表达的方法3.掌握基因组文库构建与高密度筛选4.熟悉多克隆抗体技术5.理解基因工程原理6.通过外源基因表达产物对花卉新品种的选育作用以及利用反义技术实现基因定位和标记
等相关问题。
实习步骤（含内容）：实习一：了解植物基因组文库构建概念及意义；制定实验方案；进行文库构建；并利用文库分析植物进化史。
实习二：分离转录间隔区序列；目的基因与其他基因的分离纯化；目的基因的克隆及转化载体构建；目的基因的 PCR 扩增、测序与分析；目的基因片段的克隆；基因片段的连接；基因文库构建及质量检查。
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分离获得的目的基因往往不具有 完整的基因结构，而只是表达产物的 可读框（ORF：open reading Frame）； 还需加上启动子和终止子。
如果分离到的目的基因拥有完整 的基因结构（即拥有启动子、表达产 物的开放阅读框和终止子），因基因 的表达特点不符合要求也需进行修饰 改造；有些基因例外，如C4光合代谢 途径的一些关键酶基因只能用原基因 的所有完整结构才有可能达到目的。
启动子（promoter）
启动子是位于基因的5’端外测，紧 挨转录起始位点一段非编码的核苷酸 序列，它的功能是引导RNA聚合酶同基 因的正确部位相结合；
终止子（terminator）
终止子是在基因3’端下游外测与 终止密码相邻的一段核苷酸序列，具 有转录终止信号的功能。
一）影响构建植物表达载体的 主要因素
1）限制性内切酶;
2、工具酶
2）T4 DNA连接酶; 3）RNaseA; 4）CAIP; 5) Taq DNA 聚合酶
;
二、植物遗传转化研究进展
1、遗传转化效率
转化效率因转化再生体系与之相 结合的转化方法，造成许多作物的转 化植株出现嵌合体与育性问题，导致 遗传转化效率比较低。
第七章 植物表达载体构建与 遗传转化
植物基因工程
植物基因工程以植物为对象，将 从不同生物中分离到的基因，经酶切 连接构成重组DNA分子，然后转入受 体植物细胞使新基因在受体细胞内整 合、表达，获得新的植物类型，再生 植株通过无性或有性增殖将外源基因 遗传给后代。
植物基因工程的作用与意义
植物基因工程能顺利地在不同物 种间进行基因转移，因此育种学家可根 据意愿改造植物的一些性状，在较短时 间内使获得高产、优质、抗逆性强的作 物新品种成为现实。
3) pUC19:克隆载体，用于构建含2x35S启 动子和35S poly(A)载体，从华美公司购买。 4) pSCL0041植物表达载体:在左右边界 内含有hyg和带内含子的gus基因，且各自 带有35S启动子和35S poly(A)、nos poly(A)。外源基因的启动子为2x35S，终 止子为35S poly(A) 。
1)目的基因的结构特点； 2)转化受体植物类型与种类； 3)转化方法； 4)转入受体植物的表达要求； 5)植物表达载体类型； 6)选择适宜的启动子与终止子； 7)选择性标记基因及报告基因；
(二）构建植物表达载体的一些 基本知识与实验技能
从事植物表达载体构建工作主要 是进行各种质粒的提取、纯化、酶切、 相关DNA片段的回收、连接、转化与验 证等，需要一些分子生物学相关的知 识和实验技能。
植物基因工程主要研究内容 1) 目的基因的克隆与分离；
2) 3) 4) 5) 6) 7) 植物表达载体构建； 建立适宜的遗传转化再生体系； 遗传化即转基因； 转化细胞或植物的筛选； 转化植株检测； 转基因植物环境释放的安全评价。
一、植物表达载体构建
构建植物表达载体的目的
构建植物表达载体的主要目的是 将目的基因进行修饰改造，使其转入 受体植物后的表达符合目的需要。
三）植物表达载体构建实例
1、 质粒
构建含不同启动子的植物表载体， 用到pUCpepc、pSCL0041、 pUC19、 pBI121四个不同的质粒。
1）pUCpepc:为pUC19克隆载体，
经XbaI内切酶位点插入甘蔗C4Ppc基 因，抗性为Amp，由张木清研究员提 供。 2）pBI121：植物表达载体，内含gus 和nptII基因,启动子为35S,终止子为 nos poly(A)，由本所陈平华博士提 供。
2、遗传转化与安全性
转基因研究中另一个焦点是转基 因植物及产品的安全性问题，根据转 化的对象不同通过选择不同的选择标 记基因、使用Cre-lox重组系统或质体 转化等手段解决。
3、定向转化
在植物中IR> HR几个数量级，因此不 能定向插入外源基因。原因：外源DNA进 入基因组时，与双链DNA发生断裂后进行 修复时机制在前关：同源重组修复（HR） 为主时外源基因按定向插入，非同源末端 连接重组修复（NHEJ）时则能达到外源基 因不能定向插入。而 Physcomitrella （moss基因组大小与水稻相当）能定向插 入。
常用的基本技能：
1)大肠杆菌、农杆菌的培养、继代与保 存； 2)大肠杆菌、农杆菌中的质粒小量提取、 大肠杆菌中质粒大量提取与纯化； 3)各种质粒载体的酶切，回收； 4)大肠杆菌与农杆菌感受态细胞的制备； 5)相关酶切DNA片段的连接与转化； 6)PCR引物设计与检测。
进行植物表达载体构建时，根据 所选载体的内切酶位点进行准确设计 是工作的关键；但是这种仅仅基于分 子生物学常识的设计不一定能保证成 功，还有许多未知因素影响实验工作， 能及时发现问题及并进行再次的合理 设计有助于加快工作进度。
从理论上讲，一个好的遗传 转化体系应能解决嵌合体及育性 问题。即受体再生系统要再生效 率高、再生植株可育且不受基因 型影响；另外，两者相互较好地 匹配。
而实际上，由于多种因素 的影响如转化方法要高效、被 转化的部位与可转化再生部相 同等问题至今仍未能很好解决。
农杆菌介导转化技术比较 简单，但转化有基因型依赖、 质粒与菌株特异性。