细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
细胞迁移侵袭实验操作步骤
实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。
24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)实验介绍：细胞迁移和侵袭实验是通过将Transwell小室放入培养板中，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，研究细胞在不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜下的共培养、细胞趋化、细胞迁移和侵袭等多种方面的实验。
实验步骤：1.材料准备：可拍照显微镜、Transwell小室（孔径8μm，没包被胶的），24孔板、BD公司的Matrigel、无血清DMEM、(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基、DMEM完全培养基、1640完全培养基（也可加到20%血清）、无菌PBS、棉签、胰酶、4%多聚甲醛固定液或者甲醇、结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）。
2.实验步骤：2.1 基质胶铺板：用XXX的Matrigel稀释1：8，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2 制备细胞悬液：细胞撤血清饥饿12-24小时后，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3 接种细胞：取细胞悬液100µl加入Transwell小室，24孔板下室加入600µl含20%FBS的培养基。
注意避免气泡的产生。
2.4 培养细胞：常规培养12-48小时。
24小时较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
2.5 结果统计：通过给细胞染色，在镜下计数细胞。
胞悬液；将细胞悬液加入上室中央，保持液面水平；将下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基；37℃培养箱中孵育20-24小时；取出transwell，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色；用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。
注意事项包括确保transwell在24孔板中浸泡1小时，消化细胞时用无血清培养基洗涤2次并计数，将细胞悬液加入上室中央保持液面水平，下腔室中加入含有20% FBS的条件培养基，37℃培养箱中孵育20-24小时，用PBS洗涤2次，用4℃的5%戊二醛固定，加入结晶紫或Giemsa染色，用棉球擦去上表面细胞，并小心避免混淆实验组和对照组。
细胞侵袭实验步骤
Cell invasion protocols实验材料：1、24 transwell2、Matrigel 基质胶Becton-dickinson（BD）公司Matrigel 在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。
使用前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化过夜（避免反复冻融）。
注：使用时需接触Matrigel 的试管、移液吸头等均应预冷于-20℃；3、Diff-Quick染色溶液4、镊子5、棉签实验步骤1、matrigel在4℃自然融化（用多少，转移多少）过夜。
2、将实验使用的微量注射枪及枪头(蓝、黄枪头）在-20℃预冰。
3、500ul matigel + 500ul DMEM（不含牛血清且在4℃预储藏贮藏的）4、有枪头轻混匀。
5、分别在24-trans well 正中的8孔的上腔室中，加入该混合液70ul/孔。
6、在超净台（UV+ fan) 干燥3--4h7、待matrigel干燥后，抽去上层DMED，用500ulPBS轻清洗凝胶。
8、消化细胞，洗细胞（3次）重选细胞100ul（5×104）MCF-7细胞于上室中。
9、抚育待细胞贴壁生长后（由细胞生长情况而确定抚育时间）10、给药。
上室给药（无血清培养液），下室不给药（血清中含有5%-10%FBS），上室、下室培养液体积为500ul。
11、抚育24h。
12、染色：将小室从24孔板中取出，用Diff-Quick solution染色液染色。
13、用擦去transell 上层细胞，从底部将膜切下，粘在载玻片上并盖上盖玻片，于显微镜下取若干视野进行观察。
（此方法可长期保存，但transwell只能使用一次，还有其他染色方法可以借鉴，见其他参考文献，请参考）。
学会这5步，轻松搞定transwell实验
学会这5步，轻松搞定transwell实验生物学霸丁香通出品轻松采购无忧科研做肿瘤研究的人，很少有不知道 transwell 实验的，它是用来研究肿瘤细胞的迁移侵袭转移情况的一种简便快捷的实验方法，还可以构建两种细胞的共培养体系以及趋化性试验。
今天咱们就来讲讲怎么做肿瘤细胞的侵袭转移实验。
Transwell 侵袭实验，其实原理简单地说就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。
我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞就要分泌金属蛋白酶将基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。
而迁移实验就是不铺胶直接让细胞穿过就行了。
Transwell 简易图以下学霸君来介绍侵袭实验步骤：实验前准备：transwell 小室（一般选用12um），24 孔板，基质胶（corning），细胞实验所需的基本的材料。
基质胶铺板用BD 公司的Matrigel 1：8 稀释（可以直接用无血清的培养基稀释），包被 Transwell 小室底部膜的上室面，置37℃孵箱 1-4h 使Matrigel 聚合成凝胶（时间不宜太长，之前有人说在37 度孵箱过夜，反正元元师兄觉得不太可能）。
注意事项：1. 铺胶之前将枪头以及所用的耗材至于冰箱4 度当中，否则配胶的时候会直接凝固。
2. 铺胶的厚度自己摸索，25ul，40ul，100ul。
3. 注意铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果。
4. 注意无菌操作。
2制作细胞悬液1. 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
2. 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用 PBS 洗 1－2 遍，这一步很必要，否则细胞表面覆有血清培养基，细胞没有迁移侵袭的动力），用无血清培养基重悬。
细胞迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭实验实验准备：细胞，24孔板，transwell小室（8µm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 µ、200 µL、1000 µL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒实验设计：实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。
如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。
实验操作（请细读注意事项）：一、细胞侵袭实验1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。
2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。
3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。
4.把枪头剪去一小段（约3 µm）后在冰上吸取40 µL/孔ECM Gel使用液轻轻加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。
5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。
6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。
7.按照每孔200 µL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500 µL，放入37 ℃孵箱培养。
8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。
9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。
10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。
11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。
transwell实验步骤及方法
Transwell实验具体步骤及方法
1.取对数生长期的细胞，常规消化（可以无血清饥饿12~24h，去除血清对cell
侵袭能力的影响）
2.用含1%FBS的培养基重悬细胞，调整细胞密度为（2~5）*10 5/ml，细胞要
多一点
3.取100ul细胞悬液接种于transwell小室的上室，下室加入600ul含10%FBS
的培养基（避免小室下面产生气泡）
4.培养细胞24h/48h，后取出小室置烧杯内涮洗；24孔板中加入800ul甲醇/孔。
5.吸干上室液体，4%多聚甲醛室温固定10~30min，
另一24孔板中加入800ul染色液/孔
涮洗后，吸干上室固定液，移入0.1%结晶紫染色液，室温染色20min （结晶紫：常规工作液浓度0.1%）
6.小室用流动水轻轻冲洗浸泡3次进行脱色染色
7.吸干上室液体，用棉签（棉花扯松一点再擦）轻轻擦掉上室底部膜表面未迁
移细胞
8.显微镜下随机观察5个视野细胞，并进行照相
9.数据处理。
transwell 实验步骤
肿瘤细胞侵袭试验细胞侵袭实验用来研究肿瘤细胞和胞外基质(ECM)之间的相互作用。
ECM不仅为细胞提供了结构支架，同时也包含了许多细胞生存及生长过程中生物功能因子。
细胞可以分泌一种酶，该酶能够降解EMC中特定的组分，从而使细胞向化学引诱剂移动，或者直接形成一种生长的状态。
EMC胶模仿体内细胞外基质ECM环境，包含了支撑细胞结构的最基本的组分。
转移性肿瘤细胞由于其高迁移和/或降解ECM的酶活从而表现出较强的侵袭性。
材料和仪器1.EMC Gel基质胶(Sigma-Aldrich # E1270)2.12mm直径，8μm孔隙的细胞小室(Millipore #PI8P01250)3.人Human MDA-MB-231 cell (ATCC #HTB-26)4.DMEM培养基(Invitrogen #10313-021)5.胎牛血清(ATCC #30-2020)6.胰酶/EDTA消化液(Invitrogen # 25200-056)7.PBS (Invitrogen #14190-144)8.戊二醛(Sigma-Aldrich #G6257)9.乙醇(Sigma-Aldrich #459836)10.10.结晶紫(Sigma-Aldrich C3886)11.11. 棉签12.12. 细胞培养仪：37 °C and 5% CO2步骤1.细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中生长。
2. 4 °C溶EMC胶过夜。
3.将细胞小室Millicell insert 和培养板于4°C 预冷。
4.用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释EMC胶至终浓度2 mg/ml5.注意：EMC胶终浓度根据细胞类型可调整。
6.取100 μl步骤4的EMC稀释胶加入到细胞小室的上层小室中7.立即将细胞小室和EMC胶置于培养板中，于37 °C孵育2小时。
EMC胶可由液体凝成固体。
8.细胞用1x PBS清洗，胰酶消化。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(汇编)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
Transwell侵袭实验
Transwell 侵袭实验一、实验原理将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
二、实验步骤1.将基质胶、Ep管、培养基、已放Transwell小室的24孔板提前放4℃预冷。
2.在冰上，基质胶：培养基= 1:8，预冷Ep管分别加106µl培养基+13.3µl基质胶（100µl/孔，配120µl）。
3.小室上孔迅速加100µl稀释的胶（垂直加入，铺平），37℃孵育1h，待胶凝固。
4.取适量细胞，离心后用无血清培养基重悬，上室加100µl。
（细胞接种数应该通过预实验确定）5.下室加入600µl含10% FBS的培养基。
6.37℃孵育24 h。
7.弃去上室内培养基，用棉签拭去上室残留的细胞，特别是边缘，棉签弄尖沿壁转一圈。
8.下室加600µl 4%多聚甲醛固定20min，PBS洗1-2遍，干燥。
9.下室加入400µl 0.1%结晶紫，染色10min10.PBS洗去残留染液。
11.将小室置于倒置显微镜下，观察拍照，取上、下、左、右、中五个视野计数，求平均值。
注：1.提前30min开制冰机。
2.拿小室时拿边缘，加基质胶时垂直加。
禁止在实际上方操作，准备好东西再配胶。
3.0.1%结晶紫：2.5%结晶紫配制成0.1%结晶紫溶液，400µl至10mL。
上室：采用无血清培养基，为维持细胞活性，可加入低浓度培养基，如2%或者5%。
下室：5%-10%FBS培养基，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。
1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。
1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。
ﻫ２、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。
但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。
ﻫ２。
3接种细胞①取细胞悬液１00µl加入Trａnｓwelｌ小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
Transwell 小室 细胞侵袭实验
Transwell 小室细胞侵袭实验1）提前接种细胞并对细胞做不同处理（如转染或加药）。
此处选取1640培养基，具体情况视细胞种类不同而定。
2）接种前，将matrigel从-20℃取出，于4℃冰箱过夜融化。
之后每transwell 小室加入10μL matrigel胶与60μL 1640培养基混合物，在细胞培养箱中放置30 min-2h 使胶凝固。
3）胰酶消化对数期细胞，2 mL含血清培养基终止消化。
将细胞悬液转移到离心管中。
4）1000 rpm离心3 min使细胞沉积于管底，离心期间配制含1%血清的1640培养基。
5）弃去上清培养基，将细胞重悬于含1%血清的1640培养基，1000 rpm离心3 min。
6）之后再用含1%血清的1640培养基轻轻吹打混匀细胞，用血细胞计数板对细胞计数。
7）根据细胞计数结果计算细胞密度，将细胞稀释到1×105个/mL。
8）在24孔板中加入600 μL 含10%血清的1640培养基，放入Transwell小室，在Transwell小室中加入100 μL细胞悬液。
9）细胞培养箱培养48-72小时。
10）准备新的24孔板，加入600 μL/孔的PBS；从培养箱中取出24孔板，用棉签擦去上层细胞，将Transwell小室浸入PBS中，重复洗3次，注意动作轻柔，不要把下层细胞洗掉。
11）在新的24孔板中加入600 μl/孔的甲醇，将Transwell小室浸入甲醇中10 min，固定细胞。
12）将Transwell小室重新用PBS洗3次。
13）在新的24孔板中加入600μl/孔的DAPI，将Transwell小室浸入DAPI中5min，染色细胞核。
14）将Transwell小室重新用PBS洗3次。
15）在荧光倒置显微镜下拍摄穿过Transwell小室的细胞，每个小室随机选取8-10个视野拍摄并对细胞计数，计算平均数，比较不同处理对细胞迁移能力的影响。
细胞侵袭必备技能——Transwell
细胞侵袭必备技能——Transwell导读上周我们介绍了研究细胞迁移的体外⽅法——划痕实验，与此同时细胞侵袭也是与转移密不可分的。
那么今天要讲的是最常⽤的细胞侵袭⽅法：Transwell⼩室侵袭实验。
与细胞划痕实验相⽐，Transwell相对过程复杂，因此常常会出现各种问题，下⾯就⼀起看看Transwell侵袭实验中需要注意的细节吧！⾸先，为了对肿瘤侵袭和转移有更加清晰的理解，我们先来了解⼀下，肿瘤细胞转移的过程（如图1），主要包括以下5个过程：原位侵袭（Local invasion），肿瘤细胞内渗（Intravasation），循环系统存活（Survival in the circulation），肿瘤细胞外渗（Extravasation），形成转移灶（Micrometastasis formation）等[1]。
肿瘤细胞转移过程[1]其中细胞侵袭便发⽣在第⼀步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进⼊⾎管、淋巴管的过程，后期才开始进⾏转移。
本期我们就为⼤家讲述利⽤transwell⼩室模拟细胞侵袭的实验⽅法。
Transwell 实验原理Trans可译为转移，穿过，⽽well则为⼩室的意思。
外形如同⼀个⼩杯⼦，杯底有通透性的膜（孔径0.1－12.0µm，细胞侵袭⼀般⽤8.0、12.0µm）。
实验原理：将Transwell⼩室放⼊培养板中，⼩室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以膜相隔，并在膜上室铺基质胶，⽤来模拟体内细胞外基质。
如果上室的细胞要转移到下室，需先分泌基质⾦属蛋⽩酶（MMPs ）将基质胶降解，才能通过膜，最后通过计数下室的细胞量即可反映细胞的侵袭能⼒。
如下图右所⽰：Transwell装置图（左为外形，右为内部构造）侵袭过程：如下图为利⽤⾎清为诱导因⼦，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。
简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有⾎清培养基。
这样细胞放⽆⾎清的培养基⾥，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才⾏。
transwell实验原理与步骤
transwell实验原理与步骤Transwell实验是一种常见的细胞迁移和侵袭性研究的方法。
它广泛用于评估细胞的迁移能力、侵袭能力以及药物对这些能力的影响。
Transwell实验基于孔板中半透膜的整体设计，使得细胞可以在孔板上的上下两侧进行迁移和侵袭。
下面将详细介绍Transwell实验的原理和步骤。
1. Transwell实验的原理Transwell实验中使用的是Transwell孔板，该孔板由上下两个室组成，通过半透膜分隔开。
半透膜通常由聚碳酸酯或聚膠（polyethylene terephthalate）制成，具有特定的孔径。
孔板上室称为上室，下室称为下室。
上室用于装载待测的细胞，下室则添加诱导迁移或侵袭的化学物质。
Transwell实验的原理是利用孔板的半透膜，使得细胞可以通过孔板上下两侧进行迁移和侵袭。
细胞在上室中培养，通过半透膜向下室中迁移和侵袭。
迁移和侵袭的细胞数量可以通过染色或其他方法来定量。
同时，可以添加不同的化学物质于上室或下室，以评估这些化学物质对细胞迁移和侵袭能力的影响。
2. Transwell实验的步骤Transwell实验的步骤主要包括预处理Transwell孔板、细胞培养、细胞处理、迁移或侵袭实验、染色和结果分析。
(1) 预处理Transwell孔板将Transwell孔板放入含有适当的细胞培养基的无菌培养皿中，在37℃的恒温培养箱中预温30分钟。
然后，将细胞培养基完全移除并在烘箱中干燥。
(2)细胞培养将需要进行迁移和侵袭实验的细胞培养至合适的数量和状态。
注意要保持细胞处于对下一步实验的最佳状态，例如在对照组、实验组之间生长均匀。
(3)细胞处理将预处理后的Transwell孔板放入一个无菌培养皿中。
然后，向上室中加入适当数量的细胞悬液。
根据实验要求，可以在上室中添加不同浓度的细胞。
(4)迁移或侵袭实验在下室中加入化学物质，例如诱导剂或特定药物。
这些化学物质可以模拟体内环境，刺激细胞的迁移或侵袭能力。
Transwell用于迁移实验和侵袭实验的方法
Transwell用于迁移实验和侵袭实验的方法Transwell用于细胞迁移实验和侵袭实验的不同:对于肿瘤细胞而言，迁移看的是肿瘤细胞迁移的快慢和程度。
而肿瘤细胞侵袭是肿瘤细胞进行迁移它就必须分泌金属蛋白MMP9，而基质胶的作用相当于模拟人体类的基质。
方法：1 Transwell实验检测新鱼腥草素钠对食管癌细胞迁移的影响（1）取对数生长期的Kyse-450、Eca-109和TE1细胞，消化、离心、重悬并进行细胞计数，调整细胞浓度为1×105/mL；（2）100μL细胞悬液接种于transwell上室。
（注意上室的细胞悬液中不含血清）；（3）添加600μL FBS含量为20%的完全培养基于下室；（4）设置对照组及实验组，实验组药物加于transwell上室中，Kyse-450细胞系药物终浓度为0、100、200、300μg/mL，培养24h；Eca-109、TE1两种细胞系药物终浓度为0、50、100、200μg/mL；（5）24h后，将上室和下室的液体吸出，PBS清洗上室两遍。
使用松软的棉花去除小室内细胞，即未穿透过小室的细胞；（6）4%甲醛固定上室穿透过的细胞，固定15min；（7）固定过后，风干上室10min，用0.5%结晶紫染色20min；（8）PBS清洗3遍，从边缘吸干水分，拍照记录，每个小室随机拍摄5个位置，每个实验重复3次。
2Transwell检测细胞侵袭2.1 Matrigel胶分装处理（1）将Matrigel基质胶放于冰盒，再同冰盒一起放在4℃冰箱的里面，过夜融化，随时观看瓶中的基质胶状态，确认基质胶完全融化；（2）根据实验需求计算出一次的价值叫用量进行分装，在分装时与Matrigel胶接触的全部用品均需预冷，所有操作过程在冰上低温无菌操作，分装放置在－80℃冰箱，保留货号，不能重复冻融使用；（3）当胶浓度＜3mg/mL时，不会成胶；（4）融化后的Matrigel胶为澄清液体。
热点实验：细胞增殖毒性与Transwell(细胞迁移、侵袭)实验案例介绍
Transwell细胞迁移与侵袭实验服务：细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
细胞增殖与毒性检测MTT检测实验服务：原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
MTT方法用于判断药物、外源性基因、小RNA、蛋白、抗体、细胞因子、血清等对于细胞的作用，以明确上述因子对于细胞生物学行为的影响（如细胞活力、增殖、凋亡等方面）。
细胞增殖与毒性检测SRB检测实验服务：磺酰罗丹明是一种能与生物大分子的碱性氨基酸结合的水溶性蛋白染料，其结合于细胞中的量的多少可以反映总蛋白量进而反映细胞数的多少。
在515nm波长处的OD值与活细胞数呈良好的线性关系。
SRB法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。
细胞增殖与毒性检测CCK-8检测实验服务：Cell Counting Kit简称CCK8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。
颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)迁移实验（cellmigrationassay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：摄影显微镜，Transwell细胞，孔径8μm。
Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板未涂有胶水（Coster和Corning也常用）。
细胞培养板应与购买的Transwell培养箱相匹配。
基质凝胶，无血清DMEM，（1%胎牛血清）DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可添加20%血清），无菌PBS，棉签，胰蛋白酶，4%聚甲醛固定溶液或甲醇，结晶紫染料（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和过程2.1基质铺胶板：用bd公司的matrigel1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被transwell 小室底部膜的上室面，置37℃30min使matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液① 在制备细胞悬浮液之前，可将细胞从血清饥饿状态下移除12-24小时，以进一步消除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用pbs洗1－2遍），用含bsa的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞① 取细胞悬液100μL加入Transwell培养箱。
②24孔板下室一般加入600μl含20?s的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
transwell实验步骤及方法
TranSWen实验具体步骤及方法1.取对数生长期的细胞，常规消化（可以无血清饥饿12~24h ,去除血清对Cell侵袭能力的影响）2.用含1%FBS的培养基重悬细胞，调整细胞密度为（2~5 ）*10 5∕ml ,细胞要多一点3.取IOOUl细胞悬液接种于transwell小室的上室,下室加入600Ul含10%FBS 的培养基（避免小室下面产生气泡）4.培养细胞24h∕48h后取出小室置烧杯内涮洗24孑中加入800Ul甲醇/孔。
5.吸干上室液体,4%多聚甲醛室温固定10~30min ,另一24孔板中加入800ul染色液/孔涮洗后，吸干上室固定液，移入0.1 %结晶紫染色液,室温染色20min （结晶紫：常规工作液浓度0.1%）6.小室用流动水轻轻冲洗浸泡3次进行脱色染色7.吸干上室液体,用棉签（棉花扯松一点再擦）轻轻擦掉上室底部膜表面未迁移细胞8.显微镜下随机观察5个视野细胞,并进行照相9.数据处理撤血清：换无血清培养基培养细胞，清除血清的影响铺基质胶：将基质胶适当稀释，铺在上层小室中，胃细胞培养箱中聚合过夜 J 加入上室后■等待30min铺下室培养基：含20% FBS的培养基，I制备细胞悬液：胰酶消化细胞,制备细胞悬液I铺细胞：将上层小室放入下层小室，细胞计数后将细胞铺在上层小室中，I继续培养：细胞培养箱中培养，具体时间视不同细胞而定I擦去上层细胞：用棉签擦去上层小室里的细胞和基质胶I固定细胞：甲醇固定细胞5nnirτI染色与拍照：吉姆萨染色液染细胞后拍照’使用软件分析迁移的细胞数（可以使用image PrO PlUS或mage j几将?次独立重复的数据都分析完后逬行统计分析并绘制柱状图NegCtrt TAp63TAp63 inhibits CeIlmigratiOrTLin CW.et al. Br.J.Cancer.2014.APiCalChamberBaSOlateralChamber使用软件分析侵袭卿胞数（可以使用Inldge PrO PlUS^Image j）将3次独立重复的数据都分析詰进微时析并鞠默图AES influences CanCer CeIlinvasion. The invasive abilityOf(A) MDA-MB- 231 and (B) HepG2CelIS 48 h after IranSfeCted WithSiAES Or SiRND3, WaSSiCOntrOlIassayed USing a MatrigeI-COatedTranSWelL The CeIIS thatSUCCeSSfUIIy invaded into theMatngel Were quantified 48 h afterplating. Data are represented asthe means ± SD for threeindependent experiments, t p<0.05, aSignifieant difference from theCOntrOl oligotransfected cells.。
transwell统计方法
transwell统计方法Transwell统计方法是一种常用的实验技术，用于研究细胞迁移和侵袭的过程。
本文将介绍Transwell统计方法的原理、操作步骤以及其在细胞研究中的应用。
一、原理Transwell统计方法基于Transwell腔室，通过人工模拟细胞迁移和侵袭的环境，来研究细胞在不同条件下的迁移和侵袭能力。
Transwell腔室由两个隔离的腔室组成，中间隔以小孔，可以允许细胞通过。
上腔室涂有一层基底膜，用于模拟细胞迁移和侵袭的环境。
通过上腔室内细胞的迁移和侵袭情况，可以评估细胞的迁移和侵袭能力。
二、操作步骤1. 准备Transwell腔室：将Transwell腔室放入无菌培养皿中，加入适量的培养基，使其浸没在培养基中。
保持腔室表面湿润。
2. 细胞处理：将需要研究的细胞分离培养，并将其洗涤至适宜的细胞密度。
3. 细胞接种：将细胞悬液加入上腔室，将上腔室放置在含有培养基的培养皿中。
保持上腔室表面湿润，并确保细胞不会溢出。
4. 添加诱导剂：根据研究需要，可以向上腔室中添加适当的诱导剂，以模拟特定的迁移和侵袭环境。
5. 培养：将培养皿放入恒温培养箱中，以适宜的温度和湿度进行培养。
根据研究需要，可以选择不同的培养时间。
6. 细胞染色：培养结束后，将上腔室中的细胞染色，以便观察和计数。
常用的染色方法有克里斯蓝染色、伊红染色等。
7. 观察和计数：使用显微镜观察上腔室中的细胞，并通过计数细胞数量来评估细胞的迁移和侵袭能力。
三、应用Transwell统计方法在细胞研究中具有广泛的应用。
主要有以下几个方面：1. 细胞迁移和侵袭的研究：通过Transwell统计方法可以评估不同细胞在不同环境条件下的迁移和侵袭能力，从而深入了解细胞的功能和机制。
2. 肿瘤转移的研究：肿瘤转移是恶性肿瘤的重要特征，Transwell 统计方法可以模拟肿瘤细胞在体内转移的过程，为研究肿瘤转移提供重要的工具。
3. 药物筛选和评估：Transwell统计方法可以用于评估抑制细胞迁移和侵袭的药物效果，为药物筛选和评估提供依据。
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迁移实验（cell migration assay）
实验介绍
细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：
1材料准备：
可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）
2步骤和流程
2.1基质胶铺板：
用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞
①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。
24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
2.4结果统计
直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。
0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。
400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。
实验材料
（1）Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning) （2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10％血清培养基，PBS，0.02％EDTA （3）固定液：甲醇
（4）染色液：Giemsa染液
（5）封片剂：中性树胶
（6）其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片
操作步骤
（1）所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育；
（2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105 /ml；
（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培养基，上室加入100－150μl细胞悬液，继续在孵箱培养24小时；
（4）用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800μl甲醇的孔中，室温固定30分钟；
（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800μl Giemsa染液的孔中，室温染色15－30分钟；
（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；
（7）用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；（8）显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。
注意事项
（1）根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。
常用的为8.0-μm孔径（如AGS细胞），如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径；
（2）根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。
常规24-well chamber接种细胞数约为2≈5×104/well，迁移时间12≈36小时；
（3）由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber，为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板（Corning）；（4）如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），具体可查阅相关文献；
（5）细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平；
（6）固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。
但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞，以免影响读数。
尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗，但要小心避免将膜戳破；
（7）Chamber和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组；（8）充分晾干，避免残留水分导致镜下聚焦不一致。
细胞侵袭实验（cell invasion assay）
实验材料
（1）Matrigel (BD 5mg/ml)，-20℃保存
（2）其余材料同迁移实验
操作步骤
（1）Matrigel在4℃过夜融化；
（2）用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml，冰上操作；（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel，37℃温育4－5小时使其干成胶状；
（4）后续步骤同迁移实验（1-8）。
注意事项
（1）Matrigel在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头和离心管应提前在4℃预冷；
（2）铺胶时保证液面水平，胶的厚度均匀一致，切勿产生气泡；
（3）其他注意事项同迁移试验。
其他
Transwell做肿瘤侵袭实验的具体步骤
(1) 基质胶准备：将冻存于－80度冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h），变成液态；（2）取300ul无血清培养基，加入60ul（或50ug/每室）Matrigel ，混匀，（4℃操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3个室）；放入37℃培养箱中，孵育4-5h（>5h）；此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态。
注释：无血清培养基和基质胶按1：5稀释，每孔加50ul，在37℃培养箱中1-2h。
（3）消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液；
（4）用无血清培养基洗Matrigel洗1次；每孔加入100ul细胞悬液；
（5）下腔室中加入500ul含有20％FBS条件培养基；
（6）37℃培养箱中，孵育20-24h；
（7）取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4℃；
（8）加入结晶紫（0.1%）染色或Giemsa染色（5－10min），室温0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。
迁移实验
transwell在24孔板中浸泡1小时；消化细胞，无血清培养基洗2 次，计数，配成细胞悬液，每孔加入100ul细胞悬液；加药刺激；下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子；37℃培养箱中，孵育20-24h；取出transwell用PBS洗2遍，5% 戊二醛固定，4℃；PBS洗2遍，加入结晶紫（0.1%）染色，室温0.5h，PBS 洗2 遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察计数10 照相，记录。
侵袭实验
取300ul 无血清培养基，加入30ul （或50ug/ 每室）Matrigel ，混匀，（ 4 ℃操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul （3 个室）；放入37 ℃培养箱中，孵育4-5h （>5h ）；消化细胞，无血清培养基洗 3 次，计数，配成细胞悬液；用无血清培养基洗Matrigel 洗 1 次；每孔加入100ul 细胞悬液；下腔室中加入600ul 无血清条件培养基；37 ℃培养箱中，孵育20-24h；取出transwell 用PBS 洗 2 遍，5% 戊二醛固定，4 ℃；PBS 洗 2 遍，加入结晶紫（0.1% ）染色，室温0.5h ，PBS 洗2 遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察
transwell小室是否可以重复利用，该怎样消毒
用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2，效果很好。