病毒的血凝及血凝抑制试验[医学参照]
实验四血凝和血凝抑制试验
3. 0.85%生理盐水. 4. 被检血清,采自被检鸡的血清.
四、操作步骤 〔一血凝试验〔HA
1. 在血凝板第一排的1~12孔加入50μl生理盐水. 2. 在第1孔中加入50μl病毒抗原,反复吸取混匀后
〔Hemagglutination and Hemagglutination
Inhibition, HA and HI
动物病原学实验之六
一、实验目的
掌握血凝和血凝抑制试验的原理,以及使 用该试验测定血清抗体水平的操作步骤和结 果判定方法.
二、实验原理
〔一血凝试验〔HA
➢ 有些病毒能够促使某些动物〔如鸡、鹅、豚鼠、 绵羊和人的红细胞发生凝集,这就是红细胞凝集 现象,称做血凝试验.
以50%的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度 作为血凝价的终点,即一个血凝单位.
〔二血凝抑制试验〔HI
1. 在血凝板的1~12孔加入50μl生理盐水,最后一孔加 100μl.
2. 第1孔加入待检血清50μl,混匀后吸50μl至第2孔,倍比 稀释直至第10孔,混匀后弃50μl.
3. 从1~11孔,每孔加稀释好的50μl 4个血凝单位的病毒悬 液.
放映结束 感谢各位的批评指导！
谢 谢！
让我们共同进步
➢ 象各种脑炎病毒、口蹄疫病毒等,凝集红 细胞的条件很严格,对红细胞的种类有很 严格的选择,同时还要掌握反应的pH和温 度等.
〔二血凝抑制试验〔HI
➢ 当病毒悬液中加入特异性抗体时,这种红 细胞凝集的现象就被抑制,称做红细胞凝 集抑制试验,也叫血凝抑制试验.
HI试验的原理图
病毒血凝与血凝抑制实验报告
病毒血凝与血凝抑制实验报告一、实验目的病毒血凝与血凝抑制实验是一种常用的病毒学检测方法，旨在检测病毒的血凝活性以及血清中特异性抗体的存在和滴度。
本次实验的主要目的是：1、熟悉病毒血凝与血凝抑制实验的基本原理和操作流程。
2、掌握检测病毒血凝活性的方法，并确定病毒的血凝效价。
3、运用血凝抑制实验检测血清中特异性抗体的水平，为疾病的诊断和防控提供依据。
二、实验原理1、病毒血凝现象许多病毒表面具有血凝素，能够与红细胞表面的受体结合，使红细胞发生凝集。
这种现象称为病毒血凝现象。
不同的病毒血凝素与红细胞结合的特异性不同，因此可用于病毒的鉴定和分类。
2、血凝抑制实验当血清中存在特异性抗体时，抗体能够与病毒表面的血凝素结合，从而阻断病毒与红细胞的结合，抑制血凝现象的发生。
通过系列稀释血清，以能完全抑制血凝现象的最高血清稀释度作为抗体的血凝抑制效价。
三、实验材料与设备1、实验材料病毒悬液：本次实验使用的是_____病毒悬液。
红细胞：选用新鲜的鸡红细胞或豚鼠红细胞。
标准阳性血清和阴性血清。
待检血清。
2、实验设备微量移液器。
96 孔 V 型微量反应板。
离心机。
恒温箱。
四、实验步骤1、病毒血凝效价的测定用 PBS 缓冲液将病毒悬液进行 2 倍系列稀释，从 1:2 至 1:256，共11 个稀释度，每个稀释度设 2-3 个重复孔。
在 96 孔 V 型微量反应板中，每孔加入25μL 稀释好的病毒液。
向每孔中加入25μL 1%的红细胞悬液，轻轻振荡反应板，使病毒液和红细胞充分混合。
将反应板置于 37℃恒温箱中孵育 30-60 分钟，观察血凝现象。
以出现“＋＋”凝集的最高稀释度作为病毒的血凝效价。
2、血凝抑制实验对待检血清进行 2 倍系列稀释，从 1:2 至 1:256，共 11 个稀释度。
在 96 孔 V 型微量反应板中，每孔加入25μL 稀释好的待检血清。
向每孔中加入25μL 4 个血凝单位的病毒悬液，轻轻振荡反应板，混合均匀，置 37℃恒温箱中孵育 30 分钟。
血凝及血凝抑制实验
实验原理基于病毒与抗体结合 后，改变了红细胞的抗原性，
从而影响血凝过程
实验结果可用于病毒的分离、 鉴定和抗体效价测定等
实验材料
血凝抑制抗体 病毒抗原 受检血清 红细胞
实验步骤
准备试剂和器材：包括血凝试剂、抗体、离心机、试管等。 采集样本：采集待检测动物的血液样本。 抗体处理：将抗体与待检测样本混合，孵育一定时间。 离心分离：将混合液离心，分离出凝集块。 结果观察：观察凝集块的数量和大小，判断实验结果。
实验结果
添加 标题
实验原理：血凝抑制实验的原理是利用抗原抗体反应的特异性，通过加入抗体来抑制血凝反应的发生，从而 检测出血液中是否存在相应的抗体。
添加 标题
实验步骤：血凝抑制实验通常包括加样、加抗体、观察结果等步骤。在实验过程中，需要严格控制实验条件， 以保证实验结果的准确性和可靠性。
添加 标题
实验结果分析：根据实验结果，可以判断出被检测样本中是否存在相应的抗体。如果血凝反应被抑制，则说明被检测样本中 存在相应的抗体；如果没有出现血凝反应或者血凝反应没有被抑制，则说明被检测样本中不存在相应的抗体。
诊断试剂开发：利用 血凝及血凝抑制实验 检测血液中的病毒抗 体，辅助临床诊断
在食品科学领域的应用
食品安全：评估食品中细菌、 病毒等微生物的污染程度
食品加工：检测食品中病原 微生物的含量
食品质量控制：监测生产过程 中的卫生状况，确保产品质量
食品科学研究：为食品科学 领域的研究提供数据支持
在其他领域的应用
评估风险：对于需要进行手术或特殊治疗的患者，血凝及血凝抑制实验可以评估其出 血风险
科学研究：在医学研究中，血凝及血凝抑制实验可用于研究凝血机制、药物作用等方 面
血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)
一、目的要求 掌握HA和HI试验的基本操作技术，了解其实用价值。 二、实验材料 1、禽流感毒 2、1%鸡红细胞 3、生理盐水 4、禽流感阳性血清 5、96孔“V”型微量反应板 三、实验内容 1、HA试验术式表： 2、HI试验术式表： 四、作业 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？ 2、HI试验是不是特异的抗原抗体反应？为什么
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25
1： 2 1： 4 1： 8 ﹟ 以100%凝集病毒最大稀释孔为该病毒的凝集价
血凝抑制试验(HI)
一、概念： 1 、 HI 试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。 2、抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体 效价。
病毒的红细胞凝集试验（HA）
一、 概念 病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞 表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。 二、应用 1 、当以被检动物的某一器官为病料，进行HA试验，结果为阳性者，证明 该被检材料中有能凝集红细胞的某种病毒。 2 、凝集价的测定：将被检病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行 HA试 验，出现血凝现象的各稀释孔中，以100%能出现病毒的红细胞凝集现象的 病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价(血凝价)
二、动物体内抗体存在情况 1、当动物感染某病毒而发病时，可在机体的相应器官查出病毒。
2、病毒相当于免疫效应物质中的抗原，病毒进入动物机体，将发生特异
性免疫反应，即产生免疫物质——抗体（ 90%抗体都存在于动物的血清 中），抗原和抗体发生特异性结合反应 3、病畜体内，因受病毒抗原刺激，产生大量相应抗体，故体内抗体效价 较高 4、健康动物，免疫接种后，因受疫苗（抗原）刺激，而发生免疫应答反 应，体内抗体效价较高
血凝和血凝抑制实验
3、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul
4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分 钟
5、结果判定
医学课件ppt
7
血凝效价测定
医学课件ppt
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结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释 倍数为该抗原的血凝价（1:128）？？？ 。
25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一 个血凝单位。
医学课件ppt
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血凝抑制试验
1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32）
2、在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水；
3、在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第 10孔，最后弃25ul；
医学课件ppt
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注意事项
• 1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢， 以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡 红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄 色，之后直至清亮为清洗干净）。
• • 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸
取干净。
医学课件ppt
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1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而 稍向孔底集中，即75％凝集；
3、 ＋＋：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块， 即50％凝集；
4、 ＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四 周稍有凝集块，即25％凝集；
5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即 无凝集。
医学课件ppt
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01实验一 病毒血凝和血凝抑制试验
弃 去 25
25 25
振荡混 合后 37℃ 1030min 振荡混 合后 37℃ 45min
血清
25
25
25
25
25
25
25
25
25
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1%红 细胞
25
25
25
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25
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25
25
25
25
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结果
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
抑制 价
32
16
8
4
2
1
1：21
1
孔号
1
原液
2
1：21
3
血抑制试验（HI） 4 5 6 7 8 9 10
1：23 1：24 1：25 1：26 1：27 1：28 1：29
11 12
1： 210
备注
稀释 度 生理 盐水
1：22
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病毒 液
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从上一稀释孔的混合液中吸取25 μ L致下一孔
三、实验材料 新城疫病毒液0.1mL 1%鸡红细胞50mL 生理盐水50mL 阳性血清0. 5mL 96孔“U”形或“V”形微量反应板 25μ L定量移液管 滴头
四、实验内容及操作程序 1．血球凝集试验（HA） 以新城疫病毒为例，操作 过程如下（表10-1） • （1）在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至 右各孔加25μ L生理盐水。 • （2）于左侧第1孔加25μ L病毒原液或收获液，混 合均匀后，吸25μ L至第2孔，混合均匀后，吸 25μ L至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃 25μ L，稀释后病毒稀释度为第1孔1:2，第2孔1:4， 第3孔1:8……。最后1孔为对照。
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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病毒的血凝试验名词解释
病毒的血凝试验名词解释病毒的血凝试验是一种常见的检测方法，用于确定病毒感染的存在以及病毒类型的鉴定。
该试验利用了人体免疫系统对病毒的免疫反应，通过检测血浆中的凝集反应来判断病毒感染的有无。
本文将对与病毒的血凝试验相关的一些术语进行解释。
1. 血凝试验（Hemagglutination）：血凝试验是一种常用的免疫学方法，通过观察红细胞的凝集反应来判断病毒的存在。
在病毒感染的情况下，病毒可以使得红细胞发生凝集现象，从而形成一种网状结构。
这种凝集反应可以帮助医生确定病毒感染的类型和程度。
2. 血凝抑制试验（Hemagglutination Inhibition Assay）：血凝抑制试验是一种用于确定病毒感染的抗体的存在与否以及抗体的效力的方法。
在这个试验中，医生将不同浓度的病毒抗原加入患者血浆样本中，观察其中是否出现了病毒凝集反应。
如果患者的血浆中存在与病毒抗原相结合的特异性抗体，那么这些抗体会与病毒抗原结合，并阻止病毒与红细胞产生凝集反应。
通过检测凝集反应的程度，可以评估患者血浆中的抗体效力及抗体的浓度。
3. 血凝试验凝集效价（Hemagglutination Titer）：血凝试验凝集效价是用来表示血浆中抗体浓度的方法。
凝集效价通常以最高稀释度的倒数来表示，也就是需要将血浆稀释到什么程度才能抑制病毒凝集。
凝集效价越高，表示血浆中的抗体浓度越高，对病毒的抵抗能力也就越强。
4. 血凝图谱（Hemagglutination Curve）：血凝图谱是在血凝试验中绘制的一种图形，用于表示血浆稀释度与血凝反应之间的关系。
血凝图谱的横轴通常表示血浆的稀释度，纵轴表示血浆与病毒的凝集反应的程度。
通过绘制血凝图谱，可以评估不同血浆样本的抗体效力以及浓度的分布情况。
这样的图形有助于医生判断病毒感染的程度，病程的演变以及抗体的持续时间等信息。
血凝试验作为病毒感染的常用检测方法，在临床医学中扮演着重要的角色。
通过观察红细胞的凝集反应，医生可以准确判断患者是否感染了病毒，并进一步确定病毒的类型。
实训九 病毒的血凝及血凝抑制试验(ok)
实训九 NDV的血凝及血凝抑制试验（微量法）目的要求熟练掌握病毒的血凝及血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，明确其应用价值。
仪器及材料pH7.2生理盐水、1％鸡红细胞悬液、NDV、新城疫病毒待检血清、微量血凝板（96孔V型板）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、离心机、天平、注射器。
方法与步骤（一）病毒的血凝（HA）试验1．1％鸡红细胞悬液的制备（1）采血先在注射器中吸入抗凝剂（3.8％枸橼酸钠液）1ml，采成年健康鸡血，心脏或静脉采血3-4ml。
（2）离心洗涤共3次，每次2000r/min，5min，每次离心后弃去上清液和白细胞，仅留纯的红细胞，最后读出红细胞的体积。
（3）配制用生理盐水将纯的红细胞稀释成体积比为1%的红细胞悬液。
2．操作术式振荡1min，室温(18℃～20℃)下作用30～40min,或置37℃恒温培养箱中作用15～30min观察结果（1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl。
（2）NDV病毒液倍比稀释换吸头，吸取50μl病毒液，加于第1孔的生理盐水中，并用移液器吹打3～5次使液体混和均匀，然后取50μl移入第2孔，混匀后取50μl移入第3孔，依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出50μl弃去。
第12孔不加病毒抗原，作盐水对照。
（3）加1%红细胞悬液换吸头，1-12孔，每孔中分别加入50μl。
加样完毕，振荡1min ，室温（18～20℃）下作用30～40min ，或37℃恒温箱中作用15～30min ，观察并判定结果。
3．结果判定及记录完全凝集（＋）：红细胞呈伞状分布于反应孔底层。
伞完全不凝集（－）：红细胞呈点状沉淀于反应孔底层。
点不完全凝集（±）：介于＋与－之间。
病毒的血凝价（或称血凝滴度）：能使一定量红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度，或称血凝价。
（二）病毒的血凝抑制（HI ）试验采用同样的血凝板，每排孔可测1份血清样品。
试验四血凝及血凝抑制试验
血凝现象：有些病毒表面有血凝素，可凝集人,鸡,豚鼠等动物RBC。
原理：血凝素与RBC表面相应受体结合，引起RBC凝集；
用途：①滴定病毒的血凝效价，为血凝抑制试验做准备；
②确定病毒的存在；
凝集效价：能使血球产生++凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价，
即0.25 ml病毒液含1个血凝单位。在病毒血凝抑制试验中，一般用4个血 凝单位。
(1:64) 0.25
(1:128) (1:256) 0.25 0.25 0.25
0.5%RBC 0.25
(negative control) mix, RT, 45min~1hr，observation
血凝抑制试验
血凝抑制现象： 血凝素抗体使病毒失去凝集红细胞能力的现象。作
为临床检测试验，可用于检测血清中抗体含量或鉴 定病毒。称为血凝抑制试验。
(1:160) 0.25 0.5
(1:320) (1:10) 0.25 0.5 0.25(NS) 0.5 (Serum control)
V(4U)
0.25
0.5%RBC 0.5
Mix, RT, 1hr, observation
RBC凝集状态的解释
++++: agglutination of all RBC +++: agglutination of about 75% RBC
具体方法：
Tube
NS 血清 弃 0.25ml
1
0.45 0.05 (1:10)
2
3
4
5
6
7
0.45 0.05
↘
0.25 0.25
血凝和血凝抑制试验
3. 4.
பைடு நூலகம்
0.85%生理盐水。 生理盐水。 生理盐水 被检血清，采自被检鸡的健康血清。 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、操作步骤
（一）血凝试验（HA） 血凝试验（ ）
1. 在血凝板第一排的 在血凝板第一排的1~12孔加入 孔加入50µl生理盐水。 生理盐水。 孔加入 生理盐水 2. 在第1孔中加入 病毒抗原， 在第 孔中加入50µl病毒抗原，反复吸取混匀 孔中加入 病毒抗原 后吸50µl到第 孔，如此倍比稀释直到第 孔， 到第2孔 如此倍比稀释直到第10孔 倍比稀释直到第 后吸 到第 混匀后弃50µl； 最后两孔 （ 11、 12） 为红细 ； 最后两孔（ 、 ） 混匀后弃 胞对照。 胞对照。
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25
弃 50µl /
50 / / 50
25 50
注： 11孔为病毒对照 应该完全凝集， 12孔为细胞对照 孔为病毒对照， 孔为细胞对照， 1) 第 11 孔为病毒对照 ， 应该完全凝集 ， 第 12 孔为细胞对照 ， 应该完全沉积到孔底，只有当对照成立时试验结果方有效。 应该完全沉积到孔底 ， 只有当对照成立时试验结果方有效。 以红细胞100 凝集的稀释度为判定终点。 100% 2) 以红细胞 100% 凝集的稀释度为判定终点 。 血凝抑制滴度大 于等于1 为阳性，小于1 为阴性，等于2 为可疑。 于等于1：24为阳性，小于1：22为阴性，等于23为可疑。
病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开， 2 ） 病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开 ， 血凝素呈游离状态，例如天花 牛痘、 天花、 血凝素呈游离状态，例如天花、牛痘、鼠痘等 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 3 ） 脑炎病毒 、 口蹄疫病毒等 ， 凝集红细胞的条 脑炎病毒、 口蹄疫病毒等， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 同时还要掌握反应的pH和温度等。 同时还要掌握反应的pH和温度等。 pH和温度等
病毒血凝与血凝抑制实验报告
病毒血凝与血凝抑制实验报告一、实验目的本次实验旨在研究病毒的血凝现象以及血凝抑制反应，以深入了解病毒的特性和相关的免疫学机制。
通过实验，掌握病毒血凝与血凝抑制实验的操作方法和结果判断，为病毒的检测、诊断以及疫苗研发提供实验依据。
二、实验原理（一）病毒血凝现象某些病毒表面具有能够与红细胞表面受体结合的血凝素，从而使红细胞发生凝集。
这种凝集现象可以在显微镜下观察到，并且凝集的程度与病毒的浓度有关。
（二）血凝抑制反应当特异性抗体与病毒表面的血凝素结合后，会阻断病毒与红细胞的结合，从而抑制血凝现象的发生。
通过检测血清中抗体对血凝的抑制作用，可以判断血清中是否存在特异性抗体以及抗体的效价。
三、实验材料（一）病毒株选用已知血凝特性的病毒株，如流感病毒、新城疫病毒等。
（二）红细胞新鲜采集的鸡、豚鼠或人“O”型红细胞。
（三）血清待检血清和已知阳性、阴性对照血清。
（四）试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水等。
（五）器材96 孔微量血凝板、移液器、离心机、显微镜等。
四、实验步骤（一）红细胞悬液的制备1、采集新鲜血液，加入抗凝剂。
2、离心去除血浆，用生理盐水洗涤红细胞 3 5 次，直至上清液无色。
3、最后用生理盐水将红细胞配制成 1%的悬液备用。
（二）病毒血凝滴度的测定1、在 96 孔微量血凝板中，从第 1 孔至第 12 孔，每孔加入25μL PBS。
2、在第 1 孔中加入25μL 病毒液，然后从第 1 孔吸取25μL 病毒液至第 2 孔，依次倍比稀释至第 11 孔，从第 11 孔吸取25μL 弃去。
3、每孔加入25μL 1%红细胞悬液，轻轻振荡混匀，室温静置 30 60 分钟。
4、观察血凝结果，以出现“＋＋”凝集的最高稀释度作为病毒的血凝滴度。
（三）血凝抑制实验1、取已测定血凝滴度的病毒液，按照 4 个血凝单位/25μL 的量加入 96 孔微量血凝板的第 1 孔至第 10 孔，第 11 孔为病毒对照，第 12 孔为红细胞对照。
实训五病毒的血凝与血凝抑制试验.
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
主要内容
• 目的要求 • 仪器及材料 • 方法与步骤 • 结果判定 • 注意事项
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
一、目的要求
熟练掌握病毒的血凝与血凝抑制试验 （微量法）的操作方法及结果判定，明确其 应用价值。
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
二、仪器及材料
pH7.2、0.01mol/L PBS或生理盐水、3.8%枸橼酸钠、新城 疫病毒液、离心机、天平、1％鸡红细胞悬液、新城疫病毒 液、新城疫病毒待检血清、新城疫标准阳性血清、新城疫 标准阴性血清、微量血凝板（V型96孔）、微量移液器（带 吸头）、微型振荡器、温箱、注射器。
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
结果举例
上图:血凝价为7log2或1：128
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
（二）4V配制： HA价除以4即为4HAU抗原的稀释倍数。假设HA
价为256，则4HAU抗原的稀释倍数为64，吸取1mL 抗原加入63mL生理盐水即为4HAU抗原。
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
血凝抑制试验结果规律
完全不凝集：红细胞呈明显纽扣状沉于孔底 不完全凝集：介于两者之间
完全凝集：红ห้องสมุดไป่ตู้胞呈伞状均匀分布于孔底
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
结果举例
上图：第三排血凝抑制滴度为7Log2
实训五 病毒的血凝与血凝抑制试验
四、注意事项
• 微量移液器的正确使用，保证量取液体量准确。 • 使用1%红细胞之前首先混匀。 • 勿忘试验中抗原对照孔和生理盐水对照孔的设立。 • 反应的温度和时间控制好。
血凝和血凝抑制实验
一、重要性
01 有效预防动物疫情的发生 02 有效判断动物疫情发生的原因 03 有效推动动物免疫程序的制定
二、检测内容和方法
检测内容
猪
猪瘟 O型口蹄疫 A型口蹄疫 地方病：蓝耳、细 小、圆环、伪狂犬、 乙脑
羊
O型口蹄疫 小反刍兽疫
牛
O型口蹄疫 A型口蹄疫
鸡
禽流感 新城疫
用已知抗原来检测被检血清中有无相应的特异性抗体和滴 定该特异性抗体的水平。
血凝试验：某种病毒的血凝素， 能使鸡、鹅或人的红细胞发生凝 集，叫做血凝试验，也称直接血 凝反应，利用这种特性设计的试 验称血凝试验 (HA) 。
常见于正粘病毒、副粘病毒和某 些黄病毒、痘病毒等。
目的：测定病毒的血凝效价，采用 一定的病毒量，通常采用4个血凝 单位
2.采血完毕后将血加入至10ml离心管中，加3-4倍体积生理盐水以 2000~3000r/min，5~10min离心3-5次。
3.弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液， 上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心 弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。
阿氏（Alsevers）液配制
称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散 热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌， 4℃保存备用。
1%红细胞的配制：
1.为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应最好 选择采取3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。（抗凝剂与 血液比例为1:4）
血凝试验（HA)原理：
血凝抑制试验（HI）原理
病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)
生理盐水 病毒液 25「 25卩1\25^125^1 25 ”1 25g1 2 25gl 4 25g1、25g1 Q5 25^1 25 卩1弃去实践二病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：1 •掌握血凝（HA 和血凝抑制（HI ）试验的原理2 •掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理：某些病毒（如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与人或动物的红细胞发生凝集， 此即为 红细胞凝集现象。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体 （免疫血清）所抑制, 即为红细胞凝集抑制试验。
实践内容：1.红细胞凝集试验（HA 试验）主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数（抗原单位）。
有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法，在 V 形微量反应板上进行。
（1） 首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴 （25卩I ）。
（2）用微量移液器取病毒抗原液 25卩1加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25^1液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25 ^1液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2〜1:2048，第12孔为红细胞对照。
（3） 再以微量移液器每孔加1.0 %红细胞悬浮液1滴（25卩I ）。
（4） 在振荡器上振荡混匀约 I 〜2分钟，再置37 C 作用15分钟后观察结果。
（5）每次测定样品都应同时做红细胞对照。
表1鸡新城疫血凝效价（HA ）的测定术式（微量法）孔号1 234567891011 12病毒稀释倍数 1:2 1:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048 对照1%红细胞悬液 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 感作 置振荡器上混匀1〜2分钟，放37 C 静置15分钟结果例示 # # # # # # # ++ - - - -表示%完全凝集 表示%凝集 表示不凝集结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀, 表明红细胞未被或不完全被病毒凝集； 如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
病毒的血凝及血凝抑制试验
病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。
通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
[目的要求]掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
[材料与试剂]1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50?L定量移液器，滴头，微型振荡器。
2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]（一）血球凝集(HA)试验1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50?L生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50?L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50?L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50?L；第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50?L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：?L）弃504. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。
红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。
从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二) 血球凝集抑制(HI)试验1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
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病毒的血凝及血凝抑制试验
有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性
设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)
试验，具有特异性。
通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病
毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
[目的要求]
掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
[材料与试剂]
1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50μL定量移液器，滴头，微型振荡器。
2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]
（一）血球凝集(HA)试验
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50μL生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50μL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50μL
至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50μL；第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50μL，在振荡器上振荡，室温
下静置后观察结果（表4-1）。
表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：μL）
弃50
4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。
红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。
从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二) 血球凝集抑制(HI)试验
1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50μL生理盐水。
3. 第１孔加被检鸡血清50μL，吹吸混合均匀，吸50μL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50μL，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 ……；第12孔加新城疫阳性血清50μL，作为血清对照。
4. 自第1孔至12孔各加50μL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。
5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50μL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。
表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：μL）
6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清
对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。
以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。
凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。
从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。
附录
1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液
枸橼酸钠（5H2O） 0.80g
枸橼酸（H2O） 0.055g
葡萄糖 2.05g
氯化钠 0.42g
双蒸水加至 100 ml
将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。
2. 0.5% 鸡红细胞制备方法
先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1／5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5% 鸡红细胞悬液。
3. 96孔微量反应板的清洗
将浸泡有75% 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。