目的基因的获取

目的基因的获取

实验报告

题目:单元一:目的基因的获取

指导老师:谭红铭张添元

日期:2013/10/17

一.实验目的:

(1)掌握总RNA的提取方法和技术

(2)了解总RNA的提取要注意的问题

(3)了解用RT-PCR法获取功能基因的原理

(4)学习和掌握RT-PCR的技术方法

二.实验原理:

(1)RNA提取:RNA在细胞中是与蛋白质结合在一起的。提取RNA时需先用强变性剂使蛋白质和DNA变性,同时抑制核糖核酸酶(RNase)的活性,然后通过有机溶剂如氯仿分层抽提去掉蛋白质和多糖等,最后通过RNA沉淀剂如异丙醇的帮助下沉淀分离RNA。

(2)RT-PCR:总RNA中的mRNA体外在反转录酶的作用下可合成与mRNA互补的单链DNA,称为互补DNA(cDNA),再在DNA聚合酶的作用下,以cDNA第一链为模板,以四种脱氧核苷酸(dNTP)为材料,在引物的引导下,合成大量双链DNA。

三.实验材料:

斑马鱼、Trizol Reagent(Invitrogen)、DEPC处理的超纯水、氯仿、异丙醇、无水乙醇、高速离心机、各种规格的RNase Free的枪头、EP管、RNase Free 的烧杯及量筒玻璃棒等、新开的大滤纸、碎冰及泡沫冰盒

四.实验准备:

由于实验过程中实验者手、臂上的细菌和真菌,人体自身分泌的RNase如手汗和唾液会带入试管或污染用具,使RNA降解,因而实验一开始就必须自始至终佩带口罩及乳胶手套,并经常更换。

五.实验步骤、现象、结果及分析:

Ⅰ总RNA提取:

⑴取斑马鱼一条,用滤纸吸干水,至于电子秤平内称重,为,后置于研钵,用大勺子往其中加入液氮,待其冷冻后,开始研磨,使其始终保持粉末状,由于液氮挥发,需补充液氮,直至彻底研磨至面粉状细末为止。

⑵在研钵内粗略将粉末分成三份,每份约80mg,再用液氮冷却过的小不锈钢勺子挑取其中一份加入预先装有1mlTrizol试剂的管中,剧烈震荡使之分散均匀,分装三份,标号1、2、3,本实验中由于存在小块凝结,因而使用移液枪吹打使之分散均匀。

⑶室温静置5min,待其反应完全,让Trizol充分作用,使核蛋白质解聚;

⑷加入200μl氯仿,剧烈震荡15sec,室温静置5min,可看到试管内分两层,上层透明水相层为RNA层,下层红色有机相为DNA和蛋白质层;

⑸使用高速离心机在12,000×g,离心15min,使分层彻底;

⑹小心吸取上层水相(含RNA)约500-600μl转移入另一干净离心管,使用200μl和100μl 枪头转移,宁少勿多,切勿吸到中间层。

⑺加入500μl异丙醇(沉淀RNA),轻柔颠倒多次混匀,室温静置10min;

⑻再次使用高速离心机在12,000×g,离心15min;

⑼取出试管后发现底部出现白色沉淀,小心用移液枪吸取上层废液,并用枪头吸干,加入500μl75%乙醇(需用RNase Free水配制)洗涤沉淀,轻柔颠倒几次;

⑽使用高速离心机在7,500×g,离心5min;

⑾小心用移液枪吸取上层废液,并用枪头吸干,在实验桌面垫上干净滤纸,将试管管口打开,平卧其上,另一滤纸盖在其上,室温下干燥,从一侧观察试管底部白色沉淀,待其刚好消失(透明)为止;

⑿加入30μlddH2O(RNase Free水)溶解,置冰上保存备用。

Ⅱ鉴定RNA纯度、浓度:

取3μl总RNA样品,直接加在检测仪的加样板其中一个孔上,吸头不能碰到加样板,以RNase Free水为空白对照,测定浓度及A260/A280。

表一:吸光度测定

组别A260A280A260/A280浓度(ng/μl)

1

2

3

由于260nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸和蛋白等有机物的值,当

A260/A280的比值介于时,我们认为RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的。本实验三组比值均介于该范围内,证明所提RNA纯度较高。

Ⅲ鉴定RNA完整性:RNA电泳检测:

(1)制备琼脂糖凝胶:称取琼脂糖1g,加入1×TAE缓冲液液中,带水合数分钟后,置微波炉中高火1min将琼脂糖融化均匀,加热时盖上封口膜以减少水分蒸发。

(2)将样品槽梳子插进托盘长边上的凹槽内(距一端约 ,梳齿底边与托盘表面保持的间隙。

(3)待凝胶溶液冷却至50℃左右时,轻轻倒入电泳制胶版上,除掉气泡。

(4)凝胶冷却凝固后,拔出梳子,将凝胶放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,使其液面刚高出琼脂糖凝胶。

(5)桌面铺一层薄膜,取RNA样品1μl,加RNase Free水3μl,SYBR Gold燃料1μl,6×Loading Buffer1μl,用枪头吹打混匀,后吸取加放凝胶点样孔中,点样孔靠近电源负极(黑色)一端,用120v电压电泳。

(6)电泳完毕,取出凝胶,在波长为254nm的紫外灯下观察染色后的电泳胶板,于凝胶成像系统中拍照并保存之,电泳照片如下图一所示:

1 2 3

28srRNA

18srRNA

图一:总RNA电泳示意图

由上图可以看出,2号组亮度较1、3组高,因其RNA浓度最大。2号组28s和18s条带明亮、清晰,并且28s的亮度在18s的两倍以上,证明RNA的完整性较好。1号组和3号组不太清晰,但28s的亮度约在18s的两倍以上。

Ⅳ逆转录PCR:

(1)反转录反应:

取事先按下表二实配量配制的反应液120μl混匀后分装PCR管,每管9μl,并加入各组别RNA样品1μl,放入PCR仪中,进行反转录反应。

表二:反转录反应体系

每管/组(μl) 实配(μl)

10×RT Buffer 1 12

MgCl2 2 24

dNTP Mixture(各10pmol/μl) 1 12

RNase Inhibitor 3

AMV Reverse Transciptase 6

6