第四章 蛋白组学概论及其研究方法
蛋白质组学研究方法与实验方案
蛋白质组学研究方法与实验方案1. 什么是蛋白质组学？好吧，咱们先聊聊什么是蛋白质组学。
想象一下，咱们的身体就像一个精密的机器，每个部件都有它的角色，而这些部件就是蛋白质。
蛋白质组学，简单来说，就是研究这些蛋白质的科学。
通过它，我们能够了解它们的结构、功能，以及它们在身体里是如何相互作用的。
就像侦探破案一样，蛋白质组学帮我们解开生命的奥秘。
真是既神秘又有趣，尤其是当你发现一些小细节时，那种“啊哈！”的感觉，简直让人兴奋得想跳起来！2. 蛋白质组学的研究方法2.1 样本准备首先，样本准备可是一门艺术。
你不能随便拿个东西就往实验室一扔，这样可不行哦！一般来说，样本可能是血液、细胞或者组织。
准备这些样本时，注意卫生和安全，搞得像开派对一样，干净利索才行。
样本收集后，我们需要把它们冷藏，保持它们的新鲜度，毕竟没人想要一份过期的蛋白质套餐，对吧？2.2 蛋白质提取接下来，我们进入蛋白质提取的阶段。
想象一下，像是在厨房里做大餐，首先要把食材准备好。
提取蛋白质就像把牛肉从牛排里切下来，一刀切下去，油油的鲜香就出来了。
我们用各种化学试剂，像是盐酸、乙醇这些，来分离出蛋白质，得小心别让它们变成一团糟。
处理得当，才能确保后面的分析顺利进行。
3. 蛋白质分析3.1 质谱分析然后就是蛋白质分析环节。
这时候，质谱仪就像一位高级侦探，能够识别出蛋白质的身份。
你可以把质谱想象成一个超级厉害的放大镜，它能让我们看到蛋白质的分子量和结构。
分析结果能告诉我们这些蛋白质的种类、数量，甚至还可以了解它们的相互作用。
哇哦，真的是一门高科技的艺术呢！3.2 数据解读最后，我们得对数据进行解读。
就像读一本悬疑小说，刚开始可能没看懂，但越往后看越有趣。
这个过程需要耐心和细心，数据可能会让你感到困惑，但一旦你理解了其中的奥妙，简直就像解开了一个千古之谜。
通过这些数据，我们能够找到疾病的潜在标志物，或者探索新药物的目标，真是让人感到自豪的工作！4. 实验方案小贴士当然啦，在整个实验过程中，有几个小贴士可以帮助你事半功倍。
蛋白质组学研究的主要内容和方法
蛋白质组学研究的主要内容和方法蛋白质组学，听起来好像个高深的学问，实际上呢，它就是研究蛋白质这个“小家伙”的一门学问。
咱们都知道，蛋白质是构成生命的基本单位，没了它，咱们可就没法运转了。
想象一下，蛋白质就像是咱们身体里的小工人，负责着各种各样的任务，比如说修复受损的细胞、推动新陈代谢、甚至调节咱们的情绪。
是的，情绪！那可不是开玩笑的，很多时候，咱们的心情波动跟体内的蛋白质水平有着千丝万缕的关系。
说到蛋白质组学，首先得提到它的主要内容。
它就是要搞清楚各种蛋白质在不同的环境、不同的细胞里是怎么工作的，怎么互相配合的。
想想一场大合唱，歌手们得配合得天衣无缝，才能唱出美妙的旋律。
而在身体里，这些蛋白质就像是合唱团里的每一个成员，各自有各自的角色。
如果有哪个成员跑偏了，整个合唱就得打折扣。
所以，蛋白质组学研究的目的，简单说，就是要弄清楚这些小工人们的工作状态，看看谁在忙活，谁又在偷懒。
再说方法，蛋白质组学的工具可真是五花八门。
有的像个大魔法师，能把成千上万种蛋白质一锅端；有的则像个细心的小侦探，能分析出每个蛋白质的结构和功能。
提到的就是质谱分析，这玩意儿就像是一台超级放大镜，能把蛋白质拆得干干净净，然后告诉你它们的分子量。
你想啊，这就好比是你去市场买菜，摊贩告诉你每种菜的价格，哪个贵哪个便宜，心里就有数了。
还有一种常用的方法叫做二维电泳。
说白了，就是把蛋白质分成两部分，一部分按照电荷，另一部分按照分子量。
就像是把水果按颜色和大小分类，最后你就能清楚地看到每种蛋白质的“长相”，多有趣啊！还有西方印迹法，也就是我们俗称的“WB”，这玩意儿就像是在给蛋白质做个身份登记，看看它们是不是干净，是否有被污染的可能。
再说说蛋白质组学的应用，真是多得让人眼花缭乱。
咱们可以通过研究某种疾病的蛋白质变化，找到新的治疗方案。
这就像侦探破案，蛋白质的变化就好比是罪犯留下的线索。
比如说，研究癌症的蛋白质组学，科学家们就能从肿瘤细胞中找到异常蛋白，进而开发出靶向治疗药物，真是了不起！想想看，这不仅能拯救无数生命，还能让患者重拾希望，太神奇了。
蛋白质组学的研究方法和进展
蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质是细胞中最重要的一类生物大分子，不仅构成生物体的大部分物质，而且参与多种生物过程。
在生物学的研究中，蛋白质组学就是广泛用于研究蛋白质及其解析结构、功能和相互作用的一种技术。
蛋白质组学技术的不断发展，为科学家们提供了更广阔的研究领域和更深入的认识和理解。
一、蛋白质分离技术蛋白质在细胞中有着多种不同的类型和数量，分离这些蛋白质对于进一步的研究至关重要。
凝胶电泳是一种最早应用于蛋白质分离的技术，在这一技术中，蛋白质被分离到一条凝胶条中，并且能够根据其分子量进行鉴定。
近年来，液相色谱技术得到快速发展，以逆相高效液相色谱（RP-HPLC）为主的技术广泛应用于蛋白质的分离、富集和纯化中。
二、蛋白质鉴定技术现代蛋白质组学技术的特点是高通量、高分辨率、高灵敏度和准确率。
鉴定样品中的所有蛋白质非常复杂，多组学技术的整合在蛋白质组学的研究中显得尤为重要。
代表性的鉴定技术是质谱法，可将蛋白质析出后离线或在线进行鉴定。
其中，MALDI-TOF 质谱技术是蛋白质鉴定中的重要方法之一，该技术使用激光脱附离子化（MALDI）策略以减少化学修饰和分离过程对蛋白质结构的影响。
三、蛋白质表达技术从DNA转录到蛋白质翻译的过程，是生物体逐步实现功能的一个重要环节。
蛋白质表达技术是在外部体系中重现这一过程的有效方法，在研究中应用极为广泛。
常见的蛋白质表达系统有大肠杆菌、酵母、哺乳动物等，其中，大肠杆菌是最常用的单细胞表达体系。
近年来，蛋白质表达与修饰的转化药学已经成为一个热门领域，各种新型表达体系也层出不穷。
四、蛋白质数据分析鉴定蛋白质，只是蛋白质组学研究的第一步，有关数据分析和解释的关键环节，对于进一步的研究显得尤为重要。
目前，由于蛋白质比较庞大并且互相之间联系复杂，因此数据分析技术的不断发展就格外重要了。
从最初的数据搜索和标识，到后来的蛋白质序列分析、结构预测、功能预测和网络分析等，蛋白质数据分析技术已经成为蛋白质组学研究的重要环节。
蛋白质组学PPT课件
代谢性疾病蛋白质组学研究通过对糖尿病、肥胖症等代谢 性疾病相关蛋白质的分析，发现了一些与代谢过程密切相 关的关键蛋白质。这些蛋白质涉及糖代谢、脂肪代谢等多 个方面，为药物研发和个体化治疗提供了新的思路和靶点 。同时，对代谢性疾病蛋白质组学的研究也有助于深入了 解疾病的发病机制，为疾病的预防和治疗提供科学依据。
蛋白质组学揭示基因表达 的复杂性
蛋白质组学研究关注基因表达的最终产物蛋白质，揭示了基因表达的复杂性和多样性 。蛋白质的表达和功能受到多种因素的影响 ，如翻译后修饰、蛋白质相互作用等，这些
因素在基因组学研究中难以全面考虑。
蛋白质组学与代谢组学的关系
代谢组学为蛋白质组学提供上下文
代谢组学研究生物体内小分子代谢物的变化，为蛋白质组学提供了上下文和背景。蛋白 质的功能和表达往往与代谢物的变化相互关联，了解代谢物的变化有助于更深入地理解 Nhomakorabea02
蛋白质组学研究技术
蛋白质分离技术
双向凝胶电泳技术
通过改变电泳的pH值和电场强度， 将复杂的蛋白质混合物分离成多 个有序的蛋白质带，以便后续的 鉴定和分析。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在固相支持物上， 通过与特定的配体或抗体相互作 用，实现对蛋白质的快速、高通 量筛选和检测。
蛋白质免疫沉淀技
术
利用抗体与目标蛋白质的特异性 结合，将目标蛋白质从复杂的混 合物中分离出来，常用于蛋白质 相互作用的研究。
详细描述
癌症蛋白质组学研究通过对癌症细胞和正常细胞蛋白 质表达谱的比较，发现了一系列与癌症发生发展相关 的关键蛋白质。这些蛋白质涉及细胞信号转导、细胞 周期调控、细胞凋亡等多个方面，为癌症治疗提供了 潜在的药物靶点。
案例二：神经退行性疾病蛋白质组学研究
蛋白质组学研究方法
2. 蛋白质的分离
2D-DIGE中内标的重要性
以样品中的蛋白点与其内 标的比值作为其定量数据
使不同凝胶之间的点的分 析和定量更加精确
使不同凝胶之间的匹配更 加可信
使实验间的误差与样品之
分间析的说明差：异区分开来
1)在没有内标的情况下，我们通过AB两
块胶的分析，会得出结论： 图中红色圆
环所标记的蛋白质点在处理组(样品3和
样品4)表达量增高；
2)通过内标的校正，我们可以证明，这
实际上是由凝胶之间的误差造成的，并
不是样品之间的真实差异。
2x4x
2. 蛋白质的分离
多维液相色谱
亲和色谱（AC） 离子交换色谱（IEC） 反相高效液相色谱（
RP-HPLC）
顺序使用基于不同物理化学
。
凝胶
丙烯酰胺缓冲
液: CH2=CH-
CO-NH-R,
1x4x
R ：羧基或叔
2. 蛋白质的分离
不同pH和长度的IPG胶（以BIO-
RAD的ReadyStrip™ IPG 胶条为例）
相对聚焦功率表示在使用不同长度或 pH 范围的 IPG 胶条时，在第一维中预 期获得的增强的分辨率。 为 7 cm pH 3–10 IPG 胶条任意分配基线聚焦功率 1.0 以便计算其他胶条的相对聚焦功率
x6 x
1.
蛋白质组学简介
蛋白质调控及功能实现的复
杂性 DNA
Riboso me
tRN A mRN A Polypeptide
Protei n
x7 x
1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究特点
x8 x
1. 蛋白质组学简介
蛋白质组学研究内容
蛋白质组学的研究方法
蛋白质组学的研究方法蛋白质组学是运用先进的分析技术，通过对细胞内的蛋白质分子进行检测、分离、同位素标记与定量等方法，研究不同细胞型、组织型、发育阶段以及病变状态等生物样本中蛋白质组成及其功能性调控的科学。
它是一门综合性学科，既涉及生物化学、蛋白质工程、分子生物学等学科，也涉及信息学及计算机科学等学科，运用了各种生物学技术和数学模型，将复杂的生物体蛋白质组织成一个有机的整体，从而更好地了解蛋白质的结构与功能关系。
蛋白质组学的研究方法主要包括：一、蛋白质分离与鉴定：蛋白质分离是蛋白质组学的基础步骤，其目的是从生物样本中提取蛋白质。
常用的技术包括凝胶电泳、膜分离、微萃取、液相色谱法以及离心分离等。
蛋白质分离之后，还需要进行鉴定，以获得蛋白质的名称及其细胞定位等信息，以便进行后续研究。
常用的方法包括凝集试验、蛋白质印迹、Western blotting、质谱分析以及二级结构分析等。
二、定量蛋白质组学：定量蛋白质组学是指利用有效的检测技术，对生物样本中的蛋白质进行定量分析，以便获得蛋白质组成及其功能性调控情况的精确信息。
定量蛋白质组学技术主要包括酶标记蛋白质定量、质谱定量以及流式细胞蛋白质定量等。
三、蛋白质组学的应用：蛋白质组学的研究结果可以用来研究基因调控、细胞信号转导、疾病机理等方面的问题。
它可以帮助研究人员更好地理解生物的复杂性，并为有效的治疗策略的制定提供重要的参考和指导。
它还可以用于研究新型药物的研究和开发，为疾病的治疗提供新的思路。
蛋白质组学的发展前景广阔，它不仅可以用于解决当前生物学上的实际问题，还可以为未来的研究提供重要的科学研究基础。
随着技术的进步和数据量的增加，蛋白质组学技术将会为生物学研究带来更多的惊喜和发现。
蛋白组学定量蛋白质组学.ppt
2
常用研究方法
以质谱技术为基础的化学标记定量方法 荧 光 差 示 双 向 凝 胶 电 泳 技 术 （ F－2D－
质量变化依赖于氮原子数目，因此对未 知的蛋白质难以进行定量。
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（二）稳定同位素标记的必需氨基酸体 内标记(SILAC法)
高等动物细胞的生长中需要一些必需氨基酸的摄入，如赖氨酸 (Lys)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)等，这些氨基酸细胞自身 无法合成，需要从外界摄入补充。
在培养细胞时，可以在培养介质中特异的加入用稳定同位素标 记的某一种必需氨基酸，在经过适当的培养时间后，细胞中合 成的含有这类氨基酸的蛋白质几乎都掺入了标记的氨基酸 。
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MCAT策略流程：定性
Lys只在Trypsin酶切后的末端，所以产生的b离子都没有被修饰；所有的y 离子带Lys，因此被修饰。
在MS/MS图谱上，所有的b离子是单一条带出现，所有的y离子是成对出现， 丰度比例一样，且相差同样的m/z。
容易区分b离子和y离子，容易读出氨基酸序列。
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MCAT策略流程：定量
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–COOH羧基标记
通过对羧基酯化进行 标记
用H和D标记的甲醇酯 化标记，来定量研究 蛋白质表达量的差异
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羧基酯化标记进行蛋白定量研究
比例＝2 : 1
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缺点：
特异性不是很好，在C末端和Asp和 Glu残基上都有标记，且效率不均
采用的标记条件容易引起天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺(Gln)的去酰胺
蛋白质组学的研究方法和进展
蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质组学的研究方法主要包括样品制备、质谱分析以及数据分析三个阶段。
在样品制备阶段，研究人员需要选择合适的方法来提取和纯化蛋白质。
常用的方法包括差凝蛋白法、电泳法、柱层析法等。
质谱分析是蛋白质组学的核心技术，主要有两种方法：质谱图谱分析和质谱定量分析。
质谱图谱分析可以通过比对已知蛋白质的质谱图数据库来鉴定未知蛋白质；质谱定量分析可以测定样品中各个蛋白质的数量变化。
数据分析是蛋白质组学研究的关键环节，用于解读大量的质谱数据。
近年来，蛋白质组学的研究取得了诸多重要进展。
首先，高通量质谱技术的发展使得大规模蛋白质组学研究成为可能。
比如，液相色谱和质谱联用技术（LC-MS/MS）可以同时检测数千种蛋白质，大大提高了鉴定和定量蛋白质的效率和准确性。
其次，全蛋白质组学的研究范围不断拓展。
除了研究细胞蛋白质组，研究人员还开始探索组织蛋白质组和生物体蛋白质组等更高层次的组学研究。
通过研究这些复杂组织中蛋白质的种类和功能，可以深入了解细胞和生物体的复杂生理和病理过程。
此外，蛋白质组学也开始向单细胞水平的研究发展，可能为研究细胞发育、疾病药物靶点等方面提供新的突破口。
蛋白质组学在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景。
通过深入了解蛋白质组的变化和相互作用，可以揭示细胞和生物体的生理和病理过程，为疾病的早期检测和诊断提供重要依据。
蛋白质组学也可以用于发现新的疾病标志物、筛选新药靶点以及评估药物的疗效和安全性。
此外，蛋白质组学还可以用于研究生命起源、进化以及各种生物学过程的分子机制。
总之，蛋白质组学的发展必将为生命科学研究带来更多的突破和进展。
蛋白质组学研究方法
蛋白质组学研究方法
蛋白质组学是研究生物体内蛋白质的全套表达、结构和功能的科学，是继基因组学之后的又一门重要的生物学研究领域。
蛋白质组学的研究方法主要包括蛋白质的分离与富集、质谱分析、蛋白质组数据分析等几个方面。
首先，蛋白质的分离与富集是蛋白质组学研究的第一步。
蛋白质在生物体内分布广泛，种类繁多，含量不等，要想全面了解蛋白质组的情况，就需要对蛋白质进行分离和富集。
目前常用的蛋白质富集方法有凝胶电泳、液相色谱、免疫沉淀等，这些方法可以根据蛋白质的特性和研究的目的来选择合适的方式进行富集。
其次，质谱分析是蛋白质组学研究的核心技术之一。
质谱技术可以对蛋白质进行高效、灵敏的检测和定量分析，目前主要包括质谱仪器的发展和质谱数据的分析两个方面。
质谱仪器的发展使得蛋白质的鉴定和定量分析变得更加精准和高效，而质谱数据的分析则需要借助生物信息学等多学科知识进行综合分析，以获得更加准确和全面的蛋白质组数据。
最后，蛋白质组数据的分析是蛋白质组学研究的最终目的。
通过对蛋白质组数据的分析，可以揭示生物体内蛋白质的表达规律、结构特征和功能作用，为生命科学研究提供重要的信息和数据支持。
蛋白质组数据的分析需要借助生物统计学、生物信息学等多学科的知识和方法，以实现对大规模蛋白质组数据的挖掘和解读。
综上所述，蛋白质组学研究方法包括蛋白质的分离与富集、质谱分析和蛋白质组数据分析三个方面，这些方法的综合应用可以为我们深入了解生物体内蛋白质的表达、结构和功能提供重要的技术支持，推动生命科学领域的发展和进步。
蛋白质组学及研究方法
蛋白质组学及研究方法质谱法是蛋白质组学中最重要的分析方法之一、常用的质谱法有两大类，一类是基于质谱仪直接测定蛋白质的质量和序列信息，如质谱仪联用液相色谱法（LC-MS）和二维凝胶电泳结合质谱法（2-DE-MS）；另一类是基于质谱法间接测定蛋白质的表达水平和修饰信息，如蛋白质组学差异凝胶鉴定法（DIGE）和蛋白质组学激光解吸电离质谱法（MALDI-TOF）。
质谱法的基本原理是通过将蛋白质分子化为离子，在质谱仪中进行分离和检测。
质谱仪的常见类型有基于时间的质谱仪（TOF）、静电荧光质谱仪（ESI）、磁性质谱仪（FT-ICR）等。
质谱法可以通过测定蛋白质的质量和碎片信息来确定蛋白质的序列和修饰状态。
免疫检测是蛋白质组学中常用的方法之一，用于检测特定蛋白质在生物体中的表达水平和定位信息。
免疫检测可分为传统免疫学方法和现代免疫学方法两大类。
传统免疫学方法包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫印迹和免疫组织化学等。
现代免疫学方法包括流式细胞术、免疫磁珠法和免疫表观遗传学等。
生物信息学分析是蛋白质组学中的重要环节。
通过生物信息学分析，可以从大量的蛋白质组学数据中提取有用的信息，如蛋白质相互作用网络、信号通路分析和功能注释等。
常用的生物信息学工具和数据库有NCBI、UniProt、STRING和Kegg等。
蛋白质组学的研究方法还包括蛋白质组分离和富集技术、蛋白质组学数据库和蛋白质组学分析软件等。
蛋白质组分离和富集技术可用于从复杂的蛋白质混合物中提取特定蛋白质或蛋白质家族，并进行进一步的分析。
蛋白质组学数据库和蛋白质组学分析软件可用于存储和分析大规模的蛋白质组学数据，并帮助研究者解释实验结果。
总之，蛋白质组学是一门综合性研究领域，涉及蛋白质的分析、鉴定、定位和功能等方面。
通过质谱法、免疫检测和生物信息学分析等方法，可以更好地理解蛋白质在生物体内的功能和调控机制，为生物医学研究和药物开发提供重要的技术支持。
蛋白质组学及其主要研究方法
蛋白质组学及其主要研究方法摘要:蛋白质组学是对机体、组织或细胞的全部蛋白质的表达和功能模式进行研究。
蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化，对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。
本文就蛋白质组学研究所使用的主要技术如二维凝胶电泳、质谱、酵母双杂交系统、生物信息学等进行了相关综述。
关键词：蛋白质组学；双向凝胶电泳；质谱；酵母双杂交；生物信息学Proteomics and its main research techniquesAbstract:Proteomics aims at the analysis and identification of entire proteins present in the cell tissue or the organism, and of the functions and the linkage of these proteins.the proteome of an organism is dynamic.It changes with the intro and outer stimulus.The study on proteomics can make us easily know how the vital progress goes. The article will introduce these tech-niques of proteomics such as two-dimensional gel electrophoresis、mass spectrometry、two-hybrid system and bioinformatics etc.Key words: Proteomics;Two-dimensional gel electrophoresis;Mass spectrometry;Two-hybrid system; Bioinformatics众所周知,始于20世纪90年代初的庞大的人类基因组计划业已取得了巨大的成就，人类基因组序列草图已经绘制完成[1]。
蛋白质组学的研究方法
第23卷 第6期内蒙古民族大学学报(自然科学版)Vol.23 No.6 2008年11月Journal of I nnerMongolia University for Nati onalities Nov.2008蛋白质组学的研究方法3张树军,狄建军,张国文,魏永春(内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽 028000)〔摘 要〕蛋白质组学是后基因组时代出现的一个新兴研究领域,具有巨大的商业应用前景,将会推动整个生命科学的发展.本文对蛋白质组学的定义和主要使用的研究方法作一简要介绍.〔关键词〕蛋白质组学;研究方法;后基因组时代〔中图分类号〕Q51 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1671-0185(2008)06-0647-03The Research M ethods of Proteo m i csZ HANG Shu-jun,D I J ian-jun,ZHANG Guo-wen,W E I Yong-chun(College of B i oche m istry,I nnerMongolia University for Nati onalities,Tongliao028000,China)Abstract:Pr oteom ics is a ne w research area of the post-genome era,W hich has a great p r os pect ofcommercial app licati on,and will advance the devel opment of bi ol ogy.This article makes a conciseintr oduce about the definiti on and research methods of p r oteom ics.Key words:Pr oteom ics;Research method;Post-geno me era21世纪将是生命科学的世纪.随着人类基因组测序计划的完成,生命科学的重心开始转移到对基因的表达产物-蛋白质的研究上,蛋白质组学遂成为后基因时代的研究前沿和热点领域.后基因组时代中,生命科学的中心任务是阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能,即生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质组学.蛋白质组研究便是其中一个很重要的内容.因为蛋白质是基因功能活动的最终执行者,是生命现象复杂性和多变性的直接体现者,因此人类要揭示整个生命活动的规律,就必须研究蛋白质,只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究,才能更贴近对生命现象和本质的掌握,生命活动的本质和活动规律才能找到答案.1 蛋白质组学的定义蛋白质组(Pr oteome)是1994年由W ilkins首先提出,它是指一种基因组或一种生物、一个细胞组织所表达的全套蛋白质〔1〕.它与基因组相对应,也是一个整体的概念.蛋白质组学(Pr oteom ics)以蛋白质组为研究对象,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律.蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式.蛋白质组学的研究内容主要有两方面:结构蛋白质组学和功能蛋白质组学.结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究,包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析.功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究,包括蛋白质的功能和蛋白质间的相互作用.蛋白质的功能模式的研究是蛋白质组学研究的最终目标,目前主要集中在蛋白质组相互作用网络关系的研究.3收稿日期:2008-05-17作者简介:张树军(1980-),男,内蒙古科右中旗人,助教,硕士,从事生物化学方面的研究.内 蒙 古 民 族 大 学 学 报2008年8462 蛋白质组学研究方法2.1 双向凝胶电泳双向电泳(T wo di m ensi onal gelelectr ophoresis,2-DE)技术的基本原理一是基于蛋白质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦,二是根据分子量的不同大小进行S DS-P AGE分离,把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开〔2〕.双向凝胶电泳的第一向是等电聚焦I EF,根据蛋白质等电点(P I)的不同进行第一次分离;第二向是S DS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据蛋白质分子量不同进行分离.双向电泳技术具有其他技术不可比拟的蛋白质高分辨率,是蛋白质组学研究中最常用的核心技术之一.以双向即二维凝胶电泳技术和质谱技术为基础的蛋白质组学研究程序为:样品制备→等电聚焦→聚丙烯酰胺凝胶电泳→凝胶染色→挖取感兴趣的蛋白质点→胶内酶切→质谱分析确定肽指纹图谱或部分氨基酸序列→利用数据库确定蛋白.差异凝胶电泳(differential in-gelelectr ophoresis,D I GE)是为改进双向电泳的重复性和灵敏度,最近发展的一种荧光染料标记的双向电泳技术即差异凝胶电泳,其方法是将两种样品中的蛋白质采用不同的荧光标记后混合,在同一凝胶内进行电泳.因此,可以对来自正常组织和癌变组织的样品蛋白质表达差异进行分析.与常规的双向电泳技术比较,D I GE更加简单,劳动强度降低,效率更高〔3〕.2.2 生物质谱技术质谱技术的基本原理是在样品离子化后,根据不同离子质荷比(m/z)的不同进行分离并确定相对分子量,具有灵敏度高、准确度高且易于实现自动化等优点〔4〕.已取代了传统的蛋白质鉴定方法(如Ed man降解法、氨基酸分析法等),成为蛋白质鉴定分析的主要支撑技术.生物质谱还可应用于定量蛋白质组分析、蛋白质翻译后修饰(如糖基化、磷酰化)以及蛋白质相互作用等研究领域.但质谱法还存在固有的局限性,如Leu和Ile、Lys和Gln不能区别;有些多肽的固有序列不能用质谱法测定;无法区分分子量和带电电荷相同的同分异构体;仪器较为昂贵.2.3 生物传感芯片质谱生物传感芯片质谱是定性和定量检测蛋白质间相互作用并对其进行鉴定的简便而快捷的方法〔5〕.它是以表面等离子激原共振SPR为基础的生物分子相互作用分析技术与质谱技术有机结合而形成的新型技术,核心是生物传感芯片,以玻璃作为支持物,上面结合有羧甲基葡聚糖聚合物,通过化学修饰可将特定蛋白质肽固定在葡聚糖聚合物上形成传感片,当待测蛋白质或肽溶液通过微射流卡盘流过该固相载体时,与固相蛋白质肽发生相互作用的蛋白质(肽)被滞留在聚合物的表面上,而芯片表面蛋白质含量增加导致入射光的折射率改变,使其表面等离子激原共振光的共振角发生改变,该变化与表面蛋白的含量呈线性关系.生物分子相互作用分析技术是进行蛋白质相互作用分析的较好技术.该法可用于筛选功能性蛋白质,并可在蛋白质水平筛选基因的多态性,从而能有效地将基因与蛋白质结合在一起.2.4 I C AT技术同位素标记亲和标签(Is ot ope Coded Affinit Tags,I CAT)技术目前已成为蛋白质组研究的核心技术之一.它是在质谱技术的基础上发展起来的一种定量质谱法,能够精确地分析不同样品中蛋白质表达量的差异,从而使蛋白质组学真正成为一种差异显示技术〔6〕.此技术是用具有不同质量的小分子试剂I CAT去标记处于不同状态下的细胞中的蛋白质,再利用串联质谱技术,就能非常准确地比较出两份样品中蛋白质表达水平的不同.I CAT技术的优点在于它可以对混合样品进行直接测试而不需分离,能够迅速地定性和定量鉴定低丰度蛋白质,故可用于快速临床诊断.但I C AT技术也面临一些问题:无法检测不含半胱氨酸的蛋白质;半胱氨酸残基必须位于易处理的位置上;很难得到蛋白质磷酸化等翻译后修饰的信息存在特异性吸附、不可逆吸附和容量低的缺点.2.5 蛋白质芯片蛋白质芯片是用于研究蛋白质组功能模式的一种鉴定方法〔7〕.其原理是利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用,检测分析蛋白质.蛋白质芯片是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术.它是指在硅物质如玻璃等固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵,通过如抗原-抗体专一性结合等各种相互作用,可特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析.蛋白质芯片上的探针蛋白可根据研究的目的不同,选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性、高度特异性和亲和性的蛋白质.2.6 酵母双杂交系统酵母双杂交系统是目前研究蛋白质组中蛋白质间相互作用的一个重要手段,其基本思路是只有靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,其中的诱饵蛋白结合于报道基因的启动子才能启动报道基因在酵母细胞内的表达,通过检测报道基因表达产物判别作为“诱饵”和“靶蛋白”的两个蛋白间是否存在相互作用〔8〕.该技术的发展与创新,在蛋白质间相互作用的研究、新蛋白质筛选、蛋白质功能研究等诸多方面发挥着重要作用.2.7 噬菌体展示技术第6期张树军等:蛋白质组学的研究方法946将编码噬菌体外壳蛋白的基因上连接一个单克隆抗体的基因序列.当噬菌体生长时,表面就会表达出相应的单抗.将噬菌体过柱,检测单抗与柱上目的蛋白的特异性结合〔9〕.同酵母双杂交系统相比,噬菌体展示技术同样具有简便、高通量的优点,不同的是,反应在溶液中而不是在酵母细胞核中进行.另外,由于有些蛋白质本身有激活转录活性,不经过双杂交相互作用就能激活报道基因的表达,此时酵母双杂交系统不再适用,噬菌体展示则能很好地解决这个问题.但是噬菌体文库中的编码蛋白均为融合蛋白,可能改变天然蛋白质的结构和功能,其体外检测的相互作用可能与体内不符.2.8 串联亲和纯化(Tande m affinity purificati on,T AP)T AP技术的开发成为研究蛋白质相互作用的方法学上的巨大突破.该方法集成了经典的亲和纯化和免疫共沉淀这两种技术的优点,既可像前者得到高纯度、低拷贝数的蛋白质复合体,也继承了后者运用特异性的标记蛋白与亲和柱之间的相互作用,可快速地得到生理条件下与目标蛋白存在真实相互作用的蛋白质〔10〕.目前T AP技术与质谱技术的联用,以及质谱技术的自动化,使得大规模地分析相互作用的蛋白质在技术上成为可能.2.9 生物信息学方法生物信息学是在生命科学、计算机科学和数学的基础上逐步发展而形成的一门新兴交叉学科,是以理解各种数据的生物学意义为目的,运用数学与计算机科学手段进行生物信息的收集、加工、存储、传播、分析与解析的科学〔11〕.生物信息学在基因组学和蛋白质组学的研究中起到了特殊的重要作用,因为基因组和蛋白质组研究提供的数据的数量之巨大在生物学史上是史无前例的.而且,蛋白质组比基因组具有更大的复杂性,因而蛋白质组信息学更有挑战性.在后基因组时代,生物信息学的研究内容已经从对基因组和蛋白质组数据的高效分析,转移到比较基因组学、代谢网络分析、基因表达谱网络分析、蛋白质结构与功能分析以及药物靶点筛选等领域〔12〕.3 展望虽然蛋白质组学的研究方法很多,但每种方法都存在缺点.但随着科学技术的不断发展,蛋白质组学的研究技术会日益成熟.目前,已经出现了大量灵敏度更高、更有效的检测方法.色谱、质谱、芯片等技术现正得到普遍的应用.我们有理由相信,随着基因组研究的进一步拓展,蛋白质研究数据的不断积累,尤其是随着新技术方法的不断突破和生物信息学工具的日益完善,蛋白质组学必将取得突飞猛进的发展,相信随着全世界生命科学研究的持续快速发展,蛋白质组学及其研究技术必将成为21世纪的核心学科之一,并将切实而广泛地对人类生活带来巨大影响,为人类进步和发展做出更大的贡献.参 考 文 献〔1〕W ilkinsM R,Sanchez J C,Gooley A A,et al.Pr ogress with p r oteome p r ojects:why all p r oteins exp ressed by a genome should be identified and how t o do it〔J〕.B i otechnol ogy and genetic engineering revie ws,1996,13:19-50.〔2〕李义良,朱华清,张红锋.双向电泳技术〔J〕.生物学教学,2004,29(4):64-66.〔3〕黄丽俊,王建华.蛋白质组研究技术及其进展〔J〕.生物学通报,2005,40(8):4-7.〔4〕刘维薇,吕元.蛋白质组学研究技术及其临床应用〔J〕.中华检验医学杂志,2004,20:625-629.〔5〕Seong S Y.M icr oi m munoassay using a p r otein chi p:op ti m izing conditi ons f or p r otein i m mobilizati on〔J〕.Clin D iagn LabI m munol,2002,9(4):927-930.〔6〕Ong S E,M ann M.Mass s pectr ometry based p r oteom ics turns quantitative〔J〕.Nat Che mB i ol,2005,1(5):252-257.〔7〕BoguskiM S,Mcint osh M W.B i omedical inf or mati ons f or p r oteom ics〔J〕.Nature,2003,422(6928):233-237.〔8〕Ma J,Ptashne M.A ne w class of yeast transcri p ti onal activat ors〔J〕.Cell,1987,51(1):113.〔9〕Sidhu S S,Fairbr otherW J,Deshayes K.Exp l oring p r otein-p r otein interacti ons with phage dis p lay〔J〕.Che mbi oche m, 2003,4(1):14-16.〔10〕程永升,刘进元.串联亲和纯化(T AP)技术在蛋白质组学中的应用〔J〕.生物化学与生物物理进展,2004,31(4): 379-382.〔11〕陈铭.后基因组时代的生物信息学〔J〕.生物信息学,2004,2(2):29.〔12〕Englbrecht,C C,Facius A.B i oinf or matics challenges in p r oteom ics〔J〕.Comb Che m.H igh Thr oughout Screen,2005, 8(8):705.〔责任编辑 徐寿军〕。
蛋白质组学及其研究方法与进展
蛋白质组学及其研究方法与进展蛋白质是生命活动的体现者，基因的表达最后是通过蛋白质来体现的，在这个过程中，蛋白质起了连接基因与表现的功能。
蛋白质是有氨基酸组成的，组成蛋白质的氨基酸的种类及排列顺序构成了蛋白质的一级结构，而在一级机构基础上的多肽链本身的折叠和盘绕方式构成了蛋白质的二级结构，考虑到多肽链上原子在空间的分布，由二级结构进一步形成了蛋白质的三级结构，对于有多个亚基的蛋白质还存在四级结构。
蛋白质的一级结构决定了高级结构，而高级结构则决定着蛋白质的生物学功能。
如今对于蛋白质研究已经单独形成了一个活跃的生物学分支学科―――蛋白质组学，在蛋白质的研究中发挥着很重要的作用，下面将介绍蛋白质组学的一些基本内容及研究进展。
一.产生背景[1]在20世纪中后期随着DNA双螺旋结构的提出和蛋白质空间结构的解析，生命科学研究进入了分子生物学时代，对遗传信息载体DNA和生命功能的体现者蛋白质的研究，成为了其主要内容。
90年代初期启动的庞大的人类基因组计划．在经过各国科学家多年的努力下，已经取得了巨大的成就。
10多种低等模式生物的基因组序列测定L三完成；第一个多细胞生物一线虫基因组的DNA全序列测定也在1998年年底完成；人类所有基因的部分序列测定(EST)已经完成；人类基因组的全序列测定有可能提前到2003年完成。
生命科学已跨入了后基因组时代。
在后基因组时代，研究重心将从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对功能的研究。
这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。
如在mRNA 水平上，通过DNA 芯片(DNA chips)和微阵列(Microarray)法等技术检测大量基因的表达模式，并取得了很好的进展。
但是，mRNA的表达水平(包括mRNA的种类和含量)由于mRNA储存和翻译调控以及翻译后加工等的存在．并不能直接反映蛋白质的表达水平}蛋白质自身特有的活动规律，如蛋白质的修饰加工、转运定位结构形成、代谢、蛋白质与蛋白质及其他生物大分子的相互作用等．均无法从在基因组水平上的研究获知。
蛋白质组学及研究方法
计的分析蛋白质相互作用的方法。
以真核细胞转录激活因子的结构和活性特
点为基础。
22
酵母双杂交技术的基本原理
转录激活因子GAL4---BD：N端与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UASG)结合的结构域 AD：C端转录激活结构域
2．噬菌体表面显示技术
蛋白质组学及其 研究技术
1
蛋白质组学(proteomics)
指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门
新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内
动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰
状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭
示蛋白质功能与细胞生命活动规律。
2
蛋白质组实验室流程
3
4
2-DE原理
5
The 1st D: Isoelectric Focusing(IEF)
( phage display )
24
3. 免疫共沉淀耦联质谱技术
原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用 抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共 沉淀（immuno-precipitation，IP）纯化 靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后， 质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。
25
标签融合 蛋白沉淀 实验流程 示意图
白进行定性和定量分析。
29
100 µ g E. coli IPGphor pH 4-7 24 cm
ETTAN Dalt II 12.5 % T Novel buffer
12
二维电泳的重复性？
13
胶 内 差 异 显 示 技 术
满天星斗”中找出特别的星座？
A B
E. Coli grown at 30ºC
蛋白质组学的研究方法和进展ppt课件
双向电泳方法的主要步骤：
1. 样品准备 2. 第一向：固相pH梯度等电聚焦 3. 第二向：SDS-PAGE电泳 4. 染色： 考马氏亮兰或银染 5. 图像分析：肉眼或自动扫描
Isoelectric Focusing (IEF) with IPG strips
3-4 mm
遗传或药理学扰动的分子解剖 植物蛋白质组学
进 展（国际）
1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质 组研究中心（APAF）
美国NCI——肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的 蛋白质组数据库
NCI与FDA——有关癌症不同发病阶段和治疗 阶段的蛋白质组数据库
英国、法国、德国、日本等国也分别投入巨资 进行蛋白质组学的研究
70 - 240 mm
gel
Plastic backing
固相pH梯度等电聚焦电泳（第一向）示意图
Second Dimension: SDS-PAGE
IEF SDSPAGE
SDS-PAGE电泳（第二向）示意图
Expression Proteomics with 2D Gel Electrophoresis
进 展（国内）
国家自然科学基金委于1997年设立了重大项 目“蛋白质组学技术体系的建立”
1998年启动了蛋白质组学研究 中国科学院生物化学研究所、军事医学科学
院与湖南师范大学已启动蛋白质组研究 中国科学院上海生命科学研究院、军事医学
科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质 组学研究中心
科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国 “973”计划项目和“863”计划项目； 国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组 研究”列为重点项目。
Protein Identification
蛋白质组学研究方法与实验方案
蛋白质组学研究方法与实验方案随着科学技术的不断发展，蛋白质组学已经成为了生物医学领域中的一个重要研究方向。
蛋白质组学是指通过对细胞或组织中的蛋白质进行分析，来探究这些蛋白质在生物体内的作用和功能。
本文将从理论和实验两个方面，详细介绍蛋白质组学的研究方法与实验方案。
一、蛋白质组学的理论基础1.1 蛋白质的结构与功能蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其结构和功能密切相关。
蛋白质的结构决定了其功能的实现，而蛋白质的功能又反过来影响其结构。
因此，对蛋白质的结构和功能进行深入研究，有助于我们更好地理解蛋白质组学的本质。
1.2 蛋白质的分离与鉴定蛋白质的分离是蛋白质组学研究的基础。
目前常用的蛋白质分离方法有凝胶过滤、亲和层析、电泳等。
这些方法可以帮助我们将复杂的混合物中的蛋白质分离出来，并对其进行初步鉴定。
1.3 蛋白质的定量与分析蛋白质的定量与分析是蛋白质组学研究的核心环节。
目前常用的蛋白质定量方法有比色法、荧光法、电化学法等。
这些方法可以帮助我们准确地测定样品中蛋白质的数量，并对其进行进一步的分析。
二、蛋白质组学的实验方案2.1 实验材料与设备在进行蛋白质组学实验时，需要准备一系列的实验材料和设备，包括：(1)细胞样本：如人类血液、尿液、组织切片等。
(2)试剂：如酶、抗体、色谱柱等。
(3)仪器设备：如高效液相色谱仪(HPLC)、质谱仪(MS)、核磁共振仪(NMR)等。
2.2 实验步骤与流程蛋白质组学实验通常包括以下几个步骤：(1)样品处理：将细胞样本进行固定、脱水、去盐等处理。
(2)蛋白质提取：利用各种试剂从样品中提取出目标蛋白质。
(3)蛋白质纯化：通过柱层析、电泳等方法将目标蛋白质纯化至一定程度。
(4)蛋白质鉴定：利用各种技术手段对目标蛋白质进行鉴定，如比色法、荧光法、电化学法等。
(5)数据分析：利用统计学方法对收集到的数据进行分析，得出结论。
2.3 结果解读与讨论在完成实验后，我们需要对实验结果进行解读与讨论。
蛋白质组学的基本研究方法PPT课件
（3）还原剂用于断裂二硫键，常用的有DTT（二硫苏糖醇）、TDF （二硫赤藓糖）
和TBP（三丁基膦）
使用注意点：
样品离心前在室温下至小保持1小时，使完全变性和溶解；样品含尿素不可加热，
已防蛋白修饰；样品类型不同，选择裂解液的- 组成也不同。
12
（二）蛋白质分步提取技术
-
13
Sample Preparation
μg/ml DNase I 、 5 μg/ml RNase A 。
对大部分细胞提取，第一步与第二步往往出现相同的图谱，最后一步因
膜蛋白提取出来而完全不同。若先将细胞器分级提取，再联合上述方法，
效果将更好。
-
16
（三）亚细胞蛋白质的提取
1、细胞中亚细胞的分离
据蛋白的大小和密度的差异进行分离。细胞破碎后，先低速离心从胞质溶 液中分离出细胞核和未破碎的细胞，得到上清溶液；随后对上清溶液进行密 度梯度分离，得到线粒体、溶酶体等亚细胞器；然后对亚细胞内的蛋白质进 行分离提取。
-
3
2、蛋白质组学研究技术进展
（1）1975年，2-DE技术建立 （2）上世纪80年代，固相化pH梯度凝胶问世，使2D-E的重复性
和加样量改善 （3）上世纪末期，MALDI-TOF-MS和ESI-MS可精确测定相对分子
量和微量 （4）快速多肽序列 （5）90年代，多图象分析与大规模数据处理软件问世，复杂蛋
更多的离液剂进行清洗，可去掉与膜作用不强的非膜蛋白，从而富集膜蛋
白。另外膜蛋白通常位于两相去污系统中相对较丰富的一相。
B、摸蛋白的特性
低丰度、大多偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中。
C、为了从二维电泳凝胶图谱中分离出膜蛋白，首先必须服从三个条件
蛋白组学概论
编辑版ppt
28
编辑版ppt
29
特点
➢ 可分离10～100 kD分子量的蛋白质 ➢ 高灵敏度和高分辨率 ➢ 便于计算机进行图像分析处理 ➢ 与质谱分析匹配
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30
第一向IEF电泳
➢ 传统O’Farrell系统双向电泳的缺陷。
➢ Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯 度等电聚焦技术，GÖ rg等成功地将 之应用于双向电泳。
✓ 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多
✓ 未知的新蛋白质
✓ 数据库规模太小
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54Biblioteka 鉴定蛋白质的方法✓串联质谱技术(MS/MS)
是指多个质量分析器相连，分离母离子，进行碰
撞解离，并检测子离子。
即选择一定质量的离子通过一级质谱(MS1)，使 其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体(常用气体 为 He 、 Ar 、 Xe 、 CH4 等 ) 进 行 碰 撞 诱 导 裂 解 (collision-induced dissociation, CID)，发生离 子-分子碰撞反应，产生子离子，再经第二级质谱 (MS2)进行分析，最终导出肽序列。
蛋白质组proteome蛋白质组学proteomics指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门科学其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系揭示蛋白质功能与细胞生命活动之间的规律
蛋白组学概况
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1
1.蛋白质组学的概念及发展史
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49
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50
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51
鉴定蛋白质的方法
✓ 肽质量指纹图谱法（peptide mass fingerprinting， PMF） 对蛋白酶解后的多肽混合物进行质谱分析，与多肽 蛋白数据库中蛋白质的理论肽断进行比较，判断出 所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有 不同的氨基酸序列，不同蛋白质所得肽断具有指纹 特征。
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第四章蛋白质组学及其研
究方法概况
蛋白质组(proteome)由澳大利亚学者Williams和
Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质
(protein)与基因组(genome)两个词的组合，即”
一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质"。
蛋白质组对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，
不局限于一个或几个蛋白质。
在不同细胞和组织
中，同一基因组的表达情况各不相同，蛋白质组
在空间和时间上是呈动态变化的整体。
激光显微切割技术整合蛋白组学研究的操作流程
向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
iTRAQ技术原理图
iTRAQ试剂标记原理（4种标记）iTRAQ试剂包括3部分：
1.报告部分
2.肽反应部分
3.平衡部位
报告部分共有4种：质量数分别为114~117Da，最多可同时标记4组样品。
iTRAQ试剂结构
肽反应部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接，从而将报告部分
iTRAQ试剂标记原理（8种标记）iTRAQ试剂包括3部分：
1.报告部分
2.肽反应部分
3.平衡部位
报告部分共有8种：质量数分别为113~121Da，因此iTRAQ最多可同时标
iTRAQ试剂结构
记8组样品。
iTRAQ实验流程
iTRAQ实验流程。
收集不同组别的样本并分别提
1、收集不同组别的样本并分别提
取蛋白质；
2、蛋白质经过还原，封闭后用胰
蛋白酶酶切；
3、各组样本的肽段混合物分别用
不同的iTRAQ试剂标记；
4、等量混合各样本中的标记肽段；
5、MS/MS质谱检测及分析。
2、各组肽段分别用4种iTRAQ试剂
标记(例如对照组用iTRAQ 117标记，其他3个实验组分别用iTRAQ 114, 115, 116标记)；
3、标记好的各组样本等量混合，液相分离和质谱分析.
4、不同样本中蛋白质的差异表达可通过二级质谱中iTRAQ试剂的峰面
积确定，如图所示：与对照组相比，该蛋白在3个处理组(114-116)中的相对表达量较高。
5、根据该肽段的二级质谱峰图，结合数据库检索，得到蛋白的定性信息。
Label-free定量蛋白质组学
◆理论依据：蛋白质丰度与质谱数据一级谱
呈现定相关性
肽段峰强度或二级谱数目呈现一定相关性。
◆定量方法：1、信号强度法：基于一
级谱图母离子强度（谱图峰高、谱图峰
面积、谱图峰容量等）。
2、谱图计数
法：基于肽段匹配的二级谱图数目。
◆复杂的蛋白样品首先经过酶解形成肽
段，再经过广泛分级，由自动化的串联
质谱鉴定。
这种方法可以分析全细胞裂
解样品和组织抽提物，也可以分析亚细
胞分级组分、分离的细胞器等其他亚蛋
白质组。
举例比较：
莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtti) 是一种直径约10 μm的单细胞真核绿藻，
目前是生物燃料氢气，生物柴油和烃的原料。
•相比于高等植物，莱茵衣藻结构简单，生长迅速，遗传背景清晰，基因组测序已完
成，是科研中一种良好的模式生物。
•IF：4.2
成，是科研中种良好的模式生物。
•4组技术重复
•技术路线•90 ug •3ug •3ug •90 ug
•3ug •3组生物学重复
•A: 用以评估技术重复定量准确性（4组技术重复）
•B: 用以评估生物学重复定量准确性（3组生物学重复）
•蛋白定量值评估
✓在蛋白表达差异1-2.5倍范围内，iTRAQ 和Label free 定量结果均较为准确（红线标注范围）而在蛋白表达差异3-10倍范围内，iTRAQ 定量值与实际值相差较大（蓝线标注范围）。
•鉴定蛋白和定量蛋白数目比较
•技术重复•生物学重复
•921
•558
•639
•896
•128•210•329
•124✓Label-free 可比iTRAQ 多鉴定30-40%蛋白，多定量40-62%蛋白。
•iTRAQ 和Label free 定量相关性分析
•生物学重复鉴定蛋白数比较
•61%•67%
三次生物学重复，iTRAQ overlap蛋白比例为61%，Label free overlap蛋白比例为67%。
•GO注释分析比较
本研究中，富集于胡萝卜
素生物合成、谷胱甘肽代
谢、线粒体电子转运、核
小体组装、磷酸戊糖转运
等生物学进程的蛋白来自
于Label‐free方法。
蛋白质翻译后修饰的研究
蛋白质相互作用研究
翻译后修饰
抗
SDS-PAGE
切取
搜索数据库得到与。