微生物纤维素的生物合成及其应用前景

微生物纤维素的生物合成及其应用前景

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周　媛

三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室(宜昌443002)

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基金项目:湖北省教育厅重点项目(2000B14014)

作者简介:周　媛(1956～),女,教授。

一般认为合成纤维素是植物特有的

功能,的确,自然界的纤维素绝大部分是由植物产生的。纤维素是地球上产量最大的天然聚合体,其产量达到1011t/年,广泛存在于各种高级植物中,也存在于一些低等植物、细菌和个别低等动物中,如海洋中生长的一些绿藻和某些海洋低等动物体中也含有纤维素。1　微生物纤维素的性质

传统的食醋酿造过程中,常在醪液表面上生成类似凝胶膜状物,称为菌膜。早在1886年,英国人B rown 等利用化学分析方法确定了这类物质为纤维素。后来,确定了它的组成和结构与植物纤维素没有明显的不同。但是醋酸菌所产生的纤维素是纯净的,即以纯纤维素组成的形式存在,而高等植物产生的纤维素都掺杂着木质素、半纤维素和其他杂质,其存在形式是纤维素、木质素和半纤维素组成的三级立体结构。

因此,醋酸菌产生的纤维素不同于自然界广泛存在的纤维素,醋酸菌纤维素具有独特的性质。1.1　高纯度、高结晶度、高重合度醋酸菌纤维素纯度高、结晶度高、重合度高,并且以单一纤维存在,这样在制备微晶纤维素(m icrocrysta lline cellulo se )时非常便利,微晶纤维素是医药产品制

剂的优良辅料。目前微晶纤维素的生产是将天然细纤维,先用浓碱(17.5%)室温处理,收集不溶部分,再用浓盐酸煮沸,去除其中的无定形部分,余下结晶部分经干燥、粉碎得到的聚合度约200的微晶纤维素。这一处理过程环境污染严重。当然,醋酸菌纤维素无须用浓碱和浓酸如此处理。

1.2　极强的水结合性

微生物纤维素的纤维直径在0.01μm ～0.1μm 之间,它的表面积是植物纤维素的300倍,因此它就具有比植物纤维更强的吸水性、粘稠性,它能结合比自身干重大60～700倍的水,而棉花或其他木植物纤维素要达到这一水平就需要经过一系列的工序加以改造后才能实现,因此成本也大幅度提高。

1.3　极佳的抗撕强度和形状维持能力

微生物纤维素的弹性模数为一般纤维的数倍至10倍以上,并且抗撕强度高。微生物纤维素膜的抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要强5倍。日本北海道大学地球环境科研所的Nobuo Sakairi,H isash i A sano,M asto O gawa 等人在《木醋杆菌连续培养过程中微生物纤维素直接收获法》一文中报道,该培养法获得的纤维素再经处理,其杨氏模量最大为106g /den ie r,它们的平均值为90.4g /

den ie r。处理后的纤维其杨氏模量远大于棉花的(3.0～4.9g/den ier),因此具有很好的形状维持力。

1.4　具有很好的可通透性

微生物纤维素具有网状结构,因此具有很好的可通透性。

1.5　具生物可降解性及生物合成时的可调控性

微生物纤维素具有较高的生物适应性,并且在自然界中可直接降解,不污染环境。微生物纤维素在培养过程中,可通过调节培养条件得到各种物理性能不同的纤维素。如木醋杆菌(A cetobacter xylinum)能以葡萄糖及乙酰葡萄糖胺合成N2乙酰氨基葡萄糖,并以4%mo l质量的比例把N2乙酰氨基葡萄糖联接在醋酸菌纤维素中。

2　微生物纤维素的生物合成途径

2.1　产生菌

现已证明,在各种条件下能合成纤维素的微生物有:醋酸菌属(A ce tobact2 er)、根瘤菌属(R h izob ium)、土壤杆菌属(A grobac terium)、八叠球菌属(Sarc ina)、假单胞菌属(P seudomona s)、无色杆菌属(A ch romobac ter)、产碱菌属(A lcali2 gene s)、气杆菌属(A erobac ter)、固氮菌属(A zo toba ter)、这九个属的某些种,它们产生的纤维素统称为微生物纤维素,研究比较全面的是醋酸菌属的木醋杆菌

(A ce tobacter xylinum)。

2.2　生物代谢途径

在木醋杆菌生物代谢过程中戊糖循环(HM P)和柠檬酸循环(TCA)两条代谢途径参与了微生物纤维素的生物合成。由于糖酵解(E M P)活力缺乏或微弱,即缺乏磷酸果糖激酶或酶活力微弱,因此木醋杆菌不能在厌氧条件下代谢葡萄糖。细菌微生物合成的前体物为尿苷二磷酸葡萄糖,由葡萄糖合成纤维素的4个主要酶催化反应步骤分别是:①葡萄糖激酶的对葡萄糖的磷酸化作用;②葡萄糖磷酸异构酶将62磷酸葡萄糖通过异构作用转化成12磷酸葡萄糖;③焦磷酸化酶将12磷酸葡萄糖转化成尿苷二磷酸葡萄糖;④纤维素合成酶催化合成纤维素:UD P2Glc+(β21,42gluco se)n→UD P+(β21,42gluco se)n+1。通过对木醋杆菌微生物纤维素生物合成的研究,发现微生物纤维素合成步骤的最后一步是在细胞膜上进行的。c2di2G M P(环二鸟苷酸)是微生物纤维素合成调节机制的关键因子,c2d i2G M P是作为纤维素合成酶变构催化剂起作用。在纤维素生物合成中如果没有c2di2G M P,纤维素合成酶将失去活性。M g2+对二鸟苷酸环化酶有激活作用,纤维素的生物合成将由两种c2d i2G M P磷酸二酯酶A和B的作用而终止。其生物代谢途径见图1

。

图1　木醋杆菌纤维素生物代谢途径

微生物纤维素的分泌过程是伴随微生物纤维素的生物合成同时进行的。随着醋酸菌生长,大约12～70分子的微生物纤维素从细菌表面间隔大约10nm的微孔同时分泌到培养基中。在细胞表面这些纤维素分子通过氢键互相连接,形

成纯的纤维素纤丝。这种纤丝在纯度上和超分子结构上优于植物纤维素纤丝。许多纤维素缠绕成纤维素丝带。一个醋酸杆菌可以在培养基中通过β21,4糖苷键聚合20000个葡糖分子形成单一、扭曲、带状的微细纤维。丝带状的微细纤维随着细胞的生长分裂并不断裂。

微生物纤维素丝带的宽度比植物纤维素要细,长度不定,丝带之间相互交织,形成网状的多孔结构。微生物纤维素的网眼结构有很大的表面积,前面在介绍微生物纤维素的性质时提到它的表面积是植物纤维素的300倍,使得微生物纤维素具有高持水能力和高抗撕强度。

事实上,纤维素的生成模型中,葡糖聚合以及微细纤维素的连接作用是紧密相连同时进行的两个步骤。

3　微生物纤维素微生物发酵研究

3.1　菌株

Ish ikawa等人的研究表明,微生物纤维素的生成与细胞的生长关系密切。他们发现对氨基苯甲酸可以同时促进醋酸杆菌的生长和纤维素合成。通过选育磺胺胍抗性菌,他们得到一株在含44g/L 果糖培养基中产纤维素9.7g/L的高产菌株。

一般的纤维素生产菌在静置培养的条件下产量高,而在搅拌培养下产量偏低。Toyo sak i等人希望能获得有利于在通气搅拌条件下高产的菌株。他们一共分离了2096个产纤维素的菌株,分离的菌株中有412株既能在静置有能在通气搅拌发酵条件下产微生物纤维素。他们在倾斜档板摇瓶条件下用果糖2玉米浆作发酵培养基得到一株高产的木醋杆菌(命名为B PR2001),在发酵罐中的纤维素产量可达7.7g/L。

上海农科院植物保护研究所马承铸、顾真荣从天然的150分果、菜、土样品中分离得到了两株有高产潜力的原始菌株,静置培养的最高产量分别为14g/ L和16g/L,但摇瓶培养的最高产量仅有 1.9g/L和 2.2g/L。经鉴定,一株为巴氏醋杆菌木醋亚种(A.pastecerinus Sub sp.Xylinum),另一株为汉森醋杆菌(A.han senii)。

马霞等人自长膜的醋醅中分离出一株发酵生产细菌纤维素产量较高且稳定的醋酸菌M12。经过对该菌株的形态和生理生化特征的分析,通过测定G+ Cmo l%含量,根据伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)提供的方法,初步鉴定该菌为醋化醋杆菌木质亚种(A ce tobac ter xyli2 num sub sp.xylinum,又称木醋杆菌)。

产生纤维素的菌株很多,但产量高的却为数很少。优良的菌株的获得是微生物纤维素高产的一个前提条件,可以从自然界直接筛选得到,可以通过物理化学的诱变来选育,也可以用基因工程的方法获得,目前参与纤维素生物合成的一些蛋白中除了UD PG焦磷酸化酶和纤维素合成酶,其它的蛋白如鸟苷酸环化酶等都可以通过基因工程的方法获得高水平或低水平的表达,因此通过定向遗传操作,可以获得高产纤维素菌株,而且对菌株还有一个要求。就是该菌株在环境压力下,能稳定遗传,在搅拌培养时不易突变为不产纤维素的菌株。

3.2　发酵过程控制

Kouda等人研究了在通气搅拌条件下微生物纤维素生物合成过程中发酵液的流变学性质,以羧甲基纤维素(CMC)为对照,实验发现,微生物纤维素悬浮液的流变性比CMC的小。微生物纤维素的非牛顿行为与CMC的相比CMC在所给定的搅拌速度范围内的浓度分布是一致的,而微生物纤维素浓度分布只有在高度搅拌下才是均匀的。同时,他们还