8.食品酶学-多酚氧化酶
多酚氧化酶6页
多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。
自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。
多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。
在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。
现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。
编辑本段二、多酚氧化酶在自然界的分布1植物中的多酚氧化酶及作用在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中，PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被活化，从而表现出活性。
在果蔬细胞组织中，PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内[7]；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO，含量大约与蛋白质部分相同[8]；在茶叶中的PPO 分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态[9]，ThanarajS.N.(1990)研究了茶树新梢中PPO活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PPO活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产[10]；新鲜的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。
食品酶学考试重点
食品酶学考试重点食品酶学一、名词解释1、酶：酶就是一类由活性细胞产生的具备催化作用和高度专一性的特定蛋白质。
2、生物传感器：由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。
酶传感器：就是由固定化酶与能量转换器（电极、场效应管、离子挑选场效应管等）紧密融合而变成的传感装置，就是生物传感器的一种。
3、盐析：一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。
4、生物因子：指细胞生长繁殖所必须不可缺的微量有机化合物。
6、酶活：在一定条件下,一定时间内将一定量的底物转变为产物所需的酶量。
7、酶原：不具备活性的酶的前体。
8、酶比活力（specificactivity）：单位蛋白质（毫克蛋白质或毫克蛋白氮）所含有的酶活力（单位/毫克蛋白）9、酶的固定化：使用各种方法，将酶或菌体与不溶性载体融合的过程。
10、固定化酶：紧固在一定载体上，并在一定空间范围内展开催化反应的酶。
11、辅基：酶的辅因子或结合蛋白质的非蛋白部分（其中较小的非蛋白质部分称辅基），与酶或蛋白质结合的非常紧密，用透析法不能除去。
12、单体酶：仅有一个活性中心的多肽链形成的酶，通常就是由一条多肽链共同组成，例如溶菌酶。
13、寡聚酶：由几个或多个亚基组成的酶，亚基牢固地连在一起，单个亚基没有催化活性的酶。
14、辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可以就是无机离子也可以就是有机化合物。
15、活性部位：酶分子中轻易与底物融合，并和酶催化作用轻易有关的部位。
16：产物Dozul促进作用：由酶催化作用的产物或者新陈代谢途径的末端产物引发的Dozul促进作用。
17：分解代谢Dozul促进作用：由水解代谢物（葡萄糖等和其他难利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引发的Dozul促进作用。
18、电泳：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。
填空题:1、酶的生产方法：抽取分离法、生物合成、化学合成2、酶的分类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、新酶（核酸酶、抗体酶）3、酶的共同组成：酶蛋白、辅酶辅基和金属离子4、辅因子：辅酶、辅基、金属激活剂5、km值表示酶与底物之间的亲和程度：km值大表示亲和程度小，酶的催化活性小；km值小表示亲和程度大，酶的催化活性高。
多酚氧化酶
简介
多酚氧化酶(polyphenol oxidase， 简称PPO）是一类广泛存在于植 物体内的含铜金属酶类.由于其与 果蔬加工、品质等密切相关,人们 很早就开始对它进行深入细致的 研究.
• 铜是酶的活性中心，从蛋白质中除 去一部分或全部铜，将引起酶活性 下降或完全失活，若添加铜的话， 酶活又能恢复。不同果蔬中的PPO铜 辅基的数量会有所不同，如蘑菇中 PPO含4个铜原子，而扁豆的PPO含1 个铜原子。
琼酯糖凝胶
已装柱好的苯基琼脂糖 PenlysepharoseCL4B柱,用高盐缓冲 液A预平衡, 酶液借助梯级蠕动泵加 在柱上,洗脱液以一定流速,从高盐缓 冲液A减弱至低盐缓冲液B,最后以 50%的乙二醇进行洗脱 。由紫外监 控器(280nm)监控，调节分级收集器 流速收集。
酶活性测定 测定波长视底物而定,测定 温度为25℃,反应液由pH4的柠檬 磷酸缓冲液、测定底物和酶液组 成,一个酶活力单位为测定条件下, 每分钟引起光密度改变0.001所需 的酶量。
葡聚糖凝胶
文献报道植物组织中PPO分子量一般 介于40-70K之间，根据葡聚糖凝胶分离大 分子的原理，葡聚糖凝胶分离PPO与杂蛋白。 不同型号凝胶的分离范围是根据球形蛋白 理论模型确定的，而实际分离蛋白的结构 与理论模型常有较大差异，因此在纯化PPO 时，采用不同型号的葡聚糖凝胶进 行分离效果的比较。
包括Sepharose和Bio-gel A等。 Sepharose与2,3二溴丙醇反应，形Sepharose CL型凝胶（CL-2B ~4B），分离特性基本没变，
琼脂糖是从琼提高，可以在更
广泛的pH范围内应用。
琼脂糖凝胶稳定性要超过一般的葡聚糖 凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样 品的吸附作用很小。琼脂糖凝胶的机械强 度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两 种凝胶，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以 比较快。 琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范 围很广，适合于分离大分子物质，但分辨 率较低。琼脂糖凝胶不耐高温。
多酚氧化酶活性测定
多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。
多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。
二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。
由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。
把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。
精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。
用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。
由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。
所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。
研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。
四、试剂1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2天配制）。
贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。
2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2 小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。
3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。
多酚氧化酶制备与性质
多酚氧化酶制备与性质多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是存在于多种植物、真菌和动物体内的一种酶类。
它主要参与生物体内多酚类物质的氧化反应，是一种铜酶，催化氧化物质依靠两种配位的单核铜中心。
多酚氧化酶具有高度的催化活性和种类多样的底物适应性，常用于食品产业、医药业和环境污染治理等方面。
多酚氧化酶分离、纯化和制备是开展其相关研究和应用的前提。
其制备方法可分为传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。
传统分离方法是采用离心、滤纸剖分、离子交换层析、凝胶过滤层析或超滤等方法，通过化学检测和活性检测手段获得多酚氧化酶。
但这种方法存在着操作麻烦、纯化度低、产率不高等缺点。
分子生物学技术则是利用基因克隆和表达工具，从源头上获得多酚氧化酶基因序列进行提取和纯化。
目前研究中常用的是PCR扩增、应用大肠杆菌或酵母菌实现异源表达等方法。
重组工程方法是指将多酚氧化酶基因定向插入宿主细胞中，结合合理培养条件，利用重组合成技术得到具有高活性和高特异性的多酚氧化酶。
这种方法的优势在于产量高、纯度高且结构相对稳定。
多酚氧化酶性质的主要特点包括多酚类物质的高效氧化反应、菌落变色和储存特性。
多酚类物质的高效氧化反应：多酚氧化酶主要针对多酚类物质进行高效氧化反应。
例如，多酚氧化酶可以催化咖啡因氧化成黑色物质，其颜色变化的过程符合米氏方程（Michaelis-Menten equation），表现出一定的反应速率和反应程度。
菌落变色特性：多酚氧化酶具有天然菌落颜色的变色特性，这是因为多酚氧化酶可以催化多酚类物质氧化成黑色色素，从而产生的颜色变化可以用于分析检测和实验研究。
储存特性：多酚氧化酶可以保存在含钾的磷酸盐缓冲液中，并且可以在冷藏条件下保持其催化活性和稳定性。
但是为了避免酶的降解和变性，一般应该避免恶劣的环境和条件。
综上，多酚氧化酶是一种广泛存在于生物体内的酶类，具有高效催化和底物适应性等优势。
其制备方法包括传统分离、分子生物学技术和重组工程等三种方法。
多酚氧化酶培训资料
多酚氧化酶多酚氧化酶的酶学性质及其应用摘要：本文论述了多酚氧化酶的酶学性质和它对果蔬类食品的影响，以及如何利用它的酶学性质加以控制。
关键词：多酚氧化酶性质抑制0引言多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。
自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。
多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶[1]。
1多酚氧化酶的结构特性多酚氧化酶是一种含有Cu2+离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。
因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生[2]。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。
在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。
2 多酚氧化酶的来源和制备2.1多酚氧化酶的来源多酚氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。
2.2多酚氧化酶的制备制备马铃薯丙酮粉：取50g去皮切丁的马铃薯与60mL丙酮（-20℃）混合粉碎抽滤，滤渣用-20 ℃的丙酮冲洗至白色室温下晾干。
PPO粗提液的制备： 5g马铃薯干粉与40mL粗酶提取液混合搅拌1min 静止1hr，4℃离心（4℃，15000rpm，15min）过滤取上清，即得PPO粗提液，粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB。
多酚氧化酶
多酚氧化酶的酶学性质及其应用摘要：本文论述了多酚氧化酶的酶学性质和它对果蔬类食品的影响，以及如何利用它的酶学性质加以控制。
关键词：多酚氧化酶性质抑制0引言多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。
自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。
多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶，酪氨酸酶，苯酚酶，甲酚酶，邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的第一大类氧化还原酶[1]。
1多酚氧化酶的结构特性多酚氧化酶是一种含有Cu2+离子的结构蛋白，可以催化酚类上的羟基，使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。
因为醌类具有较强的电化学性质，会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应，而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生[2]。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。
在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。
2 多酚氧化酶的来源和制备2.1多酚氧化酶的来源多酚氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。
2.2多酚氧化酶的制备制备马铃薯丙酮粉：取50g去皮切丁的马铃薯与60mL丙酮（-20℃）混合粉碎抽滤，滤渣用-20 ℃的丙酮冲洗至白色室温下晾干。
PPO粗提液的制备：5g马铃薯干粉与40mL粗酶提取液混合搅拌1min 静止1hr，4℃离心（4℃，15000rpm，15min）过滤取上清，即得PPO粗提液，粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB。
食品中的多酚氧化酶
食品中的多酚氧化酶中国食品产业网（2007年3月3日11:27）多酚氧化酶(P01yphenol Oxidase，PP0)是自然界分布极广的一种氧化还原酶，茶叶中的多酚氧化酶通过控制不同的酶活可以加工成品质与滋味迥异的各类茶叶。
自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关，1938年KeilinD．和MannG研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化，得到多酚氧化酶并将这类酶称为p01yphenol Oxidase。
之后多酚氧化酶一直是研究的热点，尤其是在PP0的生化、生理学性质方面取得了较大的进展。
氧化还原酶(1)酚酶又称多酚氧化酶、酪氨酸酶、多酚酶、儿茶酚氧化酶、甲酚酶、儿茶酚酶。
最适 pH为5～7，可以催化酚类物质氧化。
酚酶在植物界中存在广泛，是许多蔬菜、水果的切面在空气中迅速变黑的主要原因。
1、多酚氧化酶的分布与在植物中的作用PP0是核编码的的铜金属酶，是在细胞质中合成的，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，PP0相当稳定，甚至在土壤中已腐烂的的植物残渣上都可检测到PP0的活性。
在植物(如土豆、苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、烟草等)组织中，PP0是与内囊体膜结合在一起的，天然状态无活性，但将组织匀浆或损伤后酶活被活化，从而表现出活性，在果蔬细胞组织中，PP0存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异，绿叶中PP0活性大部分存在于叶绿体内；马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PP0，含量大约与蛋白质部分相同，马铃薯芽、根的多酚氧化酶的活性最高，幼叶和成熟块茎中活性中等，成熟叶和茎叶活性最低；在茶叶中的PPo可分为游离态和束缚态，前者主要存在于细胞液中属可溶态PP0，而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态，StePhenThanarajS.N. (1990)研究了茶树新稍中PP0活性及多酚含量对红茶品质的影响，发现PP0活性强，多酚含量高，对红茶品质有利，相反则利于绿茶的生产。
食品酶学多酚氧化酶共43页文档
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21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
食品酶学多酚氧化酶
51、没有用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
多酚氧化酶,过氧化物酶,脂肪氧合酶
异名:
* Catecholase
* diphenol oxidase
* dopa oxidase
* o-diphenol oxidoreductase
*o-diphenolase
*phenolase
*polyphenol oxidase
* pyrocatechol oxidase *tyrosinase
医学课件ppt
18
香蕉果皮中的酚类物质
医学课件ppt
19
荔枝、龙眼果皮的酚类物质
医学课件ppt
20
9.1.3 pH和温度对PPO活力的影响 一、 pH对酶活力的影响
医学课件ppt
21
pH对PPO活力的影响
1. 多数情况下，最适pH在4~7之间。 2. 从不同种类，不同品种植物的PPO具有不同的
医学课件ppt
4
9.1.1多酚氧化酶的名称和在自然
界的分布
一、 酶的名称
早期的文献中习惯名称“多酚氧化酶”指的是两种 不同的三酚化合物,也能 作用于单酚,将其转变成邻二酚.
另一种能氧化邻-和对-二酚.它常被称为虫漆酶(laccase) 主要存在于日本的虫胶树),它不能使单酚羟基化.
过氧化物酶的热失活有什么特点？ 脂肪氧合酶作用的底物是什么，此酶催化
的反应对食品质量有何影响？
医学课件ppt
3
9.1 多酚氧化酶(Polyphenol
oxidases, PPO, EC1.10.3.1)
多酚氧化酶(邻二酚:氧 氧 化还原酶)广泛存在于各种 植物中，是一种含铜的酶。
在新鲜、冷冻、干制和罐 藏产品，多酚氧化酶引起 的褐变会严重损害食品的 感官质量，因此它对于果 蔬加工和保藏具有重要意 义。
2012 食品酶学-8-2
重要
（5）稳定食品乳状液的质量
葡萄糖氧化酶—过氧化氢酶处理对蛋黄酱稳定性的影响
感光评定 对照 0 2 3 4 5 6 + + 0 酶处理 + + + + + + 对照 + + + 0 颜色 酶处理 + + + + + + 14.6 0.8 6.2 0.2 氧化值（mmol/kg样品） 对照 0.2 酶处理 0.2
主要内容 一、过氧化物酶
二、多酚氧化酶
三、脂肪氧合酶
四、葡萄糖氧化酶
三、 脂肪氧合酶 (lipoxygenase, LOX)
脂肪氧合酶（EC 1.13.1.13），参与植
物生长、发育、成熟、衰老的各个过程，特别 是成熟衰老过程中自由基的产生以及乙烯的生 物合成。
1 脂肪氧合酶催化的反应
脂肪氧合酶底物脂肪酸的部分结构
OH H
相对速率 100 0.64 0 3.3
2
2 3 4
D-甘露糖
2-O-甲基-D-葡萄糖 3-脱氧-D-葡萄糖 D-半乳糖
C（2）上OH的构型
C（2）上OH的H被甲基取代 C（3）上OH被H取代 C（4）上OH的构型
0.98
0 1 0.5
4
5 5 6
4-脱氧-D-葡萄糖
5-脱氧-D-葡萄糖 L-葡萄糖 6-脱氧-D-葡萄糖
4 葡萄糖氧化酶的抑制剂
抑制剂：Hg2+ 、Ag+ 、Cu2+ 、对氯代汞基 苯甲酸、苯基脲乙酯及NH4OH、肼、苯肼、
亚硫酸钠、双甲酮。
甘露糖、果糖以及D-阿拉伯糖对葡萄糖氧化
酶有比较明显的竞争性抑制作用。
多酚氧化酶活性测定
多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。
多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。
二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。
由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。
把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。
精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。
用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。
由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。
所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I23I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。
研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。
四、试剂1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2天配制）。
贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。
2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2 小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。
3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。
多酚氧化酶在食品中的应用
多酚氧化酶在食品中的应用多酚氧化酶在食品中的研究进展摘要：多酚氧化酶（PPO）存在于许多种类的食品中，是引起食物褐变的主要因素，酶促褐变严重影响了食品的感官品质，使得食品的保质期缩短和价值显著降低，不少新鲜食品的销售市场因此受到限制[1]。
本文介绍了多酚氧化酶的酶学性质以及相应的抑制方法，并对其应用做出论述。
关键词：多酚氧化酶；性质；抑制方法；应用多酚氧化酶（PPO）是自然界中分布十分广泛的一类末端氧化酶，属于铜金属酶类，其化学性质稳定，是植物叶子、果实等发生褐变的主要作用酶类[2]。
此外，还会引起食品的褐变，损害食品的感官风味质量[3-4]。
PPO普遍存在于植物、昆虫和真菌之中，甚至在腐烂的植物残渣上都还可以检测到它的存在。
因此该酶与果蔬的加工品质密切相关，科学家们很早就开始对它进行深入彻底的研究[5-6]。
农产品的酶促褐变与多酚氧化酶活性和含量密切相关。
这方面研究很多，酶促褐变不仅影响产品外观、风味、营养和加工性能，而且大大降低耐贮性，尤其对肉色较浅且容易碰伤的水果和蔬菜影响更为严重，产生的经济损失更大[7-9]。
通常PPO 与底物被区域化分开，PPO 在质体中以潜伏状态存在，而PPO 的底物存在于液泡中。
只有当植物体内发生生理紊乱或组织受损时，PPO 与底物的亚细胞区域化才被打破，PPO 底物被激活产生黑色或褐色的沉积物，这是果蔬等农产品酶促褐变的主要原因[10]。
1、多酚氧化酶的酶学性质与多酚氧化酶酶学性质的主要研究内容有：酶的分离和纯化、测定酶促反应的速度、了解影响酶促反应的因素等等[11]。
在分离和纯化时，一般是进行纯化，再将纯度高的PPO酶液进行酶学的性质研究[12-13]。
PPO活性检测则一般通过测定产物生长速度（初速度）来测定，通过采用分光光度法，即在一定波长下测定从醌生成的色素的吸光度，再根据吸光度来定义酶的活性大小[14]。
目前，已知的影响PPO酶促反应速度的因素主要有：温度、同一底物不同浓度、不同的底物、pH值、激活剂、抑制剂等[15]。
多酚氧化酶
六、多酚氧化酶活力测定
多酚氧化酶活力的测定方法可以分为两 类 ①测定底物消失的速度 ②测定产物生成的速度 ——限于测定反应的初速度。
PPO活性测定
终点法 多酚氧化酶催化分子态氧将酚类化合物氧化为醌 类反应，以儿茶酚为多酚氧化酶的底物，其氧化 产物在416nm处有最大光吸收。 测定系统：1.5ml 20mmol/L邻苯二酚（溶于 0.05mol/L,pH6.8KH2PO4-NaOH缓冲液中，然后再 加入0.1ml酶提取液，保温37º C，三氯乙酸终止反 应，并4000r/min离心5min，取上清液，适当稀释。 以空白为对照，用分光光度计测定其在416nm波长 下的O.D值。 酶活性单位为在测定条件下，每分钟引起吸光度 改变0.01所需的酶量
七、水果和蔬菜中的 多酚氧化酶及其底物
正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与 PPO酶存在于不同部位。这种分布是通过一系列 膜系统实现的，受膜屏障的作用，这种区域性的 分布阻止了底物和酶的相互接触，所以正常组织 是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物质的区 域化分布破坏，PPO与酚类物质接近并与其发生 化学作用，这将导致褐变。 水果有更大的有着较弱薄片成分的细胞，冷藏时 易发生细胞壁破裂，使PPO与酚类物质接触，产 生褐变。
2、植物中多酚氧化酶分布
多酚氧化酶是植物中最受注意的一种酶,在葡萄, 洋李,无花果,枣,茶叶和咖啡豆中含量很高,它在 这些果实中起着人们期望的作用. 多酚氧化酶在桃,苹果,香蕉,荔枝,马铃薯,莲藕 和莴苣中的含量也是相当高,然而它对这些果实 起着不需宜的作用,易引起褐变,造成变质和腐烂, 对于新鲜果实的保藏带来极大困难 胡椒中不存在多酚氧化酶. 存在: 植物、果蔬的叶绿体、线粒体, 马铃薯 块茎 分布广泛
食品酶学题库(有答案)
酶学题库1.下列哪种剂型的酶最方便于在食品生产中使用：AA．液体 B．粉剂 C．颗粒 D．纯酶结晶2.酶制剂的生产主要来源于：DA.动物组织提取法；B.植物组织提取法；C.化学或生物合成法；D.微生物发酵法；3.蛋白酶按其活性部位分为：CA．胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶 B．肽链端解酶、肽链内切酶C．丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶 D．水解酶、裂合酶4.酶委员会根据酶所催化的反应的性质将酶分为六大类，包括氧化还原酶、转移酶、裂合酶等，不包括以下哪种类型：BA.水解酶B.裂解酶C.异构酶D.连接酶5.以吸附法固定化酶，酶与载体之间的结合力不包括：BA．范德华力 B．疏水相互作用 C．双键 D．离子键6.根据酶的电荷性质进行酶的分离纯化方法不包括：A．离子交换 B．电泳 C．等电聚焦 D．离心沉淀？7.有关米氏常数Km叙述不正确的是：A．Km是酶的一个特征性常数：也就是说Km的大小只与酶本身的性质有关，而与酶浓度无关。
B．Km值还可以用于判断酶的专一性和天然底物，Km值最小的底物往往被称为该酶的最适底物或天然底物。
C．Km可以作为酶和底物结合紧密程度的—个度量指标，用来表示酶与底物结合的亲和力大小。
D．某个酶的Km值已知时，无法计算出在某一底物浓度条件下，其反应速度相当于Vmax的百分比。
8.下图表示的是可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别，叙述正确的是：A．曲线1为无抑制剂；曲线2为不可逆抑制剂；曲线3为可逆抑制剂B．曲线1为无抑制剂；曲线2为可逆抑制剂；曲线3为不可逆抑制剂C．曲线1为不可逆抑制剂；曲线2为无抑制剂；曲线3为可逆抑制剂D．曲线1为不可逆抑制剂；曲线2为可逆抑制剂；曲线3为无抑制剂9.在一些用发酵方法加工的鱼制品中，由于鱼和细菌中什么酶的作用，会使这些食品缺少维生素B。
A．硫胺素酶 B．蛋白酶 C．胃蛋白酶 D．胰蛋白酶10.在科技文献中，当一种酶作为主要研究对象时，在文中第一次出现时可以不标明酶的：A．系统名 B．数字编号 C．酶的来源D．生产商11.下列有关SOD叙述不正确的是：A．SOD是一类含金属的酶；B．SOD存在于几乎所有靠有氧呼吸的生物体内，从细菌、真菌、高等植物、高等动物直至人体均有存在；C．SOD分子中不含赖氨酸，芳香氨酸也很少，能抗胃蛋白酶水解；D．SOD是氧自由基专一清除剂，在照射前供给外源性SOD，可有抗辐射效果。
多酚氧化酶
是价格较贵。
㈢生物技术
• 通过对果蔬基因改良,选育抗褐变新品种,达到
抑制褐变的目的。目前较成功的是反义RNA。 由于生物技术可以免除繁琐的灭酶工艺,避免 使用抗氧化剂带来的潜在隐患,具有广阔的前 景。
• 关于果实酶促褐变方面的研究很多，褐变机理也比较
复杂，目前尚未完全弄清。关键问题集中在对PPO及
PPO的催化反应的机理
• ⑴酶活性中心的两个铜原子与O2结合，以氧原子为 桥，两个氧原子仍有键连，酶本身由脱氧型变成含氧 型。
⑵含氧型酶与邻二酚结合，二个羟基中的氧分别结
合在二个铜原子上，同时释放出2个氢离子。
• ⑶酶、氧及邻二酚形成的复合物与二个氢离子在氧桥上结
合，并释放出苯醌。
• ⑷间氧型酶与第二个邻二酚分子结合，结合位点与第一步 相同， 但两个铜原子之间的一个OH基与氢离子结合，生 成一分子水和一个氢离子。
其底物的研究以及采后贮藏环境对酶促褐变的影响。 酶促褐变与果实衰老有密切关系，衰老过程中酶与底 物的分区定位遭到破坏是导致酶促褐变的主要原因。 PPO合成基因的表达可能与衰老有关。对PPO的深入研
究有望从分子水平上搞清酶促褐变的机理，为控制酶
促褐变提供新方法。
• 改变PPO基因的表达 利用反义RNA技术反向表达PPO基因，修饰转基 因植株中多酚氧化酶基因的表达，从而控制酶促 褐变。
植物
微生物
• 广义上，PPO可分为单酚氧化酶、双酚氧化酶、漆酶
1.植物中的多酚氧化酶
• 在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、 豆类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中， PPO是与内囊体膜结合在一起的，天然状 态无活性，但将组织匀浆或损伤后PPO被 活化，从而表现出活性。 • 在高等植物组织发生褐变
8.食品酶学-多酚氧化酶
多酚氧化酶
一、多酚氧化酶的名称和自然界的分布
1、多酚氧化酶的名称
多酚氧化酶(1,2-苯二酚:氧 氧化还原 酶,EC 1.10.3.1) 一类含铜的氧化还原酶，催化邻-苯二酚 氧化成邻-苯二醌，也能作用于单酚单加 氧酶的底物。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚 或多酚形成对应的醌。 在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：
植物中存在的多酚氧化酶在天然状态下一般以非 活性形式存在。可以通过高盐处理、机械损伤、 酸碱刺激或在尿素、表面活性剂、蛋白酶以及胰 酶的作用下活化。
激活机制主要包括：增溶作用、同工酶的互变和 分子修饰作用，以及酶-抑制剂复合物的分离和 蛋白酶的水解等使酶构象发生变化。
2.抑制剂和果蔬酶促褐变的防止
多酚氧化酶在桃,苹果,香蕉,荔枝,马铃薯,莲藕和 莴苣中的含量也是相当高,然而它对这些果实起着 不好的作用,易引起褐变,造成变质和腐烂,对于果 蔬贮存及加工过程中的品质有重要影响。
热带水果50%以上的损失都是由于酶促褐 变引起的.同时酶促褐变也是造成新鲜蔬 菜例如莴苣和果汁的颜色变化,营养和口 感变劣的主要原因
抗坏血酸抑制酶褐变的机理（图）
（4）酶活抑制剂
亚硫酸类是最常用的多酚氧化酶抑制剂。 常用的有：二氧化硫、亚硫酸钠、 亚硫酸氢钠、 焦亚硫酸钠、低亚硫酸钠(Na2 S 2 O 4 )
如：在蘑菇、马铃薯、桃、苹果等加工中，常用
二氧化硫及亚硫酸盐类作护色剂。 防止褐变的原因有三： a.抑制多酚氧化酶活性 b.将醌还原为酚 醌反应生成无色加成产物
多酚氧化酶活性具有强烈的抑制作用,能有效
地防止褐变引起的质量问题。
思考题
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理5min, 90℃处理2min,多酚氧化酶活性基本丧失。 考虑到马铃薯淀粉加热可能变性的特点,在加工中 不宜采用热处理的方法防止褐变。
马铃薯中多酚氧化酶的最适pH为6.6,在pH6-7
之间酶的活力较高,在加工中应尽量避开此pH
范围,可采用pH4.5左右来加工。
二巯基丙醇,亚硫酸钠,半胱氨酸,抗坏血酸对
4.马铃薯
马铃薯块茎中多酚氧化酶的活力和多酚的分布是 不均匀的。在块茎外部，酶的活力最高，而在脐、 芽眼和皮中，酚类化合物浓度最高。 贮藏期间，在马铃薯块茎的外部，多酚氧化酶活 力和多酚的含量增加，而在内部多酚氧化酶活力 减少 马铃薯中酪氨酸的含量是决定褐变速率的主要因 素。
马铃薯中多酚氧化酶的最适温度为30℃,在80℃处
常用的酸有：柠檬酸、苹果酸、磷酸、抗坏血 酸、混合酸。
柠檬酸可降低pH，还可络合酚酶辅基Cu2+，但单
独用效果不大。常与抗坏血酸、亚硫酸合用。
实践证明：0.5%柠檬酸 + 0.3%抗坏血酸效果好。
抗坏血酸不但能降低体系pH，而且具有还原剂
的作用，可将体系中的醌类及其衍生物还原成
酚，并通过自身氧化来减少体系的含氧量。
即：多酚类物质、多酚氧化酶、氧气
除去多酚类物质困难，不现实。 ∴一般为 降低多酚氧化酶活性、驱氧
(1)加热钝化酶活性
75～95℃、5～7S的加热处理，可使大部分酶 活性丧失。 常用的方法有：漂烫、巴氏杀菌 加工中，必须严格控制时间和温度。 加热温度过高，加热时间过长，可抑制酶褐变， 但会影响食品品质；加热不足，不能抑制酶褐 变。 微波加热，热穿透力强，迅速均匀，不影响风 味。
酶促褐变:较浅色的水果、蔬菜在受到机械性 损伤（削皮、切片、压伤、虫咬、磨浆、捣碎） 及处于异常环境变化（受冻、受热等），在酶 促催化下氧化而呈褐色，称为酶促褐变。
西瓜、香瓜、桔子、柠檬 无酚酶，不褐变。
实例1：土豆的褐变
实例2：含有儿茶酚水果的褐变
褐变防止方法 酶促褐变的三个条件，缺一不可。
多酚氧化酶活性具有强烈的抑制作用,能有效
地防止褐变引起的质量问题。
思考题
简述酶促褐变的机理及其控制措施。
控制果蔬加工和贮藏过程中酶促褐变。
多酚氧化酶在植物中的含量随品种不同而有很大 变化，在众多的水果和蔬菜中，橄榄中的多酚氧 化酶活力最高。
多酚氧化酶的活力分布还取决于果蔬的成熟度。 在植物叶片中，很大一部分酶活力集中在叶绿体 中，在马铃薯块茎中，几乎集中在亚细胞部分中； 在新采收的苹果中，多酚氧化酶几乎全部存在于 叶绿体和线粒体中。
1.催化反应
多酚氧化酶可以催化两种不同类型的反应： （1）一元酚羟基化，生产相应的邻二羟基化合物
（2）邻二酚氧化，生成邻醌类物质。
反应机制：氧首先与酶结合，然后邻二酚与酶结合，接 着氢从酚转移到Cu2+形成氢过氧化络合物，此结合物 再同第二个邻二酚结合，反应中没有自由基中间物形 成。
两种反应都需要有分子氧的参与。
五、多酚氧化酶的分子形式
多酚氧化酶有多种分子形式
原因：①类似的亚基不同程度的聚合；②不 同亚基不同方式的结合;③酶蛋白质构象的改 变;④前三种情况的结合。
多酚氧化酶多种分子形式之间的差别表现在 底物特异性、最适pH、温度稳定性、对抑制 剂敏感性、氧化和羟基化活力的差别。
六、多酚氧化酶活力测定
多酚氧化酶的提取方法：
丙酮粉法 匀浆法 匀浆浸提法
多酚氧化酶的测定方法：
（1）检压法：在一定温度、pH和基质浓度下， 多酚氧化酶氧化基质的速度与单位时间内的耗 氧量成正比。用瓦氏呼吸计测定耗氧率。
（2）氧电极法：利用氧电极测定反应中的耗 氧量来表示酶活力
（3）分光光度法：多酚氧化酶催化邻苯二酚 氧化成有色产物，单位时间内有色产物在 460nm处的吸光度与酶活强弱成正比。
（4）碘量滴定法 分光光度法操作简单，结果准确，最为常用。
七、水果和蔬菜中的多酚氧化酶及其底物
正常条件下，在未受损水果中，酚类物质是与多 酚氧化酶存在于不同部位。这种分布是通过一系 列膜系统实现的，受膜屏障的作用，这种区域性 的分布阻止了底物和酶的相互接触，所以正常组 织是不发生褐变的，一旦膜系统受损，使物质的 区域化分布破坏，多酚氧化酶与酚类物质接近并 与其发生化学作用，这将导致褐变。
单酚氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)
双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse, EC.1.10.3.2) 漆酶(对苯二酚氧化酶 laccase,EC.1.10.3.1)。
现在所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化 酶和漆酶的统称。 在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要 分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主 要包括漆酶和酪氨酸酶。
第八章
多酚氧化酶
一、多酚氧化酶的名称和自然界的分布
1、多酚氧化酶的名称
多酚氧化酶(1,2-苯二酚:氧 氧化还原 酶,EC 1.10.3.1) 一类含铜的氧化还原酶，催化邻-苯二酚 氧化成邻-苯二醌，也能作用于单酚单加 氧酶的底物。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚 或多酚形成对应的醌。 在广义上，多酚氧化酶可分为三大类：
果蔬中不同的部位的多酚氧化酶含量差别很大， 例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。
茶叶中的多酚氧化酶分为游离态和结合态，前者 主要存在于细胞液中，属可溶态多酚氧化酶；后 者主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中，与这 些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态。
二、多酚氧化酶催化反应及其作用底物
1.苹果中多酚氧化酶
多酚氧化酶是引起苹果褐变的重要原因之一 在苹果生长过程中，总酚含量逐渐下降，至成熟 期稳定，酶活力变化趋势与总酚类似。未成熟的 苹果比成熟的更易褐变 在大多数情况下，酶促褐变倾向在保藏期间是增 加的。 机械损伤可引起酶促褐变，但褐变的速率起初较 高，随后下降到零。
2.梨中的多酚氧化酶
2.温度对多酚氧化酶活力影响
不同种类、品种、部位的多酚氧化酶有不同的热 稳定性，通常最适温度在常温
加热易使酶失活 同一来源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同 的热稳定性
低温下多酚氧化酶的活力也有明显的下降，但活 性下降比较缓慢
四、多酚氧化酶的激活剂、抑制剂和果蔬酶 促褐变的防止
1.激活剂
多酚氧化酶活性的抑制方式： 化学抑制：硫脲、EDTA、巯基乙醇、亚硫酸钠、 柠檬酸、抗坏血酸、4-羟基苯甲酸酯等。 物理控制：改变贮藏环境的气体成分、热处理、 高压灭菌、辐射、超声处理等。 分子生物学方法：利用转基因技术阻碍多酚氧 化酶的表达、使用反义RNA技术降低多酚氧化 酶活性等。
植物中存在的多酚氧化酶在天然状态下一般以非 活性形式存在。可以通过高盐处理、机械损伤、 酸碱刺激或在尿素、表面活性剂、蛋白酶以及胰 酶的作用下活化。
激活机制主要包括：增溶作用、同工酶的互变和 分子修饰作用，以及酶-抑制剂复合物的分离和 蛋白酶的水解等使酶构象发生变化。
2.抑制剂和果蔬酶促褐变的防止
最适pH因酶的来源和底物的不同存在较大的差异。
多酚氧化酶的最适pH
(1)最适pH：4～7 (2)不同种类，不同品种的果蔬甚至果蔬的不同部 位得到的多酚氧化酶的最适pH也存在差异 (3)酶的提取或分离的方法对它的最适pH也有影响 (4)测定酶活力时所采用的底物和缓冲液对酶的最 适pH也有影响 (5大多数多酚氧化酶只有一个最适pH,在一些情况 下, 有第二个最适pH
(2)螯合酶促作用的金属离子
多酚氧化酶是以铜作为辅基的金属蛋白。
金属（铁、锡、铝等）离子是多酚氧化酶的激 活剂。 柠檬酸对Cu2+有螯合作用。 EDTA是一种金属离子螯合剂，可阻止金属离子 对褐变反应的促进作用，但其与作用对象有关， 有的效果则不明显。
(3)酸处理法
多数酚酶最适pH＝6～7，pH < 3失活(高酸性 环境会使酶蛋白上的铜离子解离下来，导致多 酚氧化酶逐渐失活，酶活性趋于最低。)
2.作用底物
水果、蔬菜中底物为： 一元酚类 邻二酚类（对位二酚也可） （间位二酚不作底物） 如： 水果中的儿茶酚
OH OH
土豆中的酪氨酸 HO CH2CHCOOH
NH2
重要的天然底物
影响多酚氧化酶作用的因素
一元酚和二元酚取代基的位置 较高的底物专一性 底物的相对专一性因来源不同而变化
多酚氧化酶在桃,苹果,香蕉,荔枝,马铃薯,莲藕和 莴苣中的含量也是相当高,然而它对这些果实起着 不好的作用,易引起褐变,造成变质和腐烂,对于果 蔬贮存及加工过程中的品质有重要影响。
热带水果50%以上的损失都是由于酶促褐 变引起的.同时酶促褐变也是造成新鲜蔬 菜例如莴苣和果汁的颜色变化,营养和口 感变劣的主要原因
多酚氧化酶蛋白包含两部分：
催化氧化与羟基化
羟基化活力容易损失（与小分子辅助因子
有关）
酶活力对来源不同的酶有很大差异
酶促褐变
多酚氧化酶催化的氧化反应的最初产物邻位醌将继 续变化。
①相互作用生成高分子量聚合物。
②与氨基酸或蛋白质作用生成高分子复合物。 ③氧化那些氧化还原电位较低的化合物。 其中①②导致黑色素的生成，反应③的产物是无 色的。
梨多酚氧化酶仅作用于邻苯酚,对于对苯酚、 间苯酚和一元酚无作用 以儿茶酚为底物,该酶的最适pH为6.5,在30℃ 活性最强.