昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定医学PPT课件

ELISA抗体 体液免疫检测
中和抗体
细胞因子mRNA水平检测—qPCR 细胞免疫检测 细胞因子蛋白质水平检测—ELISA 淋巴增殖实验—MTT法
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ELISA抗体
1. 制备良好的抗原包被ELISA板—纯化的蛋白或病毒
（1）蛋白质与酶标板的结合主要是靠疏水作用的物理吸附，而包被液 的PH大于蛋白的PI，有利于蛋白质疏水键的适当暴露。 （2）酶标板聚苯乙烯表面暴露的主要是C－H键，包被液PH大于蛋白 PI，使蛋白质带上负电荷，有利于蛋白质与酶标板的牢固结合，提 高包被效率。
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杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
Subculturing：
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
每次包被板子条件一致， 4 ℃ 16-18h。 方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。
Байду номын сангаас
2. 血清样品不溶血，防止干扰结果。
3. 设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的 OD值先减掉背景值，再计算比值和滴度。
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中和抗体
微量中和实验技术
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中和实验原理
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分类
固定病毒—稀释血清法 固定血清—稀释病毒法（用的很少）
1. 细胞铺板5 ×106 cells/well，细胞计数要准，台盼蓝染 色，保证细胞活力≥ 95%。
2. 病毒稀释要准，不同浓度之间换枪头，是确保不同稀释 度孔斑点成10倍关系的关键。
3. 整个过程中，轻轻洗板，避免细胞脱落过多。 4. 实验完毕3 h后数斑，效果更佳。 5. 结果判定：
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疫 苗 免 疫 动 物 后 免 疫 效 力 评 价
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病毒扩增&蛋白表达
扩增病毒：接毒量为 0.05—0.1 MOI
一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106 — 1×107
PFU/ml， P2 代毒滴度1×107—1×108 PFU/ml
比如：P1代毒滴度为5×106 PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量
2×107cells，那么
蛋白表达：接毒量为 1—5 MOI
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
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Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
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Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
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Expermiantal outline
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昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
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获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变 慢或不增殖 脱落 或 融合(VSV/G) 裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
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重组pFastBac质粒的构建
选择合适的载体
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重组Bacmid的产生
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重组Bacmid的鉴定
Bacmid DNA ≥135kb
PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insert
杆状病毒表达系统 & 疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测
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杆 状 病 毒 表 达 系 统
昆虫细胞的培养
重组pFastBac质粒的构建
重组Bacmid的产生与鉴定 获得重组杆状病毒
蛋白表达&病毒扩大
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Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
用途
疾病诊断 病毒分离株的鉴定
不同病毒株的抗原关系研究
疫苗免疫原性的评 免疫血清的质量评价 测定实验动物血清中是否存在抗体
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材料
1. 病毒
（1）冻存的病毒不能重复使用 （2）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定 进行病毒定量
2. 血清样品
（1）血清样品分装冻存于-20℃ ，一般不要反复冻融3次以上。 （2）血清样品不溶血，不长期冻存，以减少对细胞的毒性。 （3）需要有阳性和阴性对照血清，实验前需56℃灭活30分钟。
Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five™ cells or Mimic™ Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达
Grace's Insect Medium with L-glutamine and
supplemented with（pH 6.5）：
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BacPAK™ Rapid Titer Kit
本测定方法，以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的 单克隆抗体标记被病毒感染的细胞，然后以HRP-标 记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色，在
光学显微镜下计数感染斑点的数量，经过稀释倍数
的换算，即可得出病毒的滴度（IFU/ml）。
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注意事项：
3330 mg/L lactalbumin hydrolysate 3330 mg/L yeastolate 350 mg/L NaHCO3 10% heat-inactivated fetal bovine serum
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昆虫细胞的培养
Atmosphere：air, 100%
Temperature：27.0—28.0 ℃
3. 细胞和细胞培养试剂
（1）对数生长期细胞 （2）DMEM/血清/胰酶/抗生素