细胞培养基本知识基本技术

• 卡氏瓶培养法
• 1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培 养法，首建长期传代的L-细胞系。
• 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
• 从50年代末开始，组织培养技术应用进入 了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和 医学研究各个领域。
无血清培养
无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在
消化液
• 分离组织和分散细胞 • 常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA) • 单独或混合使用
• 胰蛋白酶溶液：
•
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的 肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞 骨架，从而使细胞分离。
• •
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过 一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
• 饱和密度：在特定条件下，培养器皿内能
达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞 群体停止繁殖。
• • • •
潜伏期/滞留期 指数增长期 平台期/停滞期 退化或死亡
• 细胞系的生长过程
• 细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为
细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。
• 细胞株：通过筛选或克隆化，从原代细胞或细胞
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
•
•
胰蛋白酶溶液配制 • 胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平 衡盐溶液（常用浓度为0.25% ）搅拌混匀， 置室温 4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 • 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌， 分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解 失效）， • 胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠 溶液调 pH 至7.2 左右
培养板培养法
方法：将培养细胞接种在培养 板的孔内，然后在CO2培养箱 内培养。应培养量较小也称为 微量培养。
悬滴培养法也称植块悬滴培养法，是最早
建立的体外培养技术
基本要点：将组织或器官植块接种在一张盖
玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使 植块及营养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹 形载片之上，最后用溶蜡密封后放入培养箱中 培养。
气相和PH
• 5% CO2 + 95%空气混合气体（O2）。 • CO2既是细胞生长所需，同时又是细 胞代谢的产物，并与维持培养基的PH 有关。 • 最适PH 7.2 – 7.4 • 低于PH 6.8或高于PH7.6可能对细胞有 害，甚至死亡。
• 抗菌素的使用：
• 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可 能存在的细菌的生长。 • 通常是青霉素和链霉素联合使用。 • 最终使用浓度为每毫升100单位。 •
制备1000ml RPMI 1640培养基
RPMI 1640 干粉培养基10.4g（1包） 超纯水 400ml ↓ 磁力搅拌至完全溶解 ↓ 加超纯水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有 0.22μm 孔径滤膜的过滤器除菌，分装200ml/瓶， -20℃保存备用。 用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的 小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。加青霉素 和链霉素至终浓度各为100U/ml。
化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿……
二、培养细胞生长的条件
营 养 需 要 环 境 要 求 无毒及无污染
1 、细胞的营养需求
• （1）氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子 • （2）促生长因子等 • • • • • 完全培养基的组成： 基础培养基 血清 碳酸氢钠 青、链霉素
80％一95％ 5％一20％ 2.0 g/L 各100单位／毫升
系中获得具有特殊性质或标志物的细胞。
• 细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状
上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系
• 有限细胞系：如果不能
继续传代或传代有限， 可称为有限细胞系。
• 连续细胞系：能够连续
传代的细胞叫做“连续 细胞系或无限细胞系。 可培养50代以上并无限 培养下去。
• 大多数的二倍体细胞为 有限细胞系。无限细胞 系大多已发生变异。
三维细胞培养技术
• 将具有三维结构不同材料的载体与各种不 同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能 够在载体的三维立体空间结构中迁移、生 长, 构成三维的细胞-载体复合物。
• 普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失 了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在 体内进行, 但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境 相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程，且难以研究中 间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验 之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现 细胞培养的直观性及条件可控性的优势。
KCl KH2PO4 NaCl NaCO3 Na2HPO4 D-Glucose 0.40g 0.06g 8.00g 0.35g 0.048g 1.00g
Phenol Red
0.01g
2、 环境要求
• 细胞培养必须具备细胞生存并繁殖的 生理学能接受限度内的物理化学特性
• （1）温度 • （2）气相 • （3） PH
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
• 目前常用的三维培养模型： 基质覆盖培养 旋转烧瓶培养 微载体培养 预置支架培养 旋转细胞培养系统 自发性细胞聚集
细胞培养技术的特点及应用
优点：
1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
• 血清质量好坏是实验成败的关键。 • 常用血清： 胎牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等， 以胎牛血清质量最好。
• 优质血清的标准： 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。
pH 调整液
• NaHCO3 溶液（碱）
▫ 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高 压灭菌，分装，4℃保存
Байду номын сангаас
温度
• 体外培养的细胞需要在保持一定恒温的环境中才 能生长。在达到最适温度（37°）前，一般细胞 繁殖率因温度的升高而增加，但是，温度逐步升 高并超过最适温度时，繁殖会被抑制。 • 当温度在25°- 35°，细胞的生长速度很慢，但 能够生存；细胞在4°也能存活数天；只要温度 不低于0°，细胞都能生存；加了保护剂还能放 到液氮中保存。 • 当高温时，在41°- 42°中培养1h，细胞损伤严 重，43°以上，则多数细胞死亡。 • 高温比低温对细胞的影响更为明显。
• HEPES（分子量238.31）溶液
▫ 一种弱酸，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 ▫ 主要作用:防止培养基pH迅速变动。 在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的 环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此 时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加 HEPES ▫ 使用终浓度一般为10-50mmol/L ▫ 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤 除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml 培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L
• 高等生物体，细胞周期时间的长短变化主 要集中在G1期，S，G2和M期基本保持稳 定。
• Hela 8-16h 5-9h 2-8h
20-28h
一群细胞的增殖：细胞生长曲线
• 接种后，每天进行检测计数，以细胞数为 纵坐标，以时间为横坐标，绘制成曲线。
• 测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞 活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本 参数之一。
体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含 个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加 组分两大部分。
观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他 生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子； 又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、 生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获 得它们的分泌产物。 往往针对性很强，价格偏高。
细胞增殖密度抑制
• 当细胞生长汇合形成单层时，细胞变得比 较拥挤，这时其分裂停止，这种细胞可在 静止状态下维持存活一段时间，但不会继 续分裂生殖。
• 转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们 的接触抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以 增殖至较高的终末细胞密度。
培养细胞的特性3 -生长过程
• 单个细胞增殖：细胞周期
细胞培养的基本知识、 基本技术
医学院 中心实验室 谷景义
主要内容： •1、细胞培养基本知识
•2、培养细胞生长的条件
•3、细胞培养的基本技术
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
基础培养基的选择
参考： (1）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养 基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。
(2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多 种细胞。
(3) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长 曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基， 这是最客观的方法，但比较繁琐。 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、 DMEM-低糖（标准型）、DMEM-F12 等……
缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体 内的细胞。
应用
• 病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产…… • 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体…… • 遗传学：染色体分析…… • 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物…… • 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变…… • 细胞毒实验：药效测试…… • 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分
• 原代细胞：从机体取得组织材料，在体外
培养生长，到第一次传代前。
• 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段
时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。
培养瓶培养法
方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放 入培养箱进行培养。
优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物 的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作， 以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。 • 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。 • 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
血清
• 热灭活：56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清 (目前少用） • 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做 细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。 热处理造成血清沉淀物增多，影响血清质量。 甚至严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。 • 血清中的沉淀物
– 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成， 这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 – 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成 会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常 误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生 长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批 号的血清
EDTA· 4Na 溶液
• 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用， 而且毒性小，价格低廉，使用方便 • 常用工作液浓度为0.02%。 注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液 冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长
D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)
• 1907 年 -Harrison用细胞培养解决一个难题
• 盖玻片覆盖凹型载玻片悬滴培养法
悬滴培养法基本步骤
1、在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆和 植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。 2、在凹载片周围涂凡士林。将凹载片向 下压向盖玻片 3、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。 放入培养箱培养
• 1910 至 1923年 – Carrel 和早期的组织培养