牛血清白蛋白分离提纯工艺

课程设计说明书

课程名称：生物分离工程

设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺

院系：环境与化学工程学院

学生姓名：***

学号：41004020111

专业班级：10级生物工程01班

指导教师：***

2013年6月20日

目录

1.设计任务书 (1)

2.设计背景 (1)

2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1)

2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1)

3.设计原理 (2)

4.设计工艺流程及设计方案说明 (2)

4.1对原材料的粗分级分离 (3)

4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3)

4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3)

4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3)

4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3)

5.操作过程 (4)

5.1蛋白质分离的准备阶段 (4)

5.2细分级分离设备的设计 (4)

5.3蛋白质的纯度鉴定 (8)

6.参考文献 (8)

7.课程设计心得 (9)

1.设计任务书

现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。

2.设计背景

2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介

蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。

蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！

2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义

牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫

键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66200Da，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。

3.设计原理

采用等电点沉淀、凝胶过滤、亲和层析等方法对蛋白质进行分离提纯，对相关分离提纯所需条件可通过与电脑相连的方式进行精确控制，并在此基础设计相关仪器分离提纯蛋白质，在分离提纯过程中运用到的蛋白质一些性质：分子大小、溶解度、等电点、吸附特性等。

根据生物分离原则：先纯化，再脱盐，最后成品加工。初步纯化采用盐析沉淀法，高度纯化采用二维电泳。

盐析沉淀原理：蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

4.设计工艺流程及设计方案说明

4.1对原材料的粗分级分离

当蛋白质提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般该步分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。

4.2对粗分离成分进行细分级分离

这一步也就是样品的进一步纯化。样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法，还可以选用电泳、等电聚焦作为最后的纯化步骤。

等电聚焦电泳就是使电泳的介质中形成一定范围的pH梯度，电泳时待分离的两性分子可以在这种pH梯度中迁移，直到聚集于与其等电点相同的区域。该技术特别适用于分子量相近而等电点不同的蛋白质分离和分析。

我们在设计完成自己创新的蛋白质电荷分离仪时就是依据等电聚焦的相关原理完成的，因此等电聚焦电泳分离蛋白质就是我们设计分离蛋白质的基本依据。

4.3 蛋白的结晶与重结晶

结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤，结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某些蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。

4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定

蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法，如电泳、沉淀、HPLC和溶解度分析等。纯的蛋白质和还有杂质的蛋白质在电泳等测量时会表现出不同的动向故而能够进行纯度的鉴定。

4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程

工艺流程：动植物组织或细胞，细菌细胞裂解破碎→得到蛋白质提取液→通过盐析、等电点沉淀等方法除去其中的杂质→的到体积较小，杂蛋白较少的蛋白提取液→经过层析、电泳、等电聚焦等方法进一步分离纯化蛋白→结晶→重结晶→纯度的鉴定→纯度过低时重复以上几步操作→得到单一牛血清白蛋白

5.操作过程

5.1蛋白质分离的准备阶段

方法:盐析

其原理由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水变成了盐离子的水化水，那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可以利用的水分子，因此留下暴露出来疏水基团的蛋白质，随硫酸铵的进一步加入，蛋白质疏水基团进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集沉淀。

在上步溶有蛋白质的缓冲液内加入中性盐硫酸铵，随着硫酸铵的加入，当离子浓度足够高时，缓冲液中的蛋白质会沉淀下来，这样就得到了蛋白质的粗提物，这步主要利用了盐析原理。

通过以上两个步骤完成蛋白质的初级分离，为下一步细分级分离做好准备。

5.2细分级分离设备的设计

基于蛋白质分离的准备阶段，对所要的目的蛋白进行分离

创新设计仪器名称：蛋白质电荷分离仪