叶绿素实验报告

叶绿素铜钠的合成、分离、分析及结构测定

食品092

一、实验目的：

1、从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率。

2、初步研究叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件。

3、分析叶绿素铜钠产品的纯度并计算其产率。

4、通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作。

二、产品验收指标

项目和指标

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项目│ 指标

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pH │ 9.0～10.7

1％│

E 405nm ≥ │ 568

1cm │

消光比值│ 3.2～4.0

总铜(Cu),％│ 4.0～6.0

游离铜(Cu),％≤ │ 0.025

砷(As),％≤ │ 0.0002

铅(Pb),％≤ │ 0.0005

干燥失重,％≤ │ 4.0

硫酸灰分,％≤ │ 36.0

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三、实验原理:

叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，它与蛋白质结合存在于植物的绿叶和绿色的茎中，是植物进行光合作用所必须的催化剂，叶绿素难溶于水，而易溶于极性有机溶剂。叶绿素有a和b 两种，a为蓝黑色结晶

叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，在叶绿素的结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环．卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子(或其它相似离子)的刚性平面．

叶绿素的结构如图l所示：

蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮混合液来提取。所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解，且又不溶于水。110度左右会分解，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳定溶解性也会有所提高。

叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐：

Ｃ55Ｈ72Ｏ5Ｎ4Ｍｇ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4ＭｇＮａ2+ ＣＨ3ＯＨ + Ｃ20Ｈ39ＯＨ

Ｃ55Ｈ70Ｏ6Ｎ4Ｍｇ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4ＭｇＮａ2+ ＣＨ3ＯＨ + Ｃ20Ｈ39ＯＨ

在酸性条件下，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿酸：

Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4ＭｇＮａ2 + 4Ｈ+ = Ｃ34Ｈ34Ｏ5Ｎ4 + Ｍｇ2+ + 2Ｎａ+

Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4ＭｇＮａ2 + 4Ｈ+ = Ｃ34Ｈ32Ｏ6Ｎ4 + Ｍｇ2+ + 2Ｎａ+

叶绿酸可与铜盐在加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应生成叶绿素铜钠：

Ｃ34Ｈ34Ｏ5Ｎ4+Ｃｕ2+ = Ｃ34Ｈ32Ｏ5Ｎ4Ｃｕ+ 2Ｈ+

Ｃ34Ｈ32Ｏ6Ｎ4+Ｃｕ2+ = Ｃ34Ｈ30Ｏ6Ｎ4Ｃｕ+ 2Ｈ+

Ｃ34Ｈ32Ｏ5Ｎ4Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ30Ｏ5Ｎ4CｕＮａ2 + 2Ｈ2Ｏ

Ｃ34Ｈ30Ｏ6Ｎ4Ｃｕ + 2ＮａＯＨ = Ｃ34Ｈ28Ｏ6Ｎ4CｕＮａ2 + 2Ｈ2O 蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性蚕粪叶绿素铜钠盐水溶液在360~700之间有2个吸收峰在波长440处有一最大吸收峰,其吸光度为114;在630处有一较小的

吸收峰,其吸光度为017"在波长440的吸收峰为叶绿素铜钠盐特有,而在630处的

吸收峰为叶绿素特有,叶绿素铜钠盐的含量约是蚕粪中叶绿素含量的2倍，所以试验中均采用440的波长测定叶绿素铜钠盐的稳定性。下图是蚕粪叶绿素铜钠盐的光谱特性［5］。

四、仪器和试剂

（一）、试剂：

1、蚕沙（50克）

2、95%乙醇

3、NaOH 溶液

4、稀盐酸

5、丙酮

6、石油醚

7、CuSO4溶液

8、蒸馏水

9、40%乙醇(纯乙醇与蒸馏水按2:3配) 10、5%NaOH-乙醇溶液 11、pH试纸 12、磷酸盐缓冲液（pH=7.5）取0.15mol/L磷酸氢二钠与同浓度的磷酸氢二钾以21：4混合（二）、仪器：

A、叶绿素的提取叶绿素铜钠合成

1、温度计 1支回流冷凝管 1支 500ml 圆底烧瓶 1个

恒温槽 1台滤瓶及漏斗 1个胶头胶管 1个

玻璃棒 1支 100mL量筒 1个铁架台 1台

电热恒温水浴装置 1套

2、减压蒸馏装置 1台

3、台氏天平 1台

4、PH试纸若干

B、叶绿素铜钠质量分析

1、751分光光度计 1台

2、台式天平、分析天平各1台

3、玻棒 1支胶头滴管 1支

10mL、50mL量筒各一个 100mL 、50mL容量瓶各1个

25mL、1mL吸量管各一支

4、试纸若干吸耳球一个

五、实验步骤

（一）叶绿素铜钠的合成

1、叶绿素的提取：

（1）在500ml圆底烧瓶中，先加入50g干蚕沙，再加入95%乙醇100ml。

（2）将反应瓶用水浴加热，使水浴温度在60℃（防止叶绿素a和b分解），浸

泡提取2小时，滤出提取液。

（3）按步骤2用乙醇重复2次。

（4）合并3次提取液，在减压、不超过60摄氏度下蒸出乙醇。趁热倾出瓶中液体，冷却至室温，得到墨绿色膏状物（叶绿素粗品，不宜久置）。

2、皂化：

将浓缩液置于带搅拌子三口烧瓶中，用5%NaOH-C2H5OH溶液调节使其pH=11，用水浴加热在60℃下皂化回流1小时。

3、萃取：

将皂化液冷却后转入分液漏斗加入等量石油醚萃取除去杂质（黄色）静置分层，下层为可溶性叶绿酸盐（绿色），取上层液检验是否完全皂化：取上层液少许置于小烧杯中，加入2—3倍石油醚静置，用玻棒沾取上层液去试纸上，呈绿色则不完全皂化。取下层溶液，上层溶液用旋转蒸发器蒸发回收石油醚。平行萃取3次。

4、调酸铜代：

将下层溶液装入三口烧瓶中，往其中慢慢加入稀盐酸溶液调节pH=7后，加入10%的硫酸铜10ml，搅拌均匀后，再用盐酸将溶液调节pH为2-3，在水浴60℃下保温搅拌1小时。

趁热过滤，用95%乙醇洗涤3次后抽干。合并滤液和洗液，加入4倍的蒸馏水，析出叶绿素铜，静置过夜后过滤，滤饼依次用适量的纯水、40%乙醇及石油醚

洗涤3次至石油醚层变为浅绿色，以除去其中的H+、及残留的叶黄素和其

他有机杂质。

5、成盐：

洗涤结束后滤干，滤饼用丙酮溶解，加入5%NaOH-乙醇溶液，调节pH=11，搅拌，成盐（用滤纸法检验成盐情况：用玻棒点少许溶液放在滤纸上，滤纸不显绿色则说明完全成盐），将其在60℃下加热蒸发以除去水分得墨绿色结晶物，然后再在60℃下烘箱中烘干结晶物，即制得墨绿色光泽的成品（略有胺味）。

流程图:

溶剂NaOH溶液不皂化物溶剂酸 CuSO4溶液滤渣

↓↓↑↓↓↓↓

蚕砂→

水稀酒精 NaOH

↓↓↓

成品

（二）、纯度分析：

1、标准叶绿素铜钠盐的标准曲线

称取标准样品0.01克（精确至0.0002克），加水溶解，移入10 mL容量瓶