蛋白表达和纯化课件
合集下载
蛋白质的表达纯化.pptx
本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆 菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有 6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白， 该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸 （NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以 提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质 的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。
第5页/共16页
• 1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 • 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。
30%Acr- Tris-HCl H2O
Bis
pH 8.8
5ml
3ml
4ml
10%AP TEMED 120ul 20ul
灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶 面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看 见清晰的界限）
第1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ页/共16页
感谢您的观看！
第16页/共16页
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
第13页/共16页
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
第14页/共16页
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
第10页/共16页
注意事项
(1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用， 操作时应戴手套和口罩。
(2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成 凝胶板与玻璃板之间产生气泡。
(3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。 (4) 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的 通过。 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区 带扭曲。 （6）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过 低都会影响电泳效果。 (7) 稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽， 需800毫升。
别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。
第5页/共16页
• 1．装配制胶用的玻璃板（由助教演示）。 • 2．制分离胶：按所需的浓度配制12.5％分离胶。
30%Acr- Tris-HCl H2O
Bis
pH 8.8
5ml
3ml
4ml
10%AP TEMED 120ul 20ul
灌完分离胶后在胶面上小心加水封（注意不要冲坏胶 面），等胶自然凝聚后（这时候在胶面与水封之间可以看 见清晰的界限）
第1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ页/共16页
感谢您的观看！
第16页/共16页
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
第13页/共16页
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
第14页/共16页
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
第10页/共16页
注意事项
(1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用， 操作时应戴手套和口罩。
(2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成 凝胶板与玻璃板之间产生气泡。
(3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。 (4) 灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的 通过。 (5) 切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区 带扭曲。 （6）电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过 低都会影响电泳效果。 (7) 稀释5×SDS/电泳缓冲液至1×浓度灌入电泳槽， 需800毫升。
蛋白原核表达与纯化新生培训PPT课件
水平
具有thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋
白的可溶性。
毒基因：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）
第14页/共41页
BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用T7溶 菌酶的严谨调控机制
的，但如果加入非离子去污剂就会变成可溶。
第24页/共41页
蛋白的可溶性 蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。
第25页/共41页
定位： 可溶蛋白定位在胞质、细胞周质或者胞外（培养基） 包涵体主要定位在胞质和细胞周质；
特点： 可溶蛋白具有正确折叠的天然构象且具备生物活性； 包涵体：高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解。
第29页/共41页
常见的纯化标签
标签
纯化用的填料或配基
洗脱方法
多聚组氨酸（6*His）
谷胱甘肽硫转酶 （GST）
多聚精氨酸（PolyArg）
多聚半胱氨酸（PolyCys）
多聚苯丙氨酸（PolyPhe）
螯合镍、铜、钴离子 的填料
键合谷胱甘肽的亲和 填料
SP琼脂糖凝胶
活化巯基琼脂糖凝胶
苯基琼脂糖凝胶
咪唑或降低 pH 10-20mM 还原谷胱甘
第3页/共41页
外源基因在大肠杆菌中表达流程
目的基因扩增
目的基因插入表达载体
外源基因的表达
重组基因转化入宿主菌中
“基因——载体第4—页/—共4菌1页株——培养”
常用原核表达载体系统
系统名称 公司 启动子 抗性 常用标签
特点
pGEX pMal pET
GE
NEB Merck (Novagen)
具有thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋
白的可溶性。
毒基因：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”）
第14页/共41页
BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用T7溶 菌酶的严谨调控机制
的，但如果加入非离子去污剂就会变成可溶。
第24页/共41页
蛋白的可溶性 蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。
第25页/共41页
定位： 可溶蛋白定位在胞质、细胞周质或者胞外（培养基） 包涵体主要定位在胞质和细胞周质；
特点： 可溶蛋白具有正确折叠的天然构象且具备生物活性； 包涵体：高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解。
第29页/共41页
常见的纯化标签
标签
纯化用的填料或配基
洗脱方法
多聚组氨酸（6*His）
谷胱甘肽硫转酶 （GST）
多聚精氨酸（PolyArg）
多聚半胱氨酸（PolyCys）
多聚苯丙氨酸（PolyPhe）
螯合镍、铜、钴离子 的填料
键合谷胱甘肽的亲和 填料
SP琼脂糖凝胶
活化巯基琼脂糖凝胶
苯基琼脂糖凝胶
咪唑或降低 pH 10-20mM 还原谷胱甘
第3页/共41页
外源基因在大肠杆菌中表达流程
目的基因扩增
目的基因插入表达载体
外源基因的表达
重组基因转化入宿主菌中
“基因——载体第4—页/—共4菌1页株——培养”
常用原核表达载体系统
系统名称 公司 启动子 抗性 常用标签
特点
pGEX pMal pET
GE
NEB Merck (Novagen)
蛋白表达纯化课件
学习交流PPT
9
蛋白质纯化常用层析方法
1、凝胶过滤。根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量较大 的先出峰，分子量小的后出峰。 2、离子交换色谱。蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于 其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电 荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负 电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度 梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱。对于等电点小于5.0的酸性蛋白 质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使 用阳离子交换。 3、疏水作用色谱。利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝 胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。 4、亲和色谱。利用蛋白质、多肽与配基的特异性相互作用而进行分离。 5、反相色谱。常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备 分离，分辨率极高。
学习交流PPT
5
步骤1. 目标基因全基因合成：
1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。 2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子，mRNA二级结构等的优 化。 3.合成设计好的基因序列，将目标基因亚克隆到合适的复制质粒上。
提取mRNA，逆转录PCR得到cDNA
学习交流PPT
6
步骤2. 目标基因亚克隆：
学习交流PPT
7
步骤4. 目标蛋白表达及纯化：
1.对时间，温度以及IPTG浓度等表达条件进行优化，诱导表达目标蛋白。 2. 培养重组细菌，通过亲和，离子交换，疏水及凝胶过滤等层析方法 纯化表达的重组蛋白。 3.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。 4.通过Western-blot验证目标蛋白正确性，根据蛋白质性质检测其活性
蛋白质化学蛋白质的分离纯化和表征标准版PPT
蛋白质的纯化是基于其结构和功能的研究需求，旨在获得高度纯化且具有生物活性的蛋白质。纯化过程中需考虑蛋白质的酸碱性质，特别是等电点，此时蛋白质溶解度最低，有利于沉淀分离。根据蛋白质的分子大小和形状，可采用渗透压法、沉降分析法、凝胶过滤法及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法等方法测定其分子量，进而指导纯化策略。蛋白质的胶体性质使其在溶液中稳定分散，而通过破坏这一稳定性，如盐析法、有机溶剂沉淀法、重金Байду номын сангаас沉淀法等，可实现蛋白质的沉淀分离。纯化时还应结合结晶分析、溶解度分析和光吸收等手段，综合评估纯化效果。最终，通过一系列分离纯化步骤，获得满足研究需求的纯蛋白质。
蛋白表达及纯化PPT课件
萃取法
液-液萃取法
利用两种不混溶的溶剂，将目标蛋白 质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中 。
反胶团萃取法
利用反胶团形成的微环境，选择性分 离和纯化蛋白质。
色谱法
凝胶色谱法
利用凝胶介质对不同大小的蛋白质颗粒的分离作用，将目标蛋白质与其他杂质 分离开。
离子交换色谱法
利用离子交换剂对不同带电状态的蛋白质的吸附作用，将其与其他蛋白质分离 开。
亲和层析
利用基因工程改造的蛋白质分 子上的特定标签与固相载体上 的配体结合进行分离纯化。常 用的亲和层析包括His-tag亲 和层析、GST亲和层析等。
离子交换层析和凝胶过滤 层析
与抗体药物的纯化类似，离子 交换层析和凝胶过滤层析也可 用于重组蛋白药物的进一步纯 化和精制。
蛋白质相互作用研究中的纯化应用
02
蛋白纯化方法
沉淀法
盐析法
通过加入高浓度的盐溶 液，改变蛋白质的溶解
度使其沉淀下来。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低蛋白 质溶解度的原理，使其
沉淀。
聚合物沉淀法
利用聚合物与蛋白质的 相互作用，使蛋白质沉
淀。
低温沉淀法
在低温条件下，通过改 变蛋白质的溶解度使其
沉淀。
离心法
差速离心法
通过逐渐增加离心力，将 不同大小的蛋白质颗粒分 离开。
扩展床吸附技术
将大颗粒的介质填充于柱中，使流动相能够通过吸附作用去 除杂质，提高纯化效果。
集成化与自动化技术
集成化分离系统
将多个分离步骤集成在一个系统中， 实现连续的分离纯化，提高生产效率。
自动化控制技术
通过自动化控制系统，实现分离纯化 的全流程监控和自动调节，减少人为 误差和操作时间。
《蛋白表达纯化》课件
基础研究领域
用于解析蛋白质结构与功能、 探究生物过程和疾病机制等。
02
蛋白表达系统
原核表达系统
操作简便
原核表达系统通常在相对较低的 成本和较短的时间内实现蛋白表 达。
高表达量
原核细胞具有较高的繁殖速度， 因此可以快速获得大量的目标蛋 白。
原核表达系统
• 蛋白翻译后修饰少：原核细胞没有真核细胞复杂的翻译后 修饰机制，因此表达的蛋白通常不需要复杂的纯化步骤。
案例三：融合蛋白的表达与纯化
总结词
融合蛋白表达纯化的优势和应用
详细描述
融合蛋白是指将两个或多个蛋白质序列融合在一起形成的单一蛋白质。这种技术常用于 蛋白质标签、蛋白质相互作用研究、抗体药物等领域。融合蛋白的表达纯化具有一定的 复杂性，但通过选择合适的融合伙伴和优化表达纯化条件，可以获得高纯度和稳定性的
实验试剂的储存与使用
实验试剂应按照规定的要求进行储存， 避免因储存不当导致试剂变质或失效。
使用前应仔细核对试剂的名称、浓度、 使用过程中应控制试剂的用量，避免浪
有效期等信息，确保使用正确的试剂。
费和环境污染。
06
案例分析
案例一：重组蛋白的表达与纯化
总结词
重组蛋白表达纯化的基本流程和技术要点
详细描述
重组蛋白表达纯化是生物技术领域中常见的技术手段，主要涉及基因克隆、载体构建、转化、诱导表 达、纯化等步骤。其中，选择合适的载体和宿主细胞、优化表达条件以及纯化方案的制定是关键。
案例二：膜蛋白的表达与纯化
总结词
膜蛋白表达纯化的特殊技术和挑战
详细描述
膜蛋白是一类特殊的蛋白质，它们嵌入细胞膜中，具有跨膜结构域。膜蛋白的表达和纯化相对于可溶性蛋白具有 一定的难度。常用的表达系统包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等。纯化时需考虑保持膜蛋白的天然状态和功能。
全式金-蛋白表达与纯化的PPT
原理
促进正确折叠
手段
融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）
分泌表达
融合表达 控制表达水平 “假”包涵体 （疏水区域，膜结合等）
细胞周质表达，胞外分泌
融合溶解性高的标签（GST，MBP） 诱导温度 IPTG浓度 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶„„）
1
2
1
2
3 Lane 1：37℃
最高 蛋白种类多，需裂解 ≤50% 菌体，复杂 较少 ≤4% 变化 较大 蛋白种类少，需渗透 压休克，相对容易 纯化简单。但机理不 详，成功先例少 适用于疫苗开发、抗 体制备，前景广阔。
表达定位
菌液 离心 菌体 悬菌，渗透压休克 菌体 悬菌，裂解，离心 沉淀 溶解，离心 沉淀 胞质不溶组分 胞质可溶组分 培养基组分 细胞总蛋白 细胞周质组分
严谨调控
稀有密码子
溶解性
Rosetta系列
Origami系列
稀有密码子 不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基 因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。
表达条件
• 乳糖操纵子与诱导物
• 常用表达条件的优化
乳糖操纵子与诱导物
• 1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统
原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件
原核表达原理概述
目的基因
构建
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体 表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
表达载体
• 启动子
• 融合标签
• 常用表达载体系统
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子
促进正确折叠
手段
融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）
分泌表达
融合表达 控制表达水平 “假”包涵体 （疏水区域，膜结合等）
细胞周质表达，胞外分泌
融合溶解性高的标签（GST，MBP） 诱导温度 IPTG浓度 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶„„）
1
2
1
2
3 Lane 1：37℃
最高 蛋白种类多，需裂解 ≤50% 菌体，复杂 较少 ≤4% 变化 较大 蛋白种类少，需渗透 压休克，相对容易 纯化简单。但机理不 详，成功先例少 适用于疫苗开发、抗 体制备，前景广阔。
表达定位
菌液 离心 菌体 悬菌，渗透压休克 菌体 悬菌，裂解，离心 沉淀 溶解，离心 沉淀 胞质不溶组分 胞质可溶组分 培养基组分 细胞总蛋白 细胞周质组分
严谨调控
稀有密码子
溶解性
Rosetta系列
Origami系列
稀有密码子 不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基 因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。
表达条件
• 乳糖操纵子与诱导物
• 常用表达条件的优化
乳糖操纵子与诱导物
• 1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统
原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件
原核表达原理概述
目的基因
构建
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体 表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
表达载体
• 启动子
• 融合标签
• 常用表达载体系统
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子
蛋白质纯化技术PPT幻灯片课件
超速离心法 (ultracentrifugation)：~60万 g ， 6万~8万 r/min。可用来测定蛋白质分子 量。
16
• 超速离心
17
1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
1
蛋白质的分离纯化与鉴定
Isolation, Purification and Identification of Protein
2
分子生物学圣经—分子克隆实验指南
3
为什么要纯化蛋白质？
蛋白质是生命功能的执行者
• 理论意义：深入研究某种蛋白质的功能 以及作用机制，如信号通路中的蛋白 质…
• 应用价值---蛋白质工程 医药、工业、科研… 作为药物靶点…
25
2. 分离方法
在实验操作上，分为： •沉淀法 •离心法 •电泳法 •超滤法 •相分配法 •层析法
26
27
•Note
*不可能有一套统一的方法适用于分离纯 化所有的蛋白质，
*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分 离纯化程序，
*而且所用的主要技术手段都基本相同。
28
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
23
1.6吸附性质
• 原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、 陶瓷、塑料等。
• 方法
▫ 疏水层析
24
1.7变性和复性
• 原理
▫ 变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有 的空间结构、生物学功能及部分理化特性。
▫ 复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构 及生物学功能。
• 方法
▫ 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中 纯化原核表达蛋白
16
• 超速离心
17
1.2分子形状
• 形状
▫ 蛋白质在离心通过溶液时，或通过膜、凝 胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中时，都会受 到分子形状的影响。
• 方法
▫ 梯度离心 ▫ 电泳
1
蛋白质的分离纯化与鉴定
Isolation, Purification and Identification of Protein
2
分子生物学圣经—分子克隆实验指南
3
为什么要纯化蛋白质？
蛋白质是生命功能的执行者
• 理论意义：深入研究某种蛋白质的功能 以及作用机制，如信号通路中的蛋白 质…
• 应用价值---蛋白质工程 医药、工业、科研… 作为药物靶点…
25
2. 分离方法
在实验操作上，分为： •沉淀法 •离心法 •电泳法 •超滤法 •相分配法 •层析法
26
27
•Note
*不可能有一套统一的方法适用于分离纯 化所有的蛋白质，
*但每一种蛋白质可能都有一套适合的分 离纯化程序，
*而且所用的主要技术手段都基本相同。
28
二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
23
1.6吸附性质
• 原理 蛋白质可吸附在不同材料的表面，如金属、 陶瓷、塑料等。
• 方法
▫ 疏水层析
24
1.7变性和复性
• 原理
▫ 变性：蛋白质在一定的理化条件下会失去原有 的空间结构、生物学功能及部分理化特性。
▫ 复性：当变性条件去除后恢复原有的空间结构 及生物学功能。
• 方法
▫ 如，利用尿素的变性和复性方法，从包涵体中 纯化原核表达蛋白
蛋白表达及纯化ppt课件
蛋白表达及纯化
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
Part 1: 蛋白表达、纯化
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA
2. 表达宿主
3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
Host
Cellfree Bacteri al
Yeas t
Mammalia n
0.60 0.50 0.40
Protein preparation, extraction, clarification
Cell growth, protein overexpression Cell lysis Removal of cell debris
From: Protein Purification Handbook. Amersham Biosciences. 18-1132-29, Edition AC
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。 b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。 c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。
pET system manual, Novagen, 11th Edition
X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化
1：0mmol/L； 2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L； 4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L； 6：1.5mmol/L； 7：2.5mmol/L； 8：3.5mmol/L； 9：5.0mmol/L。 图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化
1：蛋白marker；2~9：分别用IPTG 诱导表达 0、1、 2、3、4、6、8、12 h。
GFP蛋白的表达分离与纯化PPT课件
• OD600=0.6-0.8，加入诱导剂； • OD600=1.2-1.4，收获菌体；
• 诱导剂用量 IPTG: 0.2mM; 0.5mM; 1mM
• 诱导温度 20℃；25/28 ℃；37 ℃
留样——set control
• 如何留样能在一张SDS-PAGE胶图中(10-12 wells)体现诱导的效果、(NH4 )2SO4粗分离效果、疏水层析纯化效
试验流程
GFP表达质粒的转化（pGLO→Top 10） GFP的表达（ 阿拉伯糖） GFP的分离（硫酸铵沉淀法）
疏水相互作用层析 离子交换层系 凝胶过滤层析 SDS-PAGE检测纯化效果
考核形式
• 课堂提问——每人2-3个问题；权重：30% • 总结报告——PPT，5人一组，10分钟；权重：30% • 实验报告——权重：40% 要求：标准的论文格式：中、英文标题和摘要；前言；材料与方法；结果；讨论；参考文献。
37cultureconditionscultureconditions242526如何留样能在一张sdspage胶图中1012wells体现诱导的效果nh42so4粗分离效果疏水层析纯化效果离子交换层析纯化效果凝胶过滤层析纯化效果setcontrolsetcontrol2728hichic293035ieciec36373839gfcgfc404142样品体积对分辨率的影响样品体积对分辨率的影响4344
E.Coli host
• BL21(DE3), BL21(DE3, pLysS), Origami, Rosetta, Rosetta-gami • Top10, HB101, C41/C43
思考：
• 能否用BL21(DE3)表达pGLO？ • 能否用Top10 表达pET32a ？Leabharlann ulture conditions
• 诱导剂用量 IPTG: 0.2mM; 0.5mM; 1mM
• 诱导温度 20℃；25/28 ℃；37 ℃
留样——set control
• 如何留样能在一张SDS-PAGE胶图中(10-12 wells)体现诱导的效果、(NH4 )2SO4粗分离效果、疏水层析纯化效
试验流程
GFP表达质粒的转化（pGLO→Top 10） GFP的表达（ 阿拉伯糖） GFP的分离（硫酸铵沉淀法）
疏水相互作用层析 离子交换层系 凝胶过滤层析 SDS-PAGE检测纯化效果
考核形式
• 课堂提问——每人2-3个问题；权重：30% • 总结报告——PPT，5人一组，10分钟；权重：30% • 实验报告——权重：40% 要求：标准的论文格式：中、英文标题和摘要；前言；材料与方法；结果；讨论；参考文献。
37cultureconditionscultureconditions242526如何留样能在一张sdspage胶图中1012wells体现诱导的效果nh42so4粗分离效果疏水层析纯化效果离子交换层析纯化效果凝胶过滤层析纯化效果setcontrolsetcontrol2728hichic293035ieciec36373839gfcgfc404142样品体积对分辨率的影响样品体积对分辨率的影响4344
E.Coli host
• BL21(DE3), BL21(DE3, pLysS), Origami, Rosetta, Rosetta-gami • Top10, HB101, C41/C43
思考：
• 能否用BL21(DE3)表达pGLO？ • 能否用Top10 表达pET32a ？Leabharlann ulture conditions
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Part 1: 蛋白表达、纯化
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA 2. 表达宿主 3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
E. coli
rapid (30 min) low
high refolding may be
required no
no no no no no low
Yeast
rapid (90 min) low
low – high refolding may be required high mannose
yes yes yes yes no low
c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。
d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。
e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸 的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Host
Cell-free
Bacterial
Yeast
Mammalian Insect
Expression System Characteristics 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
终止子
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
a: 如果在克隆基因编码区的3末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够 阻止转录通读过位于下游另一个启动子
b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 , 那么由该启动子驱 动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
保护碱基 内切酶1 目的基因 内切酶2 保护碱基
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
X gene
complex
yes yes yes yes yes high
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
一：大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Vector
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件 1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10% - 30%以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平 3 ) 应该是诱导型的, 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。 常用的大肠杆菌表达载体启动子：
λ噬菌体的PL启动子 大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子 色氨酸操纵子trp启动子 pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。
b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。
c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Characteristics
doubling time cost of growth medium expression level protein folding
N-linked glycos.
O-linked glycos. phosphorylation acetylation acylation g-carboxylation project cost
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。 追踪某些特定的DNA结构 (重组质粒 )是否已经导 入寄主细胞 同任何一种目的启动子连接Байду номын сангаас, 其表达活性可作为 检测启动子功能的依据。
β－半乳糖苷酶基因lacZ 荧光素酶基因 (luciferase )基因、 半乳糖激酶基因(galK ) 氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因 (cat ) 四环素抗性基因 (tetr ) Tag-
二 大肠杆菌表达载体的基本组成
一个良好的大肠杆菌表达载体： 复制起点(ori) 多克隆位点。 筛选标记（抗菌素抗性基因、Tag、筛选标记） 控制和调节转录与翻译的必不可少的原件
外源基因在原核寄主细胞中表达, 它的编码结构 必须是连续的, 不间断的, 处于寄主启动子有效 控制下。
启动子
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Insect
slow (18-24 hrs) high
low – high proper folding
simple, no sialic acid yes yes yes yes no
middle
Mammalian
slow (24 hrs) high
low – moderate proper folding
引物的设计：设计一对特异性 引物。上游、下游引物引入酶 切位点
oligo6
RNA提取：TRNzol（附件）
RT-PCR：附件
1：DNA marker；2：X 基因扩增产物 图1.1 X基因的RT-PCR扩增产物
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
蛋白表达流程
1. 目的基因cDNA 2. 表达宿主 3. 载体 4. 设计引物 5. 连接转化 6. 诱导表达 7. 蛋白纯化 8. 鉴定保存
gene
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
E. coli
rapid (30 min) low
high refolding may be
required no
no no no no no low
Yeast
rapid (90 min) low
low – high refolding may be required high mannose
yes yes yes yes no low
c: 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。
d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 , 阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。
e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个U而形成四联核苷酸 的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Host
Cell-free
Bacterial
Yeast
Mammalian Insect
Expression System Characteristics 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
终止子
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
a: 如果在克隆基因编码区的3末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够 阻止转录通读过位于下游另一个启动子
b: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 , 那么由该启动子驱 动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
保护碱基 内切酶1 目的基因 内切酶2 保护碱基
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
X gene
complex
yes yes yes yes yes high
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
一：大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序 , 共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Vector
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件 1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10% - 30%以上 2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平 3 ) 应该是诱导型的, 能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。 常用的大肠杆菌表达载体启动子：
λ噬菌体的PL启动子 大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子 色氨酸操纵子trp启动子 pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子
转译起始序列
a: mRNA的5末端之独特的结构特征, 是决定mRNA转译起始效率的主 要因素。
b: 在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起 始序列。
c: 未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Characteristics
doubling time cost of growth medium expression level protein folding
N-linked glycos.
O-linked glycos. phosphorylation acetylation acylation g-carboxylation project cost
筛选标记: 其编码产物可被快速测定的功能单元。 追踪某些特定的DNA结构 (重组质粒 )是否已经导 入寄主细胞 同任何一种目的启动子连接Байду номын сангаас, 其表达活性可作为 检测启动子功能的依据。
β－半乳糖苷酶基因lacZ 荧光素酶基因 (luciferase )基因、 半乳糖激酶基因(galK ) 氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因 (cat ) 四环素抗性基因 (tetr ) Tag-
二 大肠杆菌表达载体的基本组成
一个良好的大肠杆菌表达载体： 复制起点(ori) 多克隆位点。 筛选标记（抗菌素抗性基因、Tag、筛选标记） 控制和调节转录与翻译的必不可少的原件
外源基因在原核寄主细胞中表达, 它的编码结构 必须是连续的, 不间断的, 处于寄主启动子有效 控制下。
启动子
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
Insect
slow (18-24 hrs) high
low – high proper folding
simple, no sialic acid yes yes yes yes no
middle
Mammalian
slow (24 hrs) high
low – moderate proper folding
引物的设计：设计一对特异性 引物。上游、下游引物引入酶 切位点
oligo6
RNA提取：TRNzol（附件）
RT-PCR：附件
1：DNA marker；2：X 基因扩增产物 图1.1 X基因的RT-PCR扩增产物