第十章_有机高分子基质的HPLC填料
生物工程下游技术第十第十三章+液相色谱用填充材
一、基本概念
• 羟基磷灰石是一种弱阳离子或弱 阴离子交换层析材料。
• 优点:能精确地分离、纯化结构 上只有微小差别的生物大分子。
问题
• HAP是什么原理的色谱?为什么HAP具 有比较高的分辩力?
• HAP色谱填料的主要特点?
第十三章 径向色谱柱的发展与应用
传统色谱存在的问题
• 放大过程的困难； • 保证生物物质活性的困难：生物样品
的分离纯化过程对环境的要求较严， 生物组成成分复杂，分子量较大，比 较敏感，增加其使用的难度； • 生产效率的问题。
• HAP的色谱机理可能包括以下几个方面:
1. 存在两种不同的吸附晶面; 2. 两种不同晶面吸附方式不同; 3. 两种不同吸附点的起因:Ca2+离子和PO43-; 4. 色谱历程为离子间的竞争过程。
HAP在生化产物分离中的应用
• 一般应用领域:糖类,多肽,蛋白质,酶, 核糖核酸。
• 单克隆抗体的分离纯化。 • 结构差异很小的蛋白质分离。
二、HAP的性能
1. 高机械强度:可以耐受15MPa以上压力,陶瓷HAP可
以耐受几十MPa的压力。
2. 高柱效:球形HAP颗粒大小、形状及孔隙大小均适合
HPLC的要求，其颗粒及孔径小，有比较高的柱效。
3. 化学和热稳定性:是磷酸钙盐中最稳定的,在中
性和碱性水相中非常稳定,溶解度很低,热稳定性很高, 可采用高温制备方法生产。
1. 采用径向流技术,可以在较小的柱床层 高度时使用较大的流动相速度。
HPLC中固定相和流动相
HPLC中固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
以下是填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝，无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀；有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯，有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1、基质的种类：1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2～8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布，与比表面积成反比。
③比表面积：在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）：在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性：在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾：在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状：硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差，后者无此缺点。
⑧硅胶纯度：对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
HPLC法
高效液相色谱仪
2．色谱柱(column)：一般直径2-6mm,柱长10-50cm色谱 柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不 同： ① 常 规 分 析 柱 （ 常 量 柱 ） ， 内 径 2~5mm （ 常 用 4.6mm，） ② 窄 径 柱 （ narrow bore ， 又 称 细 管 径 柱 、 半 微 柱 semi-microcolumn ） ， 内 径 1~2mm ， 柱 长 10~20cm ③ 毛 细 管 柱 （ 又 称 微 柱 microcolumn ） ， 内 径 0.2~0.5mm； ④半制备柱，内径＞5mm； ⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；
28
• P230高效液相色谱 仪 • 产品编号： C10372 • 产品型号： P230 • 原产地： 大连
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（一）输液系统
高效液相色谱仪
1、高压输液泵(pump)：泵的种类很多，按输液性质可分为
恒压泵和恒流泵。
恒压泵：指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱
系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，流量精度
11
3 .离子交换色谱法(ion exchange chromatography)
以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成 的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离
子基团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不
同而得到分离。 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换 色谱法来进行分离。 不仅适用于无机离子混合物的分离，亦可用于有机物 的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子
HPLC方法建立和优化
4.样品分离的系统方法
充分用已知样品结构确定以哪种方法开始
普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他
观察流动相条件改变时色谱峰的移动
根据变化的方向及大小决定下一步干什么
低pH流动相中寿命缩短 的主要原因是键合相在酸 性条件下水解，这会导致 保留时间和峰形的明显改 变
2.2 色谱柱常见问题 3、色谱柱的维护
三、色谱分离基础
3.1 溶剂的基础知识
粘度
溶剂粘度：
3.5 3
2.5 2
1.5 1
0.5 0
流动相粘度 水百分比
系M列eO1H 系M列eC2N
系Et列OH3 系AMc列eeOtHo4ne 系TH列F 5
a改变 a改变 a改变 a改变 a改变 a改变 a改变 a改变
结果
改变K、a、N 的途径
改变a的途径
改变流动相
改变K、a、N 的途径
改变N值的方法∶
减小填料的颗粒度 找到最佳的流速（根据不同内径） 合适的温度：粘度低、温度高 降低溶剂的粘度 增加柱长 减小柱外效应
k＝VR’/V0
vR
VR v0
VR’
t0
tR‘
tR
k :用来描述色谱柱中溶 质的迁移速度
2.1 色谱柱的性能指标
3、分离因子（ a ）:
a ＝k2/k1
vR
VR v0
VR’
t0
tR‘
tR
a :用来描述和表征两种
不同的溶质在色谱柱里 的分离过程
2.1 色谱柱的性能指标
4、峰的对称性（ AS）:
美国药典要求（5％）
32.4% 13.4% 4.4%
tR
W1/2h
高效液相色谱固定相和流动相
高压液相色谱HPLC培训教程(六)IV．固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝。
无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。
有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。
有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1．基质的种类1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。
与比表面积成反比。
③比表面积。
在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。
在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。
在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。
在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。
硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。
对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
HPLC原理及方法简介
附录---HPLC原理及方法简介I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150-300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1-10.0 mL/min。
高效——可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01 ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快——通常分析一个样品在15-30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
(实验类)HPLC填料用多孔型高分子微球的合成与特性研究
第8卷第3期北华大学学报(自然科学版)Vol.8No.3 2007年6月JOURNAL OF BEIHUA UN IV ERSIT Y(Natural Science)J un.2007文章编号:100924822(2007)0320213204HPLC填料用多孔型高分子微球的合成与特性研究张 英(深圳职业技术学院精细化工与材料系,广东深圳 518055)摘要:采用悬浮聚合法和种子溶胀聚合法合成直径约为5.6μm的多孔型聚甲基丙烯酸甲酯交联高分子微球.研究了两种不同的合成方法在微球直径分布、环己醇和22辛醇两种成孔剂的使用量在微球中形成的孔结构的特点,并对高分子微球填充色谱柱的压力与性能进行了讨论.关键词:HPLC填料;高分子微球;种子溶胀聚合法中图分类号:O658 文献标识码:A 目前HPLC柱填料中硅胶基质固定相仍占据主导地位,硅胶键合相仅可在p H为2～7.5时使用,表面残留的硅羟基对碱性和酸性化合物的分离不理想,硅胶表面的吸附活性往往使蛋白质等生物活性物质降低活性或失去活性[1].具有良好耐酸碱性和一定机械强度的多孔型高分子微球可克服硅胶填料的上述缺点,更适用于生命科学与环境科学的研究需要[2].本文采用悬浮聚合和种子溶胀聚合法合成高分子微球,并对其微球粒子直径、填充色谱柱性能及成孔剂种类与用量对微孔结构的影响进行了讨论.1 实验部分1.1 仪器和试剂HPLC系统由岛津高压液相色谱仪,LC210AD泵,LC210AD紫外检出器,六通阀进样器,C2M10A数据处理系统组成.苯乙烯ST、Methyl methacrylate(MMA)和Ethylene dimethacrylate(EDMA)均为市售品经减压蒸馏后使用.引发剂过硫酸钾(A.R.)和过氧化苯甲酰BPO(A.R.)经重结晶纯化处理.乙腈、甲醇、四氢呋喃均为色谱纯.超纯水使用Model D466BARNSTEAD E2pure装置制备.其余试剂均为分析纯试剂,未经再处理.1.2 悬浮聚合法制备多孔型高分子分离材料将一定量聚乙烯醇溶液加入250mL三口烧瓶中,同时将一定量的Methyl methacrylate(MMA)和Ethylene dimethacrylate(EDMA)单体、开始剂过氧化苯甲酰BPO和成孔剂用超声波分散将其均匀分散在聚乙烯醇水溶液中,加入三口烧瓶.高速搅拌后通氮除氧,搅拌、75℃恒温、聚合反应24h.1.3 种子溶胀聚合法制备多孔型高分子分离材料将一定蒸馏水、甲醇和苯乙烯加入三口烧瓶中,以NaCl为电解质,过硫酸钾为引发剂,通氮除氧, 350r/min搅拌、75℃恒温、聚合反应24h.取出用离心法分离,用水洗涤聚合生成物,得聚苯乙烯种子粒子[324].将定量的聚苯乙烯种子粒子、少量邻苯二甲酸二丁酯、过氧化苯甲酰BPO、十二烷基磺酸钠和水加入250mL三角瓶中,室温搅拌2h后,加入单体Methyl methacrylate(MMA)、Ethylene dimethacrylate (EDMA)、成孔剂和聚乙烯醇水溶液制备的悬浊液,室温搅拌12h后转移至250mL三口烧瓶中,通氮除氧,搅拌,75℃恒温,聚合反应24h.收稿日期:2007202228基金项目:深圳市科技计划项目(03K JB035)资助课题作者简介:张英(1963-),女,副教授,主要从事分离材料、HPLC在药品和食品分析中的应用研究.1.4 色谱柱的充填多孔型高分子微球在甲醇做加压溶剂的条件下湿式充填在内径4.6mm ,长150mm 的不锈钢柱内.1.5 微球粒径测试微球粒径由HITACHI 2S 2800扫描电子显微镜测得.2 结果与讨论2.1 合成方法对高分子微球粒径的影响图1显示了悬浮聚合法和种子溶胀聚合法[5]制备的多孔型高分子微球的扫描电子显微镜图像.从图像中可以清晰看到两种不同聚合方法合成出的高分子微球的粒子直径分布有很大不同,悬浮聚合法制备的多孔型高分子微球的粒子直径分布广,通过粒子分级除去法很难全部除去极小的微球.种子溶胀聚合法制备的多孔型高分子微球粒子径分布很均匀,粒子直径约在5.6μm 左右.a 悬浮聚合法b 种子溶胀聚合法图1 悬浮聚合法和种子溶胀聚合法制备的多孔型高分子微粒的扫描电子显微镜图像Fig.1 Scanning electron micrograph of porous crosslinked polymer particle s by suspension polymerization andseed swelling and polymerization2.2 成孔剂种类和用量对孔结构的影响利用种子溶胀聚合法合成粒径均匀的高分子微球时,通过添加成孔剂使高分子微球形成多孔结构,添加成孔剂制备的多孔型高分子微球的扫描电子显微镜图像见图2.图2中可以清晰地看到微球的多孔结构.本研究使用了环己醇和22辛醇两种成孔剂,添加量分别为单体体积的40%和100%.以四氢呋喃为流动相,标准聚苯乙烯和烷基苯作为溶质,得到分子量溶出容量曲线(SEC 曲线,见图3). 图2 成孔剂在高分子微球上形成的多孔结构 图3 多孔高分子微球的SEC 曲线Fig.2 The porous structure of crosslinked polymer Fig.3 The SEC curve of porous crosslinked polymer particle s particle s412 北华大学学报(自然科学版)第8卷 图2中显示了当成孔剂的种类不变,随成孔剂加入量增加高分子微球的孔体积也增大;添加同等量成孔剂,成孔剂22辛醇形成的孔体积比环己醇形成孔的体积大.图4中还显示了添加100%环己醇和40%22辛醇两种成孔剂制备的高分子微球的孔体积大小近似相同.4种高分子微球的孔结构中,不仅含有可以渗透分子量大于500的大孔结构,还含有可以渗透分子量小于500的微孔结构,40%环己醇制备的高分子微球的孔体积中大孔结构少、小孔结构多.由此说明,多孔高分子微球中含有大孔结构和微孔结构的双重孔构造.2.3 合成方法对高分子孔结构的影响为了比较不同合成方法对高分子孔结构的影响效果,分别使用悬浮聚合法和种子溶胀聚合法制备多孔高分子微球,两种合成方法制备条件完全相同.通过SEC 溶出实验得到4种多孔高分子微球中孔体积,结果见表1.表1 多孔型高分子微球微孔体积Tab.1 The pore volume of porous crosslinked polymer particle s高分子微球种类log M w 孔体积V p V a V b 40%环己醇5.4(5.4)0.58(0.89)0.22(0.23)0.22(0.17)100%环己醇5.8(5.5)0.92(0.97)0.16(0.15)0.15(0.16)40%22辛醇5.8(5.6)0.75(0.91)0.18(0.17)0.12(0.09)100%22辛醇6.6(6.2) 1.04(1.14)0.12(0.12)0.10(0.08)a )M w :溶出界限的聚苯乙烯的分子量;b )V p :流出体积(苯)-流出体积(分子量>1,000,000);c )V a :流出体积(苯)-流出体积(hexylbenzene );d )V b :流出体积(己苯)-流出体积(聚苯乙烯的分子量=760);e )种子溶胀聚合法(悬浮聚合法).图4 多孔高分子微球的SEC 曲线Fig.4 The SEC curve of porous crosslinked polymer particle s 表1中对可以渗透分子量小于760的微孔结构又进一步区分为大微孔体积V b 和小微孔体积V a ;使用环己醇作为成孔剂制备的多孔高分子微球的大微孔体积V b 比使用22辛醇作为成孔剂制备的多孔高分子微球的体积大约2倍,与聚合方法无关.这主要是种子溶胀聚合法使用的聚乙烯种粒子在合成条件下不溶解,聚乙烯种粒子对微球孔结构的形成没有产生影响.但是,使用40%环己醇作为成孔剂的条件下,两种合成方法制备的多孔高分子微球显示了不同的孔结构(见图4),种子溶胀聚合法制备的多孔高分子微球比悬浮聚合法含有较多的大微孔体积.这样的结果只是与40%环己醇作为成孔剂的合成条件下,聚乙烯种粒子少量溶解,影响了微球的微孔结构.2.4 多孔型高分子微球填充色谱柱的性能使用种子溶胀聚合法,100%环己醇作为成孔剂,制备的多孔高分子微球填充在150mm ×4.6mm ID 的色谱柱中.苯作为溶质的条件下,流动相采用70%甲醇的色谱柱理论塔板数为3070,流动相采用55%乙腈的色谱柱理论塔板数为3900.流动相采用55%乙腈的色谱柱理论塔板数比70%甲醇高的结果主要是乙腈对高分子微球的溶胀效应产生的影响.使用种子溶胀聚合法,添加100%环己醇和40%22辛醇两种成孔剂,制备的色谱柱与市售的Shodex DE 2613和Asahipak ODP 250色谱柱的柱压进行了比较,70%甲醇、55%乙腈和40%四氢呋喃作为流动相的柱压及填料相关数据见表2.种子溶胀聚合法制备的高分子微球具有均匀的粒子直径,充填的色谱柱压力相对柱横断面积的流量或线速度比市售色谱柱的压力降低了很多.如果对这种微球表面进行改性处理,可制得具有耐酸耐碱和特种分析分离的多种高性能色谱填料,这方面还有待进一步研究.512第3期张 英:HPLC 填料用多孔型高分子微球的合成与特性研究 表2 合成高分子微球填充色谱柱与市售色谱柱压力Tab.2 The pre ssure of column by porous crosslinked polymer parking and purchase column流动相Shodex DE2613/(kg・cm-2)Asahipak ODP25/(kg・cm-2)100%环己醇/(kg・cm-2)40%22辛醇/(kg・cm22)CH3OH2H2O(70%)551106270CH3CN2H2O(55%)35703543THF2H2O(40%)711568590色谱柱尺寸150mm×6mm150mm×6mm150mm×4.6mm150mm×4.6mm 粒子直径/μm65 5.6 5.6u/(mm・s-1)0.700.68 1.25 1.38 u:流动相线速度=柱长(mm)/t0(s);流速:1.0mL/min.参考文献:[1]王俊德,商振华,郁蕴格.高效液相色谱法[M].北京:中国石化出版社,1992.[2]余晓,赵睿,方梅,等.单分散非多孔交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球作为亲和色谱载体的研究[J].分析化学,2000,28(5):5442548.[3]Hosoya K,Frechet Jean MJ.Influence of the Seed Polymer on the Chrom Autographic Properties of Size MonodispersePolymeric Separation Media Prepared by a Multi2step Swelling and Polymerization Method[J].J.Polym Sci,Polym.Chem.Ed,1993,31:212922141.[4]赵中璋,杨树明,杨彦果,等.分散聚合制备粒度均匀的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球[J].高分子学报,1999(1):31236.[5]熊博辉,沈丽,从润滋,等.单分散多孔交联聚苯乙烯色谱填料的合成[J].色谱,1998,16(6):4922494.On Synthe sis of Porous Cro sslinked Polymethylmethacrylate Chromatographic Parking and Its CharacteristicZHANG Ying(Fi ne Chem icals and M aterials Depart ment of S henz hen Polytechnic,S henz hen518055,Chi na)Abstract:Porous crosslinked polymethylmethacrylate microspheres having a size of5.6μm were prepared by suspension polymerization and seed swelling and polymerization.The influences of different synthetic methods on size dispersity and structure of micropore by the microspheres were studied.The chromatographic performance of the microspheres was examined preliminarily.K ey w ords:Chromatographic parking;Porous crosslinked polymer particles;Seed swelling and polymerization【责任编辑:吕洪斌】612 北华大学学报(自然科学版)第8卷。
HPLC-基础知识
亲和色谱(AC)
Affinity chromatograph
❖ 原理：利用生物大分子和固 定相表面存在的某种特异性 亲和力，进行选择性分离
先在载体表面键合上一种具 有一般反应性能的间隔臂 (环氧、联胺等)，再连接上 配基(酶、抗原等)，这种固 载化的配基将只能和具有亲 和力特性吸附的生物大分子 作用而被保留。改变淋洗液 后洗脱
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构 水为流动相。适用于常压排阻分离
（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广
c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N C18 十八烷基硅烷键合硅胶
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快 （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击
❖ 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂
❖ 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附 与解吸附 适用于分离相对分子质量中等的油溶 性试样，对具有官能团的化合物和异构体 有较高选择性
液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）
❖ 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。
❖ 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采 用。现今多采用化学键合固定相：将各种不同基 团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离 羟基上。例如：C-18柱（反相柱）
高效液相色谱法(1)
UV absorbance
Hydrophobic interaction Chromatography
nonpolar
--
protein surface
+++
nonpolar
O H3C-C-N-C-O-
NH
填料：
基质：有机聚合物（交联琼脂 糖、乙烯聚合物、TSK-PW） 和大孔硅胶键合相
为了获得合适的溶剂强度(极性),常采用二元或 多元组合的溶剂体系作为流动相.
采用的溶剂可分为底剂及洗脱剂两部分
底剂决定基本的色谱分离, 洗脱剂具有对组分选择性分离
正相色谱中底剂采用低极性溶剂,洗脱剂选择极 性较强的溶剂.
反相色谱中底剂采用强极性溶剂(水),洗脱剂选 择极性较弱的溶剂(有机溶剂).
离子交换色谱主要在含水介质中进行,组分保 留值可以用流动相中盐的浓度和 pH来控制,增加 盐的浓度导致保留值降低,由于流动相离子与交 换树脂相互作用力不同,因此流动相中离子类型 对样品组分的保留值有显著影响.
30KD
50KD
15
20
25
30
Ion Exchange Chrom
protein B protein B Prot ein B
Prot ein A
-- Na+ SO3+ CM
Prot ein B Pro tei nA
常用填料： 磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸 酯、表面改性硅胶等… 分类： 阳离子交换、阴离子交换
反相色谱-流动相的极性小于固定相的分离体系；机理-被分离
物的与固定相的疏水相互作用力的差别；流动相-极性的有机溶 剂或水；分离-范围最广。
RPC
高效液相色谱法
换键合相两种类型。
主要用于分析无机与有机离子、氨基酸、糖
类以及DNA、RNA的水解产物等。
第十章
高效液相色谱法
仪器分析技术
(四)分子排阻色谱法
利用凝胶对分子大小不同的组分分子有不同
的阻滞作用而进行分离、分析的方法。
主要用于分离相对分子质量大的化合物。
第十章
高效液相色谱法
仪器分析技术
(五)离子抑制色谱法
仪器分析技术
第四节
输液系统
进样系统
高效液相色谱仪
一、基本结构
分离系统
检测系统 数据记录处理系统
第十章
高效液相色谱法
仪器分析技术
分析流程：
分析前:
选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待
柱子达到平衡而且基线平直。
进样:
用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入 色谱柱进行分离。
适合与极性较弱的流动相配伍，构成正相色谱，用于分析极 性或中等极性样品。
非极性键合相：键合的基团为极性小的烃基，如十八烷基、
辛烷基、甲基等，适合与极性较强的流动相配伍，构成反相 色谱，分析非极性至中等极性的样品。
离子交换键合相：键合的有机硅烷分子中带有固定的阳离
子或阴离子交换基团，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。 用于梨汁交换色谱或离子色谱。
异构体的分离分析。
第十章
高效液相色谱法
仪器分析技术
(二)液-液分配色谱法
是应用最广泛的色谱法。 早期多采用机械涂渍或物理涂渍的方法，固
定液易流失、色谱柱短。
现多采用化学键合的方法键合在载体表面，
是目前应用最广、性能最佳的固定相。
第十章
高效液相色谱法
生物工程下游技术第十一章_无机基质高效色谱填料PPT课件
• 缺点：游离硅羟基可能导致非特异性吸附 及蛋白质失活;适应的pH范围有一定的局限; 制造成本较高。
2.物理特性:
• 机械强度高,可耐受剧烈、反复的处 理和操作，耐压力强。
• 孔径分布窄而均匀。
3.制造:
• 采用普通玻璃制造工艺：精细选择并 控制适宜的相分离温度与时间。孔
O Si
Si
O Si
OH OH
O Si OH
C、单体（二甲基-取代）
Si
O Si
Si
OH
Si
O
Si
Si
OH
Si
O Si
B、横向交联
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
D、单体（空间保护）
Si
O Si
Si
OH
Si
O
Si
Si
OH
Si
OH
与硅胶担体共价键合硅烷的各种类型
小。广泛应用。
各类无机色谱填料
• 正相色谱填料 • 反相色谱填料 • 凝胶过滤色谱填料 • 高效离子交换色谱填料 • 高效亲和色谱填料 • 高效疏水色谱填料
第三节 正相色谱填料
• 液相色谱分正相和反相色谱（依据相间的相对极性） 正相：固定相极性大于流动相极性， 适用于非极性至中等极性的中小分子化合物
3、通过烷氧基硅烷与硅羟基的反应：
• 烷氧基硅烷与硅胶进行缩合反应，使硅胶 表面带上环氧基或氨基等基团，在此基础 上可以很方便地进一步进行反应或修饰。 这一键合反应可以在水相，也可以在有机 介质中进行。
高效液相色谱HPLC简介
4.1.2 色谱法简介（二）
体积排阻色谱法--------以多孔性凝胶为固定相，借助 多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶 孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱 柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小 分别先后流出。
4、色谱分析法简介
4.1.1 色谱分析法介绍（一）
液固色谱------以固体吸附剂为固定相，依靠吸附－脱附 平衡实现分离，常用的固定相有碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、 氧化镁、活性炭等。
特点：有时会发生不可逆吸附，应用受到限制。
液液色谱------以吸附载带在惰性固相载体上的极性或非 极性固定液为固定相，依靠溶解－解吸平衡实现分离。
反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱 官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓 冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的 组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5 （Phenyl）等。
◆ 荧光检测器（FLD）
原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光） 的性质检测。
特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和 温度敏感性低。
3.4.3 检测器简介（三）
◆ 蒸发光散射检测器（ELSD） 原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。
色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气 （氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流 动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微 小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光 被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。 特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏 度高，是通用型检测器。
液相色谱基础知识(waters)
寿命 (小时)
Xterra: 快梯度分析
AU
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2.20
2.40
Waters特殊应用的色谱柱(1)
糖及其它碳水化合物的分析 离子交换柱(钙基/Ca) 用于单糖、双糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析。主要用于药厂维生素C的原料分析(sorbitol/mannitol-山梨醇/甘露醇)，酒厂(葡萄酒、啤酒等)的糖及乙醇含量的分析。 柱温~90℃，要求有柱温箱。对流动相(水)的要求较高，要求用户另置超纯水系统。 氨基类型柱 分析单糖、双糖及三糖等多糖的分析，最大到DP10。用途较为广泛，主要用于食品中糖的分析。 反相类型柱 硅胶类型柱 体积排除(凝胶/GPC)类型柱
色谱柱的联接
各种锥箍和管路接头长度示意图:
色谱柱的联接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的联接
锥箍锥度不合适造成渗漏:
Waters色谱柱的联接
Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出的不锈钢管长度不同 其长度被称为：“stop-depth” Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英寸 Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations公司的其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其stop-depth为0.090英寸
测柱效-良好的色谱实验习惯
第十章有机高分子基质的HPLC填料20120406
4、电导检测器 （electrical conductivity detector）
• 属电化学检测器，是离子色谱法中应用最为广泛的检测器 • 作用原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变 化来测定电离物质的含量。
受温度影响较大，须严格控制 温度 化学抑制型离子色谱体系中可 直接检测
5、蒸发光散射检测器
(2)离子对色谱法（IPC）
• IPC是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法
。它是离子对萃取技术与色谱法相结合的产物。
• 1．离子对色谱法原理
离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子
电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动
相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对
，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。
（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗 粒强度和表观形态→柱效率、穿透性）
• 化学结构→色谱热力学
（连接在基质上的官能团或链段→样品保 留值、选择性）
1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求:
① 颗粒大小合适，粒度分布较窄; ② 颗粒强度适应高速高压操作; ③ 多孔型的孔径大小和孔径分布适宜,避免复 杂的微孔结构; ④ 一定的溶胀及收缩水平。
四、馏分收集器
• HPLC：柱后流出物中被分离组分在室温下都 以溶液形式存在，溶剂挥发后可得到纯组分 • →收集纯馏分做进一步鉴定、考察；
• →或者是为了获得足够量的纯产品
对于简单的混合物，可用试管手工收集 按照记录仪上色谱峰的起止信号，并考虑滞后时间，确定 收集开始和收集结束的时间，转动三通阀以完成馏分收集 对于成分复杂的样品，使用自动馏分收集器
的分子不被保留。
第二部分 ：HPLC分离填料
多糖型凝胶
有机基质
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三氟乙酸(TFA )
五、离子交换HPLC填料
Ion exchange chromatography IEC
在IEC中,高分子类型填料表现更大的优越性。
大致有3类： • 多糖基质的离子交换层析介质 • 聚合物基质的高效离子交换色谱填料 • 高聚物型离子交换色谱填料
1.多糖基质的离子交换层析介质
5PW,CM-5PW等 • 交联聚甲基丙烯酸羟基乙酯:亲水,大孔
b.非多孔树脂的IEC填料:
• 羟基化聚醚,交联聚苯乙烯,交联聚 甲基丙烯酸酯,交联琼脂糖等。
• 优点:颗粒小,均匀,刚性好,色谱穿透性
强,流速适应范围宽。避免了固相内的吸 附与扩散，因此具有高柱效,高分离度和 高样品回收率的特点。
c.薄壳型树脂的IEC填料:
以合成树脂为基 质的产品，颗粒 <7µm
同左
目前的主要发展方向(研究热点):
① 颗粒单分散的填料; ② 贯穿性超大孔结构的填料; ③ 小颗粒的非多孔填料。
2、HPLC色谱柱填料在化学结构上的要求
① 特定的选择性; ② 良好的化学稳定性及热稳定性; ③ 避免不可逆吸附。
不同填料的化学结构是通过对基质材料的 化学改性而实现的。
底宽度一半之和的比值。
四、反相HPLC高分子填料
Reversed Phase Chromatography,RPC
反相色谱（原理参照P237） ：非极性固定
相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。
1.目前RPC分离柱以硅胶基质的键合相填料为主， 特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。
特点：传质快，刚性好，柱效高，选择性好。 不足：pH2~8，容易使蛋白质失活（残留的硅
② 高交联的多糖类凝胶:Superdex,Superose, Sephacryl, Sepharose CL
• 高聚物型
多孔交联聚甲基丙烯酸酯类树脂,交联聚乙 烯醇树脂,亲水化处理的交联聚苯乙烯树脂, 羟基化聚醚类.(表10-7 P213)
凝胶渗透色谱 Gel permeation chromatography, GPC
① 传统的多糖类软质凝胶制得强弱阴阳离子 交换介质：具有很好亲水性和生物相容性；
② 高交联度多糖类凝胶填料：还适于较高压 力和流速下操作。
2.聚合物基质的高效离子交换色谱填料
① 交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯 ② 聚甲基丙烯酸酯; ③ 4-乙烯吡啶共聚物
特点：高交联大孔结构,良好的刚性
和小而均匀的粒度
离子交换色谱填料
颗粒表面携带季铵基、DEAE基、磺酸基、羧基等强 弱阴阳离子集团。
反相色谱填料
C18、C8烷基等疏水性集团
正相色谱填料
羟基、氨基、氰基等弱疏水性集团
亲和色谱填料
蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异 性的配基
二、有机高分子类型的HPLC填料基质树脂
基质材料决定填料物理结构和化学结构:
a.多孔树脂的IEC填料:
柱效、穿透性、分离度、负载量、回收率的性能优异 • Mono Beads 系列：包括Mono Q, Mono S, Mono P • SOURCE系列:15Q,15S,30Q,30S • 贯流色谱填料POROS系列 • 羟基化聚醚凝胶：如TSK gel DEAE-5PW,SP-
颗粒大小与分布,颗粒强度,孔径大小,孔结构 形态,颗粒内部的化学结构及其稳定性, 直接影响 对颗粒的表面(包括内孔表面)的化学修饰。
可分为:
多糖型 聚合物型
（一）多糖型基质材料
1.葡聚糖系:
① 高交联的羟丙基化葡聚糖,其颗粒刚性好,粒度 小而且分布范围窄（10~23µm）;
Sephasorb HP Uitrafine 用于中低压色谱和高效色谱
（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗 粒强度和表观形态→柱效率、穿透性）
• 化学结构→色谱热力学
（连接在基质上的官能团或链段→样品保 留值、选择性）
1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求:
① 颗粒大小合适，粒度分布较窄; ② 颗粒强度适应高速高压操作; ③ 多孔型的填料孔径大小和孔径分布适宜,避
• 交联聚苯乙烯树脂:
苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物(PS-DVB)， 是应用最为广泛的一类基质树脂。
• 交联聚甲基丙烯酸酯类树脂:
以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、 环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。
三、填料性能评价
• 填料的物化性质指标 • 填料的色谱性能表征
1、物化性质指标:
a.颗粒大小及其分布(dp); b.比表面积S(m2/g)； c .骨架密度ρg(g/ml)、溶剂吸收量Sr(ml/g)、
分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作 参数选择广泛;
分离纯化+分析检测; 样品量从痕量到大规模制备，实现在线监
测和自动化操作。
HPLC的关键设备
① 专用的高压输液系统; ② 高灵敏检测系统; ③ 高效分离柱
• 其中分离柱是色谱的中心, 是最为关键的部分
与经典色谱的比较
色谱法 固定相粒度 柱长及内径 采用压力 分析速度 经典 大于 100μm 10-100cm φ2-5cm 常压 几十小时 高效 5－10μm 10-30cm φ1-5mm 107Pa 几分钟
羟基）
2. 广泛使用的是微球形交联聚苯乙烯树脂，
另有带C18烷基侧链的聚丙酰胺、聚甲基 丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化 物，C18烷基键合的聚乙烯醇。
优点：pH范围较广，表面有较强的疏水性
主要厂家
日本：东洋-曹达Tosoh----TSK 瑞士：Hamilton,汉密尔顿, 英国：高聚物实验室Polymer Lab 美国：Bio-Rad伯乐 瑞典：安捷伦Agilent
HPLC分离填料：
有机基质
多糖型凝胶 高聚物树脂
➢基质微球——天然多 糖或合成单体或交联剂 ➢负载样品的能力强， 色谱容量高 ➢耐酸碱、具化学稳定 性，柱寿命长，易再生 ➢不易产生非特异性吸 附作用
无机基质
硅胶 氧化锆 氧化铝 多孔玻璃 羟基磷灰石
石墨化碳黑
一、HPLC色谱柱的关键在于填料
• 物理结构→色谱动力学
2. 填料和试样尽可能不发生任何基团之间的 相互作用,即尽可能避免非空间排阻效应；
3. 填料的多孔结构是SEC建立的基础；
SEC填料的色谱特征：
除了柱效,选择性,分离度,穿透性等一 般色谱表征外,尚需要满足以下指标： ① 排阻极限; ② 分离范围; ③ 固流相比
凝胶填料主要类型
• 多糖类
① 传统的软质凝胶:葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰 胺型凝胶
• 常见淋洗液有(NH4)2SO4, NH4Ac, NaCl,磷 酸盐等,其中(NH4)2SO4是最广泛应用的。
疏水色谱HPLC填料
• 一般是亲水性基质,或在合成的非亲水性基质上
连接一定的亲水基团，然后引入疏水性基团,主
要有丁基、辛基、苯基等以及聚乙二醇。 • 其基质可以是多糖类,也可以是各类高分子多聚
详见：P194表10－1
• 被分离样品的分子量大小与填料的孔径选择
如PLRP－S填料：
孔径＝10nm，适于分离15－20个氨基酸长度的肽类； 孔径＝30nm，适于分离中等分子量的球形蛋白质； 孔径＝100nm，适于分离较大的球形蛋白质或纤维状
结构的化合物； 孔径＝400nm，适于分离很大分子量的蛋白质。
物,包括交联聚苯乙烯树脂、硅胶、羟基化聚醚 树脂、交联甲基丙烯酸酯类。
• HIC填料绝大多数是多孔结构,主要是超大孔结
构，也可以是非多孔结构的。 • P206表10-4
七、有机高分子类型的空间排阻HPLC填料 Size exclusion chromatography, SEC
SEC填料特征：
1. 填料的性质必须与溶质和淋洗体系相匹配, 可以被淋洗剂所浸润；
• 有机溶剂为流动相 • THF四氢呋喃
八、有机高分子类型生物亲和HPLC填料 Affinity chromatography, AFC
• 优点:高选择性,能有效保持生物分子的
高级结构稳定性,活性样品的回收率。 • 按其基质不同分:多糖型和高聚物型。 • 按其所带配体对被分离物质的选择性特
征可分为通用型和专用型。
免复杂的微孔结构; ④ 一定的溶胀及收缩水平。
常见的液相色谱填料类型
多孔型
非多孔型
分：小孔（<10nm）、中 整体颗粒无孔 孔（10-30nm）、大孔 （>30nm）和超大孔 （>100nm），应用占主 导地位
薄壳型
颗粒表面层多 孔，内部无孔。
以合成树脂为基质的产 品，颗粒在10µm左右
以多糖凝胶为基质的产 品，颗粒都>20µm左右
② 烯丙基葡聚糖与N,N`-亚甲基双丙烯酰胺交联共 聚而成的凝胶。 Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)属 于高效凝胶，较高流速下使用
2.琼脂糖系:
① Sepharose与2,3-二溴丙醇反应生成琼脂糖凝胶
Sepharose CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)
第十章 有机高分子基质的高效液 相色谱分离柱填料
首先回顾几个问题
• HPLC方法的主要特点有那些？ • HPLC的主要设备分哪几部分？
HPLC方法的主要特点
分离效率高，选择性好，适于各种多元组 分复杂化合物的分离;
应用范围广：无机物—有机物，天然物质 —合成产物，小分子---大分子，一般化合 物到生物活性物质;
溶胀因子f; d.比孔体积Vp(ml/g); e.孔度Ψ； f.孔径大小及分布； g.化学结构与化学性质。
2、色谱性能表征:
① 保留值：
保留时间(TR),保留体积(VR),容量因子(K`)
② 选择性：相邻二物质保留时间之比,与固定相、流
动相及温度有关。