椿皮中二氯甲烷提取部位化学成分及其抗肿瘤活性以及分散片制备工艺与质量标准的研究

椿皮中二氯甲烷提取部位化学成分及其抗肿瘤活性以及分散片

制备工艺与质量标准的研究

第一部分椿皮中二氯甲烷提取部位化学成分的研究臭椿(Ailanthus altissima Swingle)又名樗木,为苦木科(Simaroubaceae)臭椿属落叶乔木,因叶上油腺破裂后有奇臭而得名,为中国本土树种,在我国分布广泛,除黑龙江、吉林和海南省外,全国各地均有分布。于18世纪作为观赏植物传入北美和欧洲,到目前为止,臭椿已经在欧洲广泛分布,同时分布在美国各地,现在已成为美国七个主要树种之一。

椿皮为臭椿的干燥树皮或根皮,为我国民间常用中草药,具有清热、燥湿、止血、消炎、杀虫等功效,可用于治疗子宫出血、赤白带下、久泻久痢、湿热泻痢、便血及崩漏疾病。近年来研究表明,椿皮的提取物中因具有抗阿米巴原虫活性,

故可作为除虫剂使用,同时经研究证实,它还具有明显的抗癌作用,可用于治疗结肠癌、宫颈癌、直肠癌等癌症,还具有抗非洲淋巴细胞瘤病毒和抗结核菌的作用。

椿皮主要化学成分有苦木苦味素、挥发性成分、萜类化合物、生物碱类等,其中最引人注目的化学成分就是苦木苦味素,而苦木苦味素类化合物多为四环二萜内酯及五环二萜内酯,是苦木科植物的特征性成分。臭椿属是苦木苦味素类化学成分比较集中的属级单位,而臭椿是臭椿属中研究比较多的一种药用植物,本

研究对臭椿皮的化学成分中二氯甲烷提取部位进行了研究。

目的：以椿皮为研究对象,利用各种分离手段对其化学成分尤其是苦木苦味素类化学成分进行系统研究,并采用波谱学及光谱学方法,包括：13C-NMR,1H-NMR, HMQC,COSY, HMBC, NOESY等方法对分离得到的单体化合物进行平面结构和立体

结构的鉴定,为发现新的药物先导性化合物奠定基础。方法：取干燥的椿皮50 Kg,

以95%乙醇热回流提取,浓缩后得到总提物。

将总提物分散在饱和氯化钠溶液中,分别以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取,分别浓缩,得到各提取部位,其中二氯甲烷萃取部位260 g。采用硅胶层析、葡聚糖凝胶、制备薄层和制备高效液相色谱法对上述二氯甲烷萃取部位的化学成分进行分离,得到的单体化合物采用现代化的分析方法如13C-NMR,’H-NMR, HMQC, COSY, HMBC和NOESY鉴定其化学结果。

结果：从椿皮中分离并鉴定了9个化合物,鉴定结果如下：vanillin (1), stigmast-4-en-3-one (2), isoailanthone (3), shinjudilactone (4), ailanthone (5), shinjulactone B

(6),6a-tigloyloxychaparrin(7),2-dihydroailanthone (8),

12-dihydroisoailanthone (9).第二部分椿皮中二氯甲烷提取部位及化合物抗肿瘤活性的研究椿皮始载于我国第一部药典《唐本草》中,为我国传统中药材,古时所用椿皮系指香椿和臭椿的干皮或根皮,其中以臭椿皮为好。我国历代都有对椿皮药用的记载：《食疗本草》载其有治痢疾、杀蛔虫之效；《活性论》中记载臭椿皮能治疗赤白痢、肠滑、痔疾泻血不止；《妇人良方》中记载用,以臭椿根与汉椒焙烧,加连根葱同煎后熏洗,可治疗妇女产后肠脱不收,与蜂蜜水煎服可治疗痔疮,单用椿皮的水煎液可治疗疮癣等。

现代药理学研究发现,椿皮除了具有上述传统功效外,还兼有抗肿瘤、抗结核菌、抗EB病毒、抗阿米巴、抗疟等作用,尤以抗肿瘤作用明显,其所含的化学成分苦木苦味素有治疗结肠癌、宫颈癌、直肠癌等作用,是目前药理学研究的热点之一。本研究将椿皮的抗肿瘤活性研究作为分离、纯化和精制椿皮中各个化合物的重要依据,以“重在应用,面向开发”为本研究的指导原则。

目的：以臭椿皮为研究对象,利用现代化的肿瘤细胞活性筛选技术手段,对椿皮中的各个提取部位以及各分离、纯化和制备的化合物进行系统的抗肿瘤活性筛选,以各个组分的肿瘤细胞增值抑制率为指标进行活性分析。分别以ailanthone 和2-dihydroailanthone为代表化合物进行抗肿瘤作用机制的研究。

方法：1以MTT法检测不同提取部位及化合物的抗肿瘤活性。试验设空白对照组、DMSO溶剂对照组及待测药物组(提取部位的浓度分别为1μg/mL,10 μ

g/mL和100 μg/mL;化合物的浓度分别为0.01 μg/mL,0.1μg/mL,1 μg/mL,10 μg/mL和100μg/mL)。

2 Ailanthone和2-dihydroailanthone对MCF-7人乳腺癌细胞和U251人神经胶质瘤细胞抗肿瘤作用机制的研究。以浓度不同浓度的ailanthone和

2-dihydroailanthone分别对两种肿瘤细胞进行增殖抑制率检测、细胞凋亡检测、细胞周期检测以及RT-PCR检测Bax和Bcl-2 mRNAd的表达和Western blot法检测Bax及Bcl-2蛋白表达的研究。

结果：1测定了不同提取部位及化合物抗肿瘤活性的筛选,实验结果显示,对于13个肿瘤细胞株而言,不用的提取部位及化合物具有不同的抗肿瘤活性,而化合物2和4在高、中、低三个浓度的抗肿瘤活性均比较低。对化合物1、3、5、和6的IC50值进行了测定。

实验结果显示,以上4个化合物对不同的肿瘤细胞的IC50值是不相同的,在13种肿瘤细胞上进行的IC50值测定数据显示,化合物5、6对13个肿瘤细胞的

IC50值小于阳性药顺铂(cisplatin),表明它们对13个肿瘤细胞的抑制作用优于阳性对照药顺铂；化合物3对U251、Hela、AsPC-1、HCT116、AGS、SMMC-7721、U-2OS、CCRF-CEM细胞的IC50值均小于阳性对照药顺铂,表明化合物3对这9个

肿瘤细胞的抑制作用优于阳性对照药顺铂。化合物1对U251、Hela、HCT116、AGS、SMMC-7721、U-2OS、CCRF-CEM细胞的IC50值均小于阳性对照药顺铂,表明化合物1对这7个肿瘤细胞的抑制作用优于阳性药顺铂。

结果评定：合成化合物或植物提取纯品的IC50<10 μg/mL或植物提取物的IC50<20 μg/mL时,则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀灭作用。2不同浓度的ailanthone作用MCF-7人乳腺癌细胞24 h、48 h以及72 h后,MCF-7人乳腺癌细胞的存活率分别逐渐降低,表明ailanthone对人乳腺癌MCF-7细胞的生长有明显的抑制作用,而且呈现时间和浓度的双重依赖性。

而不同浓度的2-dihydroailanthone对U251人神经胶质瘤细胞的抑制作用也同样很明显。流式细胞仪检测不同浓度的ailanthone和2-dihydroailanthone 分别作用于MCF-7人乳腺癌细胞和U251入神经胶质瘤细胞48 h后的凋亡实验结果表明,凋亡率明显高于空白对照组,且随药物浓度增高细胞凋亡率明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。

而不同浓度的药物作用于肿瘤细胞48h后的细胞周期实验结果表明,G0/G1期的细胞百分比逐渐增加,而S期和G2/M期的细胞百分比逐渐降低,表明细胞阻滞发生在G0/G1期。通过RT-PCR检测发现,不同浓度的ailanthone和

2-dihydroailanthone分别作用于人乳腺癌MCF-7细胞和U251人神经胶质瘤细胞48 h后,Bax/gapdh的百分比逐渐升高,而Bcl-2/gapdh的百分比逐渐降低,实验结果表明,Bax mRNA的表达随药物浓度的增加而上升,Bcl-2 mRNA的表达随药物浓度的增加而降低,呈现一定的剂量依赖性,说明这两种药物能增加Bax mRNA 的表达,并抑制Bcl-2 mRNA的表达,且具有一定的量效关系。

Western blot法检测Bax及Bcl-2蛋白表达结果。不同浓度的ailanth one