甲基化实验步骤
tbs甲基化测序流程-概述说明以及解释
tbs甲基化测序流程-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容是对tbs甲基化测序流程进行简要介绍和概括。
可以按照以下内容进行撰写：在基因组研究中，甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式，它在基因表达、细胞分化和疾病发生发展等生物学过程中起着关键作用。
tbs甲基化测序流程是一种常用的研究甲基化模式的方法，通过高通量测序技术对甲基化的DNA分子进行检测和定量。
tbs甲基化测序流程主要包括DNA提取、甲基化处理、测序文库构建和高通量测序等步骤。
首先，需要从样本中提取出DNA，通常采用化学或机械方法进行破碎和纯化，以获得高质量的DNA。
接下来，对DNA进行甲基化处理，通常使用亚硫酸盐或DNA甲基转移酶来引入甲基基团。
在甲基化处理后，需要构建测序文库。
这一步骤包括DNA片段的末端修复、连接DNA适配体、PCR扩增等，以生成适合于高通量测序的文库。
最后，利用高通量测序技术对文库进行测序，以获取每个DNA分子的甲基化位点信息。
tbs甲基化测序流程的优势在于其高灵敏度和高分辨率。
通过该流程可以实现全基因组范围内的甲基化位点检测，揭示基因组中的甲基化模式，有助于我们理解甲基化在基因调控和疾病发生中的作用机制。
此外，tbs 甲基化测序流程还可以用于甲基化与其他表观遗传修饰形式（如组蛋白修饰）之间的相互作用研究，为进一步揭示细胞的表观遗传调控网络提供重要线索。
总之，tbs甲基化测序流程是一种可靠、准确的研究甲基化特征的方法。
通过该流程可以获得大量的甲基化位点信息，为我们深入理解甲基化在生物学过程中的功能和机制提供了有效手段。
未来，随着测序技术的不断发展和完善，tbs甲基化测序流程将在多个领域中得到广泛应用，并为相关研究提供更深入的认识和启示。
文章结构部分是指对整篇文章的组织和框架进行说明，提供读者对文章内容的整体把握。
下面是对文章1.2文章结构部分的内容的编写。
1.2 文章结构在本文中，将按照以下顺序讨论tbs甲基化测序流程的要点。
DNA甲基化检测实验指导
DNA甲基化检测甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。
目前甲基化特异性PCR ,Methylmion Specific PCR，简称MSP，及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。
然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，通过检测，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。
MSP法灵敏度较高，应用范围广。
实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：3mmol NaOH，DNA 纯化试剂盒，以及PCR检测用到的试剂盒等。
所涉及的仪器和耗材有赛默飞公司提供的单道移液器、QSP盒装吸头、Nun 冰盒，Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪，还有常规的离心机、水浴锅等。
本实验的操作流程为：引物设计，重亚硫酸盐修饰后进行DNA纯化，通过浓度检测方进行甲基化特异性PCR检测。
首先进行引物设计甲基化常发生在启动子区，以DAPK1基因甲基化引物设计为例来。
首先要找到DAPK1的启动子区，登陆Map Viewer，搜索DAPK1。
点击gene,filter，找到对应的基因，获得更多的信息。
点击Map Viewer，可见DAPK1在9号染色体的具体位置。
第一个外显子位于90140 kb处，估计启动子就在其上游2000kb内。
显示为Genbank格式，点击display，获得序列。
将得到的序列拿到Promoter Scan中预测，获得该启动子的相关信息。
预测结果的可靠性，需要通过实验证实。
最后，登陆在线引物设计程序“MethPrimer”，将序列复制到框中，这选项是设计BSP引物，可根据需要设置参数。
我们选择MSP引物，点击Submit获得MSP的5对引物。
(完整版)甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取。
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。
PH一定要准确为5.0。
加520ul至上述水浴后溶液中。
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h。
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。
甲基化实验操作流程
甲基化实验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!甲基化实验操作流程。
一、DNA提取。
1. 收集样本（如血液、组织等）并将其均匀化。
shox2基因甲基化检测操作规程
shox2基因甲基化检测操作规程一、引言shox2基因是一种重要的胚胎发育相关基因，与生长发育、骨骼形成等过程密切相关。
其甲基化水平的变化可以反映个体生长发育状态以及一些疾病的发生发展情况。
因此，shox2基因甲基化检测具有重要的临床应用价值。
本文将介绍shox2基因甲基化检测的操作规程，以帮助科研人员和临床医务人员正确进行检测。
二、实验材料1. 样本：收集需要检测的组织样本或血液样本。
2. DNA提取试剂盒：根据厂家说明选择适合的DNA提取试剂盒。
3. 甲基化特异性PCR试剂盒：选择商业化的甲基化特异性PCR试剂盒，确保试剂质量可靠。
三、实验步骤1. DNA提取a. 根据DNA提取试剂盒的说明书，从组织样本或血液样本中提取DNA。
b. 使用紫外光分光光度计检测DNA浓度和纯度，确保提取到的DNA质量优良。
2. 甲基化特异性PCRa. 根据甲基化特异性PCR试剂盒的说明书，配置PCR反应体系。
b. 将DNA模板加入PCR反应体系中，设置合适的PCR条件进行扩增。
3. PCR产物分析a. 将PCR产物进行电泳分析，使用合适的DNA分子量标记物作为标准。
b. 根据电泳结果判断shox2基因的甲基化水平，包括甲基化和非甲基化的情况。
四、结果解读根据PCR产物的电泳结果，可以得出shox2基因的甲基化水平，一般可以分为三种情况：1. 完全甲基化：PCR产物只有一个条带出现，表示shox2基因完全甲基化。
2. 部分甲基化：PCR产物出现两个条带，一个代表shox2基因的甲基化，另一个代表非甲基化。
3. 非甲基化：PCR产物只有一个条带出现，表示shox2基因非甲基化。
五、结果分析根据shox2基因的甲基化水平，可以进行进一步的结果分析和解读。
甲基化的程度和非甲基化的比例可以反映个体生长发育状态的健康程度和一些疾病的风险。
科研人员和临床医务人员可以根据检测结果，进行个体化的干预和治疗方案制定。
六、实验注意事项1. 实验过程中应注意无菌操作，避免污染。
甲基化原理及步骤
二、DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。
中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。
试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。
然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。
向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。
DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备（1）3 M NaOH原料（用前现配）把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。
使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）打开前将试剂瓶加温至室温。
对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。
充分涡旋振荡混合。
使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。
用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。
试剂Ⅰ避光保存以免分解。
为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ打开前将试剂瓶加温至室温。
将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。
每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。
充分混合确保完全溶解。
过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步：DNA修饰程序1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。
注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA 修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。
甲基化实验流程
对比说明甲基化前后 基因表达状态的变化
查一下是否有BA BH BC LM2 产物的抗体。在 蛋白水平检测基因表达。 把RT-PCR换为实时荧光定量。 C666细胞。
NLM 缩写： BMC Cancer NLM ID： 100967800 出版国家： England
影响因子：3.011
出版地：
出版商：
London
BioMed Central
创刊年份： 2001 语言： 英语 SCI收录： ISSN： YES
1471-2407 (电子版) 1471-2407 (ISSNLinking) 目前收录于： IM PubMed收 录： YES
研究领域： 肿瘤
实验流程
细胞系 胃癌组织
用不同浓度 5-azadc干 预不同时间
RT-PCR检测 相应基因的 表达情况
MSP，BGS检测 启动子甲基化 状态 对比说明启动子 甲基化和基因表 达的关系
MSP，BGS检测 启动子甲基化 状态
RT-PCR检测 相应基因的 表达状态
RT-PCR检测 相应基因的 表达情况
对比说明启动子甲 基化和基因表达的 关系
EBV在EBV相关肿瘤细胞系和胃癌组织中的甲基化状态
实验方法
1.BGS和MSP检测启动子Ap,Hp,BCRF1p和LMP2Bp甲基化状 态。 2.RT-PCR检测EBV阳性细胞系和胃癌组织中BARF1,BHRF1, BCRF1和LMP2B的表达。 3.用不同浓度的继氮胞苷对细胞系作用不同的时间后RTPCR检测相应基因的表达。
甲基化实验报告
一、实验目的1. 掌握甲基化反应的基本原理和实验方法；2. 学习使用化学试剂进行甲基化反应；3. 了解甲基化反应的实验条件对反应结果的影响。
二、实验原理甲基化反应是一种有机化学反应，指将甲基（-CH3）基团引入到有机分子中的反应。
本实验中，我们将以苯酚为底物，利用硫酸二甲酯（Me2SO4）作为甲基化试剂，进行甲基化反应。
反应方程式如下：C6H5OH + Me2SO4 → C6H4(OCH3) + H2SO4三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 苯酚（C6H5OH）- 硫酸二甲酯（Me2SO4）- 无水乙醇- 氯化钠（NaCl）- 氢氧化钠（NaOH）- 水浴锅- 烧杯- 烧瓶- 滴管- 玻璃棒- pH计- 恒温水浴锅- 紫外-可见分光光度计2. 实验试剂：- 95%乙醇- 1M NaOH溶液- 1M HCl溶液四、实验步骤1. 准备反应体系：在烧杯中加入10mL苯酚溶液（约0.1mol/L），加入5mL无水乙醇，搅拌均匀。
2. 加入甲基化试剂：用滴管向烧杯中加入0.1mol的硫酸二甲酯，迅速搅拌均匀，室温下反应1小时。
3. 酸化反应：向反应体系中加入1mL 1M HCl溶液，搅拌均匀，使反应体系pH值降至1-2。
4. 分离产物：将反应体系转移至烧瓶中，加入适量的NaCl，充分振荡，使产物盐析。
静置，待盐析沉淀后，取上层清液。
5. 纯化产物：将上层清液转移至烧杯中，加入适量的1M NaOH溶液，调节pH值至7-8，充分振荡，使产物重新盐析。
静置，取上层清液。
6. 测定产物浓度：使用紫外-可见分光光度计测定产物在特定波长下的吸光度，根据标准曲线计算产物浓度。
五、实验结果与讨论1. 通过实验，成功制备了甲基苯酚。
产物在紫外-可见分光光度计下具有明显的吸收峰，证明产物为甲基苯酚。
2. 在实验过程中，控制反应条件对产物收率有一定影响。
实验结果表明，反应温度、反应时间、甲基化试剂浓度等因素对产物收率有显著影响。
甲基化测序
DNA甲基化检测实验一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。
重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。
PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。
PCR产物克隆后进行测序。
通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA 分子中的甲基化状态。
该方法特点是：•特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；•灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。
用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。
重亚硫酸盐测序法技术实验流程A．DNA制备用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B．重亚硫酸盐处理C．DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D．PCR扩增E．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化F．PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。
G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析二、甲基化特异性的PCR实验流程（methylation-specific PCR, MSP）原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。
重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。
随后进行引物特异性的PCR。
该方法引物设计是关键。
MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。
检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。
全基因组甲基化测序的具体方法及步骤
全基因组甲基化测序的具体方法及步骤全基因组甲基化测序（whole-genome bisulfite sequencing）是一种高通量的测序技术，可以用来检测DNA上的甲基化状态。
甲基化是一种常见的DNA化学修饰形式，对基因表达和细胞分化等过程具有重要影响。
全基因组甲基化测序可以精确地测定基因组DNA的甲基化位点和水平，为研究基因组表观遗传变异和疾病发生机制提供了有力的工具。
以下是全基因组甲基化测序的具体方法和步骤：1.DNA提取：从研究对象的细胞或组织中提取总DNA。
常用的DNA提取方法有酚-氯仿法、磁珠法等。
2. DNA酶切：使用专门的酶（如MspI）对DNA进行切割，得到平衡的DNA片段。
3. 甲基化处理：将DNA暴露于亚硫酸盐（sodium bisulfite）的甲基硫湿气中。
亚硫酸盐可以将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（T），而甲基化的胞嘧啶不受影响。
这样，通过对比未经处理和经过处理的DNA序列，就可以确定甲基化位点的位置。
4.DNA纯化：使用一系列的纯化步骤，包括酚酸萃取、氯仿萃取和乙醇沉淀等，来去除杂质，使DNA适合进一步的测序分析。
5. 碱基浏览：将经过甲基化处理的DNA片段扩增，并进行高通量测序。
最常用的测序方法是Illumina测序技术。
6. 数据分析：对测序产生的原始数据进行质量控制、序列比对和甲基化位点检测等分析。
这些分析可以使用专门的软件包，如Bismark、Bisulfite-Seq等进行。
7.数据解释：统计和分析甲基化的结果，包括甲基化位点的数量、分布和甲基化水平等信息。
可以使用一系列统计方法和可视化工具，如R语言和基因组浏览器等，进行数据解释和结果展示。
以上就是全基因组甲基化测序的主要方法和步骤。
这种技术的主要优点是可以全面、高通量地测定整个基因组的甲基化状态，为基因组表观遗传变异和疾病发生机制的研究提供了重要的信息。
但是，全基因组甲基化测序也存在一些技术难题，比如DNA片段的扩增偏差和测序误差等，需要在实验设计和数据分析过程中加以考虑和解决。
甲基化测序方法
甲基化测序方法1. 甲基化测序方法简介甲基化是生物学中一个重要的表观遗传修饰。
甲基化测序是一种检测DNA序列中甲基化修饰的方法。
它通过充分利用DNA甲基化的化学特性和高通量测序技术，实现了对基因组范围内甲基化分布的全面探测和分析。
2. 甲基化测序方法的步骤（1）DNA提取在甲基化测序之前，首先需要从样本中提取DNA。
DNA提取的方法会直接影响整个实验的结果。
目前常用的DNA提取方法有酚/氯仿法、盐法、商业试剂盒等方法，其中商业试剂盒方法更为普遍。
（2）DNA加工DNA加工主要是对DNA进行质量控制。
加工步骤包括：DNA片段剪切、文库构建、PCR扩增等。
（3）高通量测序测序是甲基化测序的核心步骤。
高通量测序技术使得测序速度和数据输出的数量有了质的飞跃。
甲基化测序采用高通量测序技术后得到的数据量通常很大，处理数据需要专业的生物信息学分析技术。
（4）数据分析在数据分析步骤中，主要是对测序数据进行质量评估和甲基化位点鉴定。
这个过程主要借助于生物信息学分析工具，如Bismark、MethPipe等软件。
3. 甲基化测序方法的优势和应用（1）无需对DNA进行前期处理，不受DNA质量影响。
（2）甲基化测序可以全面检测基因组中的甲基化位点，包括常规测序方法检测不到的甲基化位点。
（3）甲基化测序可以提供基于基因组的DNA甲基化模式，进而解释基因组的表观遗传变异和表观遗传记忆效应。
目前，甲基化测序方法已经广泛应用于肿瘤、心理行为、胚胎发育等生命科学研究领域。
4. 结语甲基化测序是一种重要的表观遗传学研究工具，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和数据分析技术的提高，甲基化测序在生物学研究中的价值将日益凸显。
植物甲基化实验报告
一、实验目的本研究旨在探究植物DNA甲基化在基因表达调控中的作用，通过实验分析甲基化水平的变化，探讨其与植物生长发育的关系。
二、实验原理DNA甲基化是表观遗传学中一种重要的调控机制，通过甲基化修饰DNA碱基，影响基因的表达。
本研究主要针对植物DNA甲基化中的胞嘧啶5-甲基化（5-mC）进行实验分析。
三、实验材料与方法1. 实验材料- 植物样品：选取某植物品种的叶片、茎和根部组织。
- 主要试剂：DNase I、DNase I酶抑制剂、DNA提取试剂盒、甲基化特异性PCR试剂盒、引物合成服务等。
2. 实验方法（1）DNA提取- 将植物样品充分研磨，加入DNA提取试剂，按照试剂盒说明书进行DNA提取。
（2）DNA甲基化分析- 采用DNase I酶切法，将DNA中的5-mC位点切割成单链，进行甲基化特异性PCR。
（3）PCR扩增与产物分析- 以甲基化特异性引物进行PCR扩增，产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。
四、实验结果与分析1. DNA提取结果成功提取出植物样品的DNA，A260/A280比值在1.8-2.0之间，表明DNA纯度较高。
2. DNA甲基化分析结果通过琼脂糖凝胶电泳检测，甲基化特异性PCR产物在预期位置出现，表明植物DNA中存在5-mC修饰。
3. 不同组织DNA甲基化水平比较通过比较叶片、茎和根部组织的甲基化水平，发现根部组织甲基化水平最高，其次是茎，叶片最低。
五、讨论本研究结果表明，植物DNA甲基化在基因表达调控中起着重要作用。
根部组织甲基化水平较高，可能与根部在植物生长发育中的重要作用有关。
甲基化修饰可能抑制某些基因的表达，从而调控植物生长发育。
六、结论本研究通过分析植物DNA甲基化水平，揭示了甲基化在植物生长发育中的调控作用。
为进一步研究甲基化修饰与植物基因表达的关系，本研究将开展以下工作：1. 分析不同生长发育阶段植物DNA甲基化水平的变化规律。
2. 筛选甲基化修饰与植物生长发育相关的关键基因。
甲基化实验步骤
一． 重亚硫酸盐修饰基因组DNA 的制备采用EZ DNA Mehtylation-Gold Kit TM D5005试剂盒，按照操作说明书分别对提取的Blank 、Cya 基因组DNA 进行重亚硫酸盐修饰。
进行重亚硫酸盐修饰。
1. 分别吸取10μL Blank 和Cya DNA 样品到PCR 管中，加入10μL 水补足20μL ，每个样品加130μL CT conversion reagent 。
轻弹管子或者用枪吹打混匀，离心使液体沉到管底。
底。
2. 将管子放到热循环仪中，运行以下步骤：将管子放到热循环仪中，运行以下步骤：1. 98℃ 10min2. 6464℃℃ 2.5h 2.5h3. 4℃保存可至20h 20h3. 加600μL M-Binding Buffer 到Zymo-Spin TM IC Column, 柱子放在提供的收集管中。
柱子放在提供的收集管中。
4. 把样品（来自步骤2）加到装M-Binding Buffer 的Zymo-Spin TM IC Column 中。
盖上盖子，颠倒混匀。
颠倒混匀。
5. 全速离心（≥10000g ）30s 。
倒掉流穿液。
倒掉流穿液。
6.加100μL M-Wash Buffer 到柱子上。
全速离心30s 。
7. 加200μL M-Desulphonation Buffer 到柱子上，室温（到柱子上，室温（20℃-30-30℃）静置℃）静置15-20min 。
孵育完成后，全速离心30s 。
8. 加200μL M-Wash Buffer 到柱子上。
全速离心30s 。
另加200μL M-Wash Buffer ，再离，再离心30s 。
9. 把柱子放到1.5mL 离心管。
垂直加10μL L M-Elution M-Elution M-Elution buffer buffer 到柱子基质。
全速离心30s 洗脱DNA 。
二． PCR 扩增反应模板：重亚硫酸盐修饰的Blank 、Cya 基因组DNA 引物引物上游：CTCAAGCTTCGAA TTTTTTTA TAAGAAGAAGA TA TAG 下游：TAGA TCCGGTGGA TCAAAACTCCACCACAAACCACTT 目的片段长度：476bp 1. 操作步骤：操作步骤：反应体系反应体系模板模板 0.5μL 10×KOD plus buffer 5μL dNTPS Mixture （2.5mM each ） 5μL Mg 2+ 4μL 上游引物上游引物 3μL 下游引物下游引物 3μLDMSO 4μL KOD plus 酶 2μL ddH 2O 23.5μL Total 50μL 反应条件：反应条件：1）95℃ 3min2）95℃ 25s ；48℃ 15s ；72℃ 45s 。
DNA甲基化谱图分析的步骤与技巧
DNA甲基化谱图分析的步骤与技巧DNA甲基化是指DNA分子上的甲基基团（CH3）与DNA碱基之间的化学修饰。
甲基化是真核生物中一种重要的表观遗传修饰方式，对基因的表达和细胞分化具有关键的调控作用。
通过进行DNA甲基化谱图分析，我们可以深入了解DNA甲基化模式及其在疾病发展中的关联。
本文将介绍DNA甲基化谱图分析的步骤与一些技巧。
DNA甲基化谱图分析步骤如下：1. DNA提取：首先从样本（例如血液、组织）中提取DNA。
目前常用的DNA 提取方法有酚-氯仿法、盐法和商用DNA提取试剂盒等。
提取的DNA应具有足够的纯度和质量。
2. 甲基化酶处理：将提取的DNA与DNA甲基化酶一起反应，使DNA上的未甲基化位点与酶反应形成的底物结合。
DNA甲基化酶有多种选择，如DNMT3A、DNMT1和M.SssI等。
反应的时间和温度需要根据实验需求进行调整。
3. 甲基化位点富集：使用合适的方法富集DNA上的甲基化位点。
常用的方法包括甲基化特异性抗体富集、甲基化诱导剂富集和化学法富集等。
这些方法都可有效提高甲基化位点的富集效率。
4. DNA测序：将富集后的甲基化DNA样本进行测序，生成原始的测序数据。
目前，常用的测序技术有二代测序技术如Illumina HiSeq和三代测序技术如PacBio SMRT。
5. 数据分析：利用生物信息学工具和软件分析原始测序数据，得到甲基化谱图。
数据分析过程包括原始数据的质控、序列比对、甲基化位点识别和甲基化水平计算等。
常用的数据分析工具包括Bismark、MethylKit和MethylC-seq等。
DNA甲基化谱图分析的技巧如下：1. 样品选择与准备：选择与研究目标相关的样本，如疾病患者组织或动物实验模型。
确保样本的质量和纯度对于得到准确的结果至关重要。
2. 实验条件优化：基于实验目的和样本特点，优化DNA甲基化过程中的反应条件，如甲基化酶的浓度、反应时间和温度等。
这一步骤需要进行一系列实验和优化以确保实验结果的可靠性。
甲基化实验方法和步骤
实战经验：甲基化检测方法总结——（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。
DNA 比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。
因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。
否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。
两者均于-20度保存。
验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA 的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
第一天只需下午半天即可下午3点开始，先配好试剂再开始做实验需提前消毒的物品：1.5mlEP管一大盒，双蒸水200ml，15ml离心管，开水浴锅，第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水均经高压蒸汽灭菌。
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用双蒸水稀释至45ul【20ulDNA+25ul双蒸水】；2：加5ul新鲜配制的3M NaOH【0.12g定容到1ml，用1.5mlEP管配制】；3： 42℃水浴30min；水浴完后把水浴锅调至50℃水浴期间配制： 4：20mM对苯二酚氢醌【0.022g氢醌定容至10ml，用15ml离心管配】，加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：用15ml离心管配，1.88 g 亚硫酸氢钠使用3ml 双蒸水稀释，【一次性加350ul 3M NaOH，，然后谨慎每次加入10ul 3M NaOH仔细观察】并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。
甲基化分析流程过程
甲基化分析流程过程
甲基化分析流程涉及多个步骤，以下是一个基本的分析流程：
1. 样本准备：首先需要收集和分析的样本，如基因组DNA。
确保样本的质量和数量满足分析要求。
2. 甲基化检测：
* 电泳检测MSP扩增产物：通过针对处理后甲基化DNA链的引物进行电泳检测，若能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之则不存在甲基化。
* 亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）：使用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。
设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶。
最后对PCR产物进行测序，可以判断CpG位点是否发生甲基化。
此外，将PCR产物克隆至载体后进行测序可以提高测序成功率。
3. 甲基化芯片分析：利用甲基化芯片（如EPIC和450K）进行高通量甲基化检测。
这需要厂商提供注释文件信息，以便准确分析甲基化位点。
4. 差异甲基化区域（DMR）鉴定及统计：使用权威期刊发表的metilene软件进行DMR检测。
该软件首先进行基因组预分段，排除不包含CG位点的片段。
然后利用二元分隔算法递归缩小检测范围，搜索得到组间累积平均甲基化差异最大的区域作为可能的DMR。
最后，结合双重统计学检验得到准确的DMR。
这些步骤涵盖了甲基化分析的主要过程，但具体的实验条件和参数可能因实验室和研究目的的不同而有所调整。
此外，甲基化分析涉及复杂的生物学和统计学原理，需要专业知识和技能来准确解释结果。
因此，在进行甲基化分析时，建议与经验丰富的科研人员或专业实验室合作，以确保结果的准确性和可靠性。
甲基化测序实验流程
甲基化测序实验流程英文回答：Methylation sequencing, also known as methylome sequencing or DNA methylation sequencing, is a powerful technique used to study the epigenetic modifications of DNA. It allows researchers to investigate the patterns of DNA methylation across the genome and understand how these modifications influence gene expression and cellular function.The process of methylation sequencing involves several steps. First, genomic DNA is isolated from the sample of interest, such as human tissue or cells. This DNA is then treated with bisulfite, which converts unmethylated cytosines to uracils while leaving methylated cytosines unchanged. This step is crucial as it allows discrimination between methylated and unmethylated cytosines during sequencing.After bisulfite treatment, the DNA is subjected tonext-generation sequencing (NGS) technologies, such as Illumina sequencing. This generates millions of short DNA reads that represent the methylation status of individual cytosines across the genome. These reads are then alignedto a reference genome to determine the location and frequency of DNA methylation.Once the sequencing data is obtained, bioinformatic analysis is performed to interpret the results. Thisinvolves identifying differentially methylated regions (DMRs) and comparing methylation patterns between samples. Various statistical methods and computational tools areused to analyze the data and identify significant methylation changes associated with specific biological processes or diseases.Methylation sequencing can be applied to various research areas, such as cancer epigenetics, developmental biology, and neurobiology. For example, in cancer research, methylation sequencing can reveal aberrant DNA methylation patterns that contribute to tumor formation and progression.In developmental biology, it can shed light on the epigenetic regulation of gene expression during embryonic development. In neurobiology, it can provide insights into the role of DNA methylation in neuronal plasticity and cognitive function.Overall, methylation sequencing is a valuable tool for studying the epigenetic modifications of DNA. It allows researchers to investigate the dynamic changes in DNA methylation patterns and their functional implications. By understanding the role of DNA methylation in various biological processes, we can gain a deeper understanding of gene regulation and potentially develop targeted therapies for diseases.中文回答：甲基化测序，也称为甲基组测序或DNA甲基化测序，是一种用于研究DNA表观遗传修饰的强大技术。
dna甲基化检测流程
dna甲基化检测流程
DNA甲基化检测是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因的表达、细胞分化和发育等过程中对基因组的调控作用。
其基本流程如下：
1. DNA提取：从待检测样本(如血液、组织等)中提取DNA。
2. 反应体系制备：根据实验设计，制备PCR反应体系，包括DNA 模板、引物、酶和缓冲液等。
3. PCR扩增：利用PCR技术进行DNA扩增，扩增出目标基因片段。
4. 限制性酶切：将扩增出的基因片段利用限制性酶切割，得到
特定的DNA片段。
5. 电泳分离：将切割后的DNA片段进行电泳分离，根据片段大
小进行分离。
6. 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析：根据DNA片段长度进行鉴定和分类，得到甲基化和未甲基化的DNA片段。
7. 数据分析：将分离得到的DNA片段进行分析和比较，得出目
标基因的甲基化状态。
以上是DNA甲基化检测的基本流程，不同实验设计和研究目的下，可能会有所差异。
近年来，随着高通量测序技术的发展，也出现了更高效、更准确的DNA甲基化检测方法。
- 1 -。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
MGMT甲基化检测实验步骤
一．亚硫酸氢钠处理DNA（将未甲基化的胞嘧啶脱氨基变为尿嘧啶）
使用EZ DNA（北京中西远大科技有限公司）甲基化试剂盒处理样本。
二．DNA样本的处理
1.取130微升的CT Conversion Reagent和20微升的DNA样本，加入1.5毫升的离心管中。
混合。
2.准备好水浴锅，将离心管放入98℃水浴锅中10分钟，64℃水浴锅中2.5个小时。
（不能立即开始实验的，将样本放入4℃冰箱中，保存。
）
3.将离心管中的溶液吸出，加入到Zymo-Spin TM的萃取柱中。
4.取600微升的M-Binding Buffer加入到萃取柱中，摇晃混匀。
5.转速＞10000转/分钟的离心机中，离心30秒。
倒掉液体。
6.取100微升的M-Wash Buffer加入萃取柱，离心30秒，倒掉液体。
7.取200微升的M-Desulphonation Buffer加入萃取柱，等待15~20分钟，使其充分浸润。
然后离心30秒。
8.取200微升的M--Wash Buffer加入离心管中，离心30秒。
重复此步骤一次，随后将收集柱丢弃，萃取柱放入1.5毫升离心管中。
9.取10微升的M-Elution Bufer加入到萃取柱中，离心30秒，萃取柱丢弃，离心管中得到处理好10微升DNA样本。
三．巢式PCR（体系，程序）
第一轮PCR：模板（处理后的DNA），引物：MGMT--JF/R ，dd水，PCR MIX Golden Star。
体系为：20微升=模板DNA 4微升+引物2微升+dd水4微升+Golden Star 10微升（一管）
反应条件：95℃ 10min
95℃ 30s →
52℃ 30s → 40个循环
72℃ 30s →
72℃ 10min
4℃ forever
第二轮PCR：模板（第一轮PCR的产物），引物：m-MGMT-F/R及u-MGMT-F/R，dd 水，PCR MIX Golden Star。
体系为：20微升=模板DNA 1微升+引物（m-MGMT-F/R）2微升+dd水7微升+Golden Star 10微升（一管）
20微升=模板DNA 1微升+引物（u-MGMT-F/R） 2微升+dd水7微升+Golden Star 10微升（一管）
反应条件：95℃ 10min
95℃ 30s →
64℃ 30s → 40个循环
72℃ 30s →
72℃ 10min
4℃ forever
四．PAGE电泳检测
配置PAGE胶：12%的胶： 100ml 12ml
30%丙烯酰胺： 40ml 4.8ml 10xTBE 10ml 1.2ml 10%过硫酸铵 0.7ml 84μl TEMED 35μl 4.2μl H2O 49.3ml 5.9ml。