色谱分离过程
天然药物化学第二章,第三节,色谱分离
薄层色谱的操作技术流程
铺
板
点
样
展
开
计算比移值
显色与定位
二、吸附色谱法
（五）操作技术 1.薄层色谱法 步骤：制板→点样→展开→显色→Rf值计算
43
操作步骤
（1）软板的制备
软板：直接将吸附剂(我们有哪些吸咐剂）铺在玻璃板上制 成，不加粘合剂 要求：厚度→随分离要求而定，一般0.25～0.5mm 玻璃棒推动速度不宜过快、也不应停顿→影响厚度均一性
5
植物色素分离图示
一、分离原理和基本概念：
色谱法： 是利用混合物中各成分在 流动相和固定相之间的 作用力和亲和力（吸附， 分配，离子交换、分子 筛）的不同，在两相中 作相对移动时，混合物 中各种成分随流动相运 动速度不同，从而达到 相互分离的方法。
7
8
色谱分离
慢 中等 快
淋洗液
Temporal course
适用范围
酸性成分：氨基酸、有机酸； 对酸稳定的中性成分 生物碱、甾体、强心苷
备注
不适用：醛、 酮、酯、内酯 类成分
中性成分：醛、酮、皂苷、萜 中性 6.5~7.5 类
★
27
常用吸附剂
2.硅胶（应用最多★） 吸附能力决定于硅羟基数，吸附活性取决于含水量。
OH Si O O Si O O O O O OH Si O Si O O Si O O O OH Si O Si O O Si O O O OH Si O Si O O O OH Si O Si O O O
炭。
二、吸附色谱法
（二）吸附剂（固定相） 选择合适的吸附剂是吸附色谱法成功的关键。★ 良好的吸附剂应具备： ①不与样品及流动相发生化学反应 ②不溶于流动相 ③具有较大的表面积和一定的吸附能力。 ④具有一定的细度，颗粒要均匀。
薄层色谱分离
薄层色谱分离
薄层色谱分离（Thin Layer Chromatography，TLC）是一种常用的色谱分析技术，用于分离化合物混合物中的组分。
它利用固定在薄层板上的吸附剂对化合物进行分离，并通过相对迁移率来定量或定性分析样品。
薄层色谱分离的基本步骤如下：
1.准备薄层板：将特定吸附剂涂布在玻璃、金属或塑料基板
上，形成薄而均匀的吸附层，通常用硅胶（Silica gel）或氧化铝（Alumina）作为吸附剂。
2.样品的制备：将待分析的混合物溶解在适当的溶剂中，并
按照需要进行前处理，如过滤或萃取。
3.样品的施加：将样品溶液施加到薄层板上，通常使用微量
吸管或毛细管在吸附层上形成一个小斑点。
4.开展色谱：将薄层板垂直放置在色谱槽或密闭的容器中，
让溶剂通过毛细作用（毛细管上升作用）自下而上渗透到吸附层中，并将化合物带上和分离。
5.可视化：待溶剂到达上部时，取出薄层板并立即使用不同
的可视化方法来可视化分离的斑点。
可使用紫外线灯、化学反应剂或染料等方法。
6.分析和解释：通过对斑点的迁移距离、颜色、形状和强度
进行比较和测量，对化合物进行分析和解释。
这通常涉及与标准物质的比较或进行色谱图谱分析。
薄层色谱分离技术具有操作简便、分析快速、结果直观等优点。
它广泛应用于药物分析、天然产物化学、食品分析和环境检测等领域。
高效液相色谱的分离和分析
高效液相色谱的分离和分析高效液相色谱（HPLC）是现代化学分析领域中最重要的分离技术之一。
它在食品、制药、生物技术、环境科学和研发等领域都有广泛的应用。
本文将从HPLC 的基本原理出发，介绍它的分离和分析方法，以及这种技术的优点和局限性。
一、HPLC的基本原理HPLC是基于分配系数的原理，它利用固定相和移动相之间的相互作用来分离化合物。
固定相是一种由颗粒状或均匀涂覆在支撑材料表面的成膜状材料，例如硅胶、碳等。
移动相是一种由溶剂混合物组成的流体，它会在固定相表面通过，与固定相相互作用。
利用HPLC进行分离的过程包括样品进样、移动相泵送、分离柱和检测器等四个步骤。
样品进入分离柱以后，会在固定相上被分离，所分离的成分将按照固定相的吸附能力和移动相的溶解能力来进行分离。
为了实现快速、高效的分离，通常我们会通过改变流速、操作温度和pH等参数来优化HPLC的分离效率。
二、HPLC的分离和分析方法在HPLC中，常用的分离方法主要包括反相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和层析和大小排除色谱等。
这些分离方法都具有不同的选择性和分离效率，因此它们可以用于分离许多复杂的混合物。
反相色谱是最常用的HPLC分离方法之一，它的固定相通常是极性低的碳氢化合物，而移动相则是一种极性高的溶剂体系，例如水-乙腈或水-甲醇混合物。
这种方法可以用于分离许多非极性化合物，例如蛋白质。
离子交换色谱则同时考虑样品的电荷，它利用固定相和移动相之间原子间相互作用而实现分离。
移动相是一个由缓冲溶液、盐和极性有机溶剂组成的混合物。
这种方法可以用于分离具有不同离子性质的化合物，例如金属离子和生物分子等。
凝胶过滤色谱则是一种根据分子尺寸实现分离的方法。
在实践中，它经常被用于生物分子的纯化和分离。
它的固定相通常是一种可逆性的凝胶，例如硅胶或者聚乙烯醇。
这种类型的柱子对大分子具有很好的分离效果，但是对小分子的分离效果相对较差。
亲和层析则是一种根据生物分子之间的相互作用实现分离的方法，例如抑制剂和受体之间的相互作用。
色谱分离的技术
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
色谱分离
高效液相色谱仪
高效液相色谱(HPLC)流程示意图
离子交换色谱
• 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团， 这些带 电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果 流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律， 这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相 基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子 交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可 用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫 做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2， 及－MH3+ ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－ COOH。其中-NH3+离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于 强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换 能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只 有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交 换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动 分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、 核苷和各种碱基的分离等。
色谱法的发展历程
◆ 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。 由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同， 一般分离需要几小时至几天。 ◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。 ◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gas chromatography,GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不 易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。 ◆ 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵 敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatograghy,HPLC）。
气相色谱法的分离和检测过程示意图当样品
Wb2
)
(Wb1 Wb2 )
分离度(R)反映了相邻两个组分色谱峰之间的距离大
小，实质表明了相邻的两个组分被分离的程度。分
离度越大，相邻两个组分色谱峰之间的距离就越大，
表明相邻二组分分离得越好。当 R = 1.5 时，两相
邻组分可认为已完全分离。
色谱峰所能提供的重要信息
1 样品中所含组分的最少个数 2 保留值---定性分析 3 色谱峰面积（或峰高）---定量分析 4 色谱峰的保留值和区域宽度---评价色谱柱的分离效能 5 根据相邻色谱峰之间的距离来选择合适的色谱分离条 件
(5)、相对保留值(1,2 )
相对保留值(1,2 )是指在一定的实验条件下组分1和组
分2的调整保留时间之比：
1,2
tR 1 tR 2
1,2仅与柱温及组分和固定相的性质有关，而与其它操
作条件如柱长、柱内填充情况、载气的流速等无关。
以上参数(2)～(5)都是与色谱峰的峰位(亦即出峰的 时间)相关的参数，又与气相色谱分离过程的热力学 性质密切相关。因此，色谱峰的峰位是反映被测组 分的热力学性质的重要参数，是气相色谱法进行定 性分析的主要依据。
由于不同组分的分配系数 K 值的大小不同，即组分在 固定相中的溶解和解析能力，或吸附和脱附能力有差异， 各组分在柱中的滞留时间就不同，在色谱柱中的运行速 度也就不同。分配系数 K 值越大，溶解或吸附就越强， 脱附或解析就越弱，在固定相滞留的时间就越长，在色 谱柱中前移的速度就越慢。随着载气的不断流过，各组 分在色谱柱中两相间经过反复多次地分配和平衡，当运 行了一定的柱长后，不同的组分就会拉开距离被分离开 来，最终随流动相(载气)分先后流出色谱柱，从而达到分 离的目的(如图中 t1～t4 所示)。在色谱柱后配以检测器 对各组分的流出时间和流出量进行检测，就可以对组分 进行定性和定量的分析。
色谱分离技术原理及其的应用
色谱分离技术原理及其的应用色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。
此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。
然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。
色谱法也由此而得名。
现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。
我们仍然叫它色谱分析。
一、色谱分离基本原理：由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。
色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。
使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。
当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。
由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。
与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。
二、色谱分类方法：色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。
从两相的状态分类：色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可GCLC）。
固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。
70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。
现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。
不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操作。
有机化学实验薄层色谱法分离原理解析
有机化学实验薄层色谱法分离原理解析有机化学实验薄层色谱法是一种经典的分离、结构鉴定和结构表征有机化合物的有效方法。
该方法主要是利用色谱分离技术，将有机物分离出来，从而实现结构特征的鉴定。
薄层色谱法主要包括两个步骤：第一步是用有机溶剂将目标物质溶解，然后把溶剂及溶解物的混合液均匀的均匀地涂布在薄层色谱板上；第二步是将薄层色谱板放入到色谱室内，室内的空气带有所需的吸收剂。
当控制空气流速时，吸收剂所携带的有机物会从高温到低温，从而形成一层层的梯度，有效实现对溶解物质的分离。
薄层色谱法的优点：
1、分离效率较高：薄层色谱法可以有效地将有机物的混合物分离成各种物质，可以满足高效率的分离要求。
2、质量检测准确：由于色谱的原理，可以准确的测量各种物质的含量，从而快速、精确地检验各种物质的质量。
3、操作方便：薄层色谱对于分析师来说，操作简单，只需把溶解物均匀的涂在色谱板上，便可快速实现物质的分离。
薄层色谱的缺点：
1、耗时长：由于要求空气流速的控制，色谱室的空气流速控制仍需要更多时间，时间上的浪费还不少。
2、受温度的影响较大：色谱室的温度影响。
色谱分离过程最终版ppt课件
R
)2 16( tR )2
n=L/H
Y1/ 2
其中L为色谱柱的柱长； H为理论板高度。
Wb
;.
24
考虑到组分在死时间内不参与柱内分配，用调整保留时间代替保留时间，得有 效塔板数和有效塔板高度：
n 5.54( tR )2
Y1/ 2
n有效
5.54(
t
' R
)2
Y1/ 2
16(
t
' R
)2
Wb
H 有效
;.
45
高效液相色谱仪
✓ 高效液相色谱是20世纪60年代末发展的一种以液体为流动相的色谱技术。
✓ 特点如下： ✓ 高压 一般可达（150~350）×105 Pa ✓ 高速 一般可达1~10mL/min ✓ 高效 ✓ 高灵敏度 ✓ 分析时使用样品少 一般仅几毫升
;.
46
高效液相色谱仪流程（图）
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
❖ 调整保留时间（t R ＇）：t R＇= t R－t M
;.
21
❖ 分离度
❖ 峰宽Wb：色谱峰拐点处的两条 切线与基线的两个交点之间的距 离；
❖ 半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的 峰宽，为2.35 ；
❖ 相邻色谱峰峰顶之间的距离除以 此二色谱峰的平均宽度。用R表 示：
t t R
r2 r1
2tr
;.
32
优点： ❖ 设备简单、操作方便、运行费用低； ❖ 分离时间短，工作效率高； ❖ 展开剂选择范围广，展开方式多样； ❖ 显色方便，检测手段丰富； ❖ 既可分析，又可制备； ❖ 试样一般不需要经过严格预处理即可分离。
色谱分离过程
• 流动相流速:
– 体积流速 (F): ml/min – 线性流速 (v): cm/min (mm/min)
• 两种描述溶质 “保留”的方法
– 保留时间, tr – 保留体积, Vr
• Vr = Ftr
• 分配系数 K = Cs/Cm
– C = 组分浓度 – s = 固定相 – m = 流动相
• Vs = 固定相体积 • Vm = 流动相体积
HB = B/v : B = 常数, v = 流速 V增大时 HB 减小
边界扩散的原因
• 传质阻力 (RMT):
流动相 缓慢的平衡. 固定相 宽度 宽度
HC = Cv : C = 常数, v = 流速 V减小时 HC减小
边界扩散的原因
• 涡流扩散 (非简单扩散):
时间
HA = A；A = 常数, 取决于颗粒大小
=v
1 1 + k′
色谱基础
• 保留时间, tr： 溶质从入柱到出柱所花费的 时间。
tr = v
L tr = 溶质流动速率 L 1 Vs 1+K Vm
柱长
tm = L v
色谱基础
• 保留时间, tr:
tr = tm (
Vs 1+K ) = tm (1+k’) Vm
保留体积, Vr: 保留时间乘以体积流率, F
– 有机溶质在火焰中燃烧产生 CH 基团 ，最终产生 CHO+
. + O.→ – CH
CHO+ + e-
– CHO+ 在阴极被收集, 产生电流作为响应
检测器
• 火焰离子检测器 (FID):
– 有机物 (使碳原子数减少) – 破坏性 – 线性范围 (>107) – 检测极限 ≈ 2 pg
简述气相色谱的分离原理
简述气相色谱的分离原理气相色谱（Gas Chromatography，简称GC）是一种广泛应用于化学分析领域的分离技术。
它是通过将混合物分离成单一组分并进行分析的方法，利用挥发性的气体作为载气，将混合物分离成各个组分，然后利用检测器对分离出的组分进行检测和定量分析。
气相色谱的分离原理是基于物质在固定相和移动相中的分配系数不同，使得各个组分按照一定的顺序被分离和检测。
以下将具体介绍气相色谱的分离原理。
一、分离原理：气相色谱分离原理是基于组分在固定相和移动相之间的物理和化学相互作用的差异来实现的。
分离的主要机制包括吸附、分区和解离等。
1. 吸附：吸附是指组分与固定相表面的物理吸附或化学吸附。
当样品通过柱子时，具有亲和力的组分会被固定相表面吸附，而无亲和力或亲和力较小的组分则较快通过。
吸附机制是常用的分离机制之一。
2. 分区：分区是指固定相与移动相之间的物理和化学分配。
固定相通常是涂在柱子内壁上的薄膜，移动相则是气体。
样品在移动相中溶解，然后在固相和移动相之间发生分配，根据其溶解度在两相之间分配的程度来分离。
分区机制是气相色谱的主要分离机制。
3. 解离：解离是指在色谱柱中的分子发生化学反应，产生离子，通过正负离子的移动来实现分离。
解离机制常用于分离极性化合物。
二、相关参考内容：1. 《仪器分析原理》（赵伟主编，高等教育出版社）- 第七章气相色谱分离原理该书介绍了气相色谱的基本原理和仪器原理，并详细解释了气相色谱的分离机制和方法。
2. 《现代色谱分离科学与技术》（吴进忠主编，化学工业出版社）- 第九章气相色谱该书详细介绍了气相色谱的原理、仪器和应用，并使用大量例子和图表来说明气相色谱的分离机制和方法。
3. 《色谱分析原理与技术》（陈忱，吴仁德主编，化学工业出版社）- 第四章气相色谱该教材详细介绍了气相色谱的原理、仪器和应用，并提供了实验操作和案例分析，有助于读者更好地理解和应用气相色谱。
4. 《分析化学原理》（吴裕民主编，人民教育出版社）- 第十章气相色谱该教材系统地介绍了气相色谱原理、仪器和应用，并提供了许多实例和实验操作，有助于初学者理解和掌握气相色谱的基本原理和技术。
液相色谱操作过程和特点
液相色谱操作过程和特点液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种分析技术，它利用液体流动相在固定相上的分配作用，将溶液中的化学物质分离、分析和定量。
液相色谱的操作过程通常包括样品制备、进样、色谱柱选择、流动相选择、洗脱条件优化、检测器选择、数据采集和处理等步骤。
具体操作过程如下：1. 样品制备：将待分析样品制备成溶液，通常需要进行样品提取、前处理、稀释等步骤，以获得适合进样的样品。
2. 进样：将样品溶液通过进样装置引入色谱系统中。
进样装置可以是自动进样器，也可以是手动进样装置。
3. 色谱柱选择：根据样品的特性和分离要求选择适合的色谱柱。
色谱柱通常有不同的分离机理，如反相、离子交换、大小排阻、手性和亲合等。
4. 流动相选择：根据样品特性和分离要求选择适当的流动相。
流动相可以是有机溶剂、水、缓冲液等，需要根据色谱柱和待分离化合物的相容性选择。
5. 洗脱条件优化：调整流动相的成分、比例和洗脱梯度，以实现化合物的分离和增强分离效果。
6. 检测器选择：选择适合的检测器，对色谱柱洗脱出的化合物进行检测。
常用的检测器有紫外-可见光谱检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
7. 数据采集和处理：通过检测器将得到的信号转换为电信号，并进行数据采集和处理，包括峰面积计算、质谱数据解析等。
液相色谱的特点包括：1. 高分离效率：液相色谱的分离效率较高，可以实现多组分混合物中的化合物快速准确分离。
2. 分析速度快：相比气相色谱，液相色谱的分析速度较快，样品制备和进样过程较简单，分析时间短。
3. 适应性广：液相色谱适用于多种化合物的分离和分析，包括有机物、无机物、生物大分子等。
4. 分析灵敏度高：液相色谱常与灵敏的检测器（如质谱检测器）联用，可以实现低浓度物质的快速准确分析。
5. 操作简便：相比其他分析技术，液相色谱的操作比较简便，不需要高度专业技术人员。
总之，液相色谱是一种广泛应用于分析化学领域的分离和分析方法，具有高分离效率、快速分析速度、广泛适应性、高分析灵敏度和简便操作等特点。
气相色谱分离过程
例如，苯加氢生成环己烷的反应，由于苯和环己 烷的沸点只相差0.6 ℃，一般的蒸馏方法很难分离， 所以采用萃取蒸馏的方法分离。而用填充柱气相 色谱法，半米长的丁二酸乙二醇聚酯固定相填充 柱上，二者可以实现很好的分离，因为他们在这 种固定相上的分配系数差异较大，即使用其他的 固定相，只要延长色谱柱的长度，也能够实现很 好的分离。
与适当的柱后检测方法 结合，实现混合物中各组 分的分离与检测。 两相及两相的相对运动 构成了色谱法的基础。
气相色谱分离过程
当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定 相溶解或吸附; 随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相 中挥发或脱附; 挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定 相溶解或吸附; 随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反 复地进行。
Chromatography：
海底的通道就如同色谱柱一样，只 对兴趣的人有保留作用，这样达到 选择性保留溶质的效果，而保留差 别的大小决定了分离的基础。
换作另外一个通道，比如是植物类的， 例如花，那么又对另外一类人有吸引力， 那么在海底通道上没有差别的人群也许 在这个花的通道上能够看出差别，总之， 只要他们之间有差别，总能够找到这个 差别把他们区分开。
色谱图是用来观察色谱行为和研 究色谱理论的重要标尺；可以根 据保留时间对未知化合物进行定 性，根据色谱图上测得的峰高或 峰面积进行定量，根据各峰不同 位置及峰宽变化状态，可以对色 谱柱的分离效率进行评价，并根 据色谱图的状态来判断操作条件 的优劣。
二、相关名词
色谱峰：色谱柱流出组分通过检测器系统时 所产生的响应信号的微分曲线。
•脱尾峰：后沿较前沿平缓的不对称峰。
•前伸峰：前沿较后沿平缓的不对称峰。
色谱分离化合物
色谱分离化合物
色谱分离是一种分离混合物中化合物的方法。
它基于化合物在固定相和流动相之间的分配系数差异，通过让混合物在固定相和流动相之间反复分配，实现化合物的分离。
具体操作步骤如下：
1. 选择合适的色谱柱和流动相：根据待分离化合物的性质和分离要求，选择合适的色谱柱和流动相。
2. 制备样品：将待分离的混合物制备成适当的溶液。
3. 进样：将样品注入色谱柱中。
4. 洗脱：使用流动相将化合物从色谱柱中洗脱出来。
5. 检测：使用检测器检测洗脱出来的化合物，并记录它们的保留时间和峰面积。
通过色谱分离，可以将混合物中的不同化合物分离开来，以便进一步分析和研究。
色谱分离的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解色谱分离的基本原理和方法。
2. 掌握色谱仪器的操作方法和注意事项。
3. 学会使用色谱分离技术对混合物进行分离和鉴定。
二、实验原理色谱分离是利用混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，使各组分在固定相和流动相之间反复进行分配、迁移，从而实现分离的方法。
根据固定相和流动相的不同，色谱分离技术主要分为气相色谱、液相色谱和薄层色谱等。
本实验采用高效液相色谱（HPLC）技术，利用固定相和流动相之间的相互作用，对混合物中的各组分进行分离。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：高效液相色谱仪、色谱柱、流动相泵、检测器、进样器、计算机等。
2. 试剂：混合物样品、固定相（如C18、ODS等）、流动相（如乙腈、水等）、洗脱剂、标准品等。
四、实验步骤1. 样品制备：准确称取一定量的混合物样品，溶解于适当的溶剂中，配制成一定浓度的溶液。
2. 色谱柱的准备：将色谱柱安装在色谱仪上，按照仪器说明书进行色谱柱的平衡。
3. 流动相的准备：配制适当的流动相，用0.45μm滤膜过滤，然后装入流动相泵。
4. 进样：将配制好的样品溶液用进样器注入色谱柱。
5. 洗脱：启动色谱仪，根据实验需要设置流动相的流速、检测器的波长等参数。
6. 检测：记录色谱图，分析各组分的保留时间、峰面积等信息。
7. 结果分析：根据保留时间、峰面积等数据，对混合物中的各组分进行鉴定。
五、实验结果与分析1. 色谱图分析根据实验得到的色谱图，可以观察到混合物中各组分的峰形、保留时间等特征。
通过比较标准品的保留时间和峰面积，可以鉴定混合物中的各组分组分。
2. 结果讨论实验结果表明，通过高效液相色谱技术，成功实现了混合物中各组分的分离和鉴定。
实验过程中，色谱柱的选择、流动相的配比、流速等参数对分离效果有较大影响。
因此，在实际操作中，需要根据实验需求和样品特性，优化实验条件，以提高分离效果。
六、实验总结1. 本实验通过高效液相色谱技术，成功实现了混合物中各组分的分离和鉴定。
环境仪器分析：第2章 色谱分析法
第二节 气相色谱理论基础
色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组 分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远。两峰 间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与 色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距 离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分 开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散 行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此， 要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。
对A、B两组分的选择因子，用下式表示：
α= tR(B)/tR(A)= k(A)/k(B)=K(A)/K(B)
通过选
择因子α把实验测量值k与热力学性质的分配系数K直接联系起来，
α对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的K或k值相等，则
α=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k
值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是
它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体 积有关。
k = ms/mm =CsVs/CmVm
式中cs,cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流 动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种 不同类型的色谱中有不同的含义。
例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的Байду номын сангаас积；在尺寸排阻色谱中， 则表示固定相的孔体积。
➢基线漂移（baseline drift）：基线随时间定向的缓慢变化。
➢基线噪声（baseline noise）：指各种因素所引起的基线起 伏。
3. 峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。
4. 保留值 (1) 死时间 tM 不被固定相吸附或溶解的物质（如空气、甲烷）
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K与k’值越大，保留时间越长；
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④分离度：相邻色谱峰峰顶之间的距离除 以此两色谱峰的平均宽度。
Rs1/2t(R2b 1 tR1b2)
2tR b1 b2
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⑤柱效率：
N 5.54( tR )2
1/ 2
HL N
N 16( tR )2
根据分离的物 吸附色谱法
理化学原理
分配色谱法
色谱法分离原理
分配系数 分配比
色谱图
色谱图相关述语 色谱图所提供的信息
塔板理论
色谱法基本理论
速率理论 分离度
色谱分离的基本方程
利用保留值定性
色谱定性分析 利用经验规律定性
色谱定性定量分析
利用联用技术定性 定量校正因子
色谱定量分析 峰面积测量
归一化法
定量分析方法 内标法
柱 色 谱 法 （ L C C ）空 心 柱
色 谱 法
毛 细 管 柱
平 板 色 谱 法 （ F B C ） 纸 薄 色 层 谱 色 法 谱 法 （ P （ C T ） L C 1） 0
③按分离的动力学过程分：
冲 洗 色 谱 法 色 谱 法 顶 替 色 谱 法
迎 头 色 谱 法
④按分配原理分：
色谱法
b
N有效N(1k'k')2 H有效H(1k'k')2
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2.色谱理论模型
色谱分离过程涉及到两个方面：其一是色谱分离与 物质在两相中的分配系数有关——这由物质（包 括组分、流动相、固定相）的分子结构和性质决 定——这也就决定了各组分在柱后的出峰时间， 即色谱过程中的热力学因素；其二是色谱分离与 物质在柱内的运动情况有关—这由物质在流动相 和固定相间的传质阻力决定—这也就决定了各组 分色谱峰的形状和区域宽度，即色谱过程的动力 学因素。
第6章 色谱分离过程
Chromatography
6.1 概述 6.2 色谱分离过程的基本原理 6.3 色谱的分类 6.4 色谱分离过程基础理论 6.5 典型制备色谱工艺及应用
1
色谱分析法 的基本知识
色谱定义及分类
色谱法定义 色谱法分类
根据两相的 物理状态
气相色谱法 液相色谱法
气固相色谱法 气液相色谱法 液固相色谱法 液液相色谱法
✓ 分离机制：见图示
吸附平衡 Xm + nYa→Xa + nYm
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✓ 分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离
吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开 14
（二）分配色谱法
✓ 要求：
固定相→机械吸附在惰性载体上的液体
流动相→必须与固定相不为互溶
色带
4
1903年俄国植物学家Tswett实验示意图
色谱法的特点
✓ 优点：“三高”、“一快”、 “高一选广择性”——可将性质相似的组分分开
高效能——反复多次利用组分性质的差异
产生很好分离效果
高灵敏度——10-11~10-13g，适于痕量分析 分析速度快——几~几十分钟完成分离
一次 可以测多种样品
应用范围广——气体，液体、固体物质
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塔板理论基本假设
色谱柱由一系列塔板组成 塔板内，组分在两相间迅速达到平衡 （理想色谱） 组分的分配系数不随它的浓度变化而 变化（线性分布等温线） 组分的轴向扩散为零 流动相的流动是跳跃过程
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塔板理论方程：
N 5.54( tR )2
1/ 2
H=L/N
若扣除死时间（体积）的影响，得到有效塔板数（n’）和有效塔 板高度(H’)：
溶解和解析的能力（或吸附和脱附的能力）
的大小，以一定的比例分配在固定相和流动
相之间。溶解（吸附）能力大的组分分配给
固定相多一些，分配给流动相少一些。这可
用分配系数K表示。
6
分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异 微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；
吸附能力强的组分后流出 7
2.固定相（色谱柱填料）
气 相 色 谱 法 （ G C ） 气 气 固 液 色 色 谱 谱 法 法 （ （ G G S L C C ） ） 色 谱 法液 相 色 谱 法 （ L C ） 液 液 固 液 色 色 谱 谱 法 法 （ （ L L S L C C ） ）
超 临 界 流 体 色 谱 法
②根据固定相的形状分：
填 充 柱
1.根据色谱峰的数目，可以判断试样中所含 有组分的最少个数。
2.根据色谱峰的保留值可以进行定性分析。 3.根据色谱峰高或面积可以进行定量测定。 4.根据色谱峰间距及其宽度，可对色谱柱的
分离效能进行评价。 5.色谱峰间距——固定相或流动相选择是否
合适的依据。
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6.4 色谱分离过程基础理论
1.保留值、分离度和柱效率
外标法
2
6.1 概述
1. 定义——也称色谱层析、色谱、色层； 样品中各组成依据其在固定相与流动相 之间作用行为的差别进行多次分离的过 程。
2. 发展史——1903年一位俄国植物学家 首次提出。1931年首次应用于制备； 1938年适用范围扩展至无色物质；……
3
➢ 固定相——CaCO3颗粒 ➢ 流动相——石油醚
分子排阻色谱或凝胶过滤色谱 离子交换色谱 疏水作用色谱 亲和色谱 正相/反相谱
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基本类型色谱法的分离机制
基本概念：固定相（s）；流动相（m）
（一）吸附色谱法 （二）分配色谱法 （三）离子交换色谱法 （四）空间排阻色谱法
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（一）吸附色谱法
✓ 要求： 固定相→吸附剂（硅胶或Al2O3） 具表面活性吸附中心
H A BCu u
式中A、B、C为常数，A为涡流扩散项，B为分子扩散项系数，
✓ 分离机制见图示
✓ 阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ → RSO3-X+ + H+
固定离子 可交换离子 待测离子
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图示
✓ 分离机制： 依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力） 不同而实现分离 back
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（四）空间排阻色谱法
✓ 要求： 固定相→多孔性凝胶 流动相→水——凝胶过滤色谱 流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱
k'
tR tR0 tR0
tR tR0
1
③K与k’之比较：
;β
cm mm/Vm VS
式中，β为相比，为柱中流动相体积与固定相体积之比。它反 映了柱型的特点：填充柱β=6—35；毛细管柱β=50-1500。
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a. K和k’与物质及两相的性质有关； b. K 与k’都是温度、压力的函数； c. K与两相的体积无关；k’与两相的体积有关，
③调整保留时间（t’R）--扣除死时间后的保留时间 （t’R=tR-tM）。
用使组分流出色谱柱所需流动相体积表示时为：
a．死体积（Vm） b．保留体积（VR） c．调整保留体积（V’R）
VM=tMF0 VR=tRF0 V’R=t’RF0=VR-VM
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(3)峰高与峰面积 峰高是色谱峰的顶点到基线之间的垂直距 离，用h表示；峰面积是色谱流出曲线与基线所围成的面积， 用A表示。
N'5.54t1R '/2
2
16tR ' 2
H’=L/N’
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它们比理论塔板数及高度，能更有效地反映色谱分 离好坏与塔板数和塔板高度之间的对应关系。
一般说来，色谱柱的理论塔板数越大，表示组分在 色谱柱中达到分配平衡的次数越多，越有利于分离， 但不能说明组分间分离的好坏，因为分离好坏决定 于各组分在流动相和固定相之间分配系数的差别， 而不是分配次数的多少。
①硅胶衍生的固定相
②离子交换树脂
③大孔吸附树脂
④凝胶 ⑤手性固定相
纤维素衍生物 环糊精相 聚（甲基）丙烯酰胺 π -酸和π -碱固定相
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3.色谱柱及柱技术
高压匀浆填充
色谱柱装填方法 干法填充
径向压缩法 轴向压缩法 环形压缩技术
色谱柱设计
“饼式”柱 面进样
轴向流动 9
6.3 色谱的分类
① 根据色谱法中两相的物理状态分：
(4)区域宽度 是反映分离好坏的一个重要参数。一般，区域 宽度越窄越好。可用三种方法表示：
①标准偏差（σ）：0.607倍峰高处峰宽的一半。 ②峰底宽度（ω）：色谱峰两侧切线在基线上的截距 ω =4σ ③半峰宽度（ ω 1/2）：又称半宽度或区域宽度，峰高一半处
的宽度。
1/2 2.354
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从色谱流出曲线可以获得许多重要信息：
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• 色谱理论包括两方面: –热力学理论：研究分配(分离)过程， 塔板理论（plate theory）。 –动力学理论：研究各种动力学因 素对峰展宽的影响，速率理论 （rate theory）。
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塔板理论 (the plate model)
1941年，Martin和Synge阐明了 色谱、蒸馏和萃取之间的相似性， 将色谱柱设想成由许多液液萃取单 元或理论塔板组成；与精馏相似， 色谱分离也是一个分配平衡过程。 这就是Martin等人提出的塔板理论。
✓ 缺点：
化学、生化色谱分离、分析
对未知物分析的定性专属性差
需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)
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6.2 色谱分离过程的基本原理
1.分离原理
色谱法之所以可以分离混合物，关键是它有一
个高效的色谱柱。物质在柱内的分离过程，
是物质在固定相和流动相之间发生吸附、脱
附（或溶解、解析）的过程。被分离物按其
载体→惰性，性质稳定，
不与固定相和流动相发生化学反应