第十章_有机高分子基质的HPLC填料

HPLC分离填料：
有机基质
多糖型凝胶 高聚物树脂
➢基质微球——天然多 糖或合成单体或交联剂 ➢负载样品的能力强， 色谱容量高 ➢耐酸碱、具化学稳定 性，柱寿命长，易再生 ➢不易产生非特异性吸 附作用
无机基质
硅胶 氧化锆 氧化铝 多孔玻璃 羟基磷灰石
石墨化碳黑
一、HPLC色谱柱的关键在于填料
• 物理结构→色谱动力学
羟基）
2. 广泛使用的是微球形交联聚苯乙烯树脂，
另有带C18烷基侧链的聚丙酰胺、聚甲基 丙烯酸的烷基酯化物、聚乙烯醇的酯化 物，C18烷基键合的聚乙烯醇。
优点：pH范围较广，表面有较强的疏水性
主要厂家
日本：东洋-曹达Tosoh----TSK 瑞士：Hamilton,汉密尔顿, 英国：高聚物实验室Polymer Lab 美国：Bio-Rad伯乐 瑞典：安捷伦Agilent
免复杂的微孔结构; ④ 一定的溶胀及收缩水平。
常见的液相色谱填料类型
多孔型
非多孔型
分：小孔（<10nm）、中 整体颗粒无孔 孔（10-30nm）、大孔 （>30nm）和超大孔 （>100nm），应用占主 导地位
薄壳型
颗粒表面层多 孔，内部无孔。
以合成树脂为基质的产 品，颗粒在10µm左右
以多糖凝胶为基质的产 品，颗粒都>20µm左右
溶胀因子f; d.比孔体积Vp(ml/g); e.孔度Ψ； f.孔径大小及分布； g.化学结构与化学性质。
2、色谱性能表征:
① 保留值：
保留时间(TR),保留体积(VR),容量因子(K`)
② 选择性：相邻二物质保留时间之比,与固定相、流
动相及温度有关。
③ 柱效率：理论塔板数(N)，或理论塔板高度(H)表示。 ④ 填充柱的总空隙度和穿透性： ⑤ 分离度(R)：相邻两色谱峰的保留值之差与各自峰
① 传统的多糖类软质凝胶制得强弱阴阳离子 交换介质：具有很好亲水性和生物相容性；
② 高交联度多糖类凝胶填料：还适于较高压 力和流速下操作。
2.聚合物基质的高效离子交换色谱填料
① 交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯 ② 聚甲基丙烯酸酯; ③ 4-乙烯吡啶共聚物
特点：高交联大孔结构,良好的刚性
和小而均匀的粒度
底宽度一半之和的比值。
四、反相HPLC高分子填料
Reversed Phase Chromatography,RPC
反相色谱（原理参照P237） ：非极性固定
相，极性流动相，强极性组分先洗脱出来。
1.目前RPC分离柱以硅胶基质的键合相填料为主， 特别是键合C18，C8烷基以及苯基填料。
特点：传质快，刚性好，柱效高，选择性好。 不足：pH2~8，容易使蛋白质失活（残留的硅
离子交换色谱填料
颗粒表面携带季铵基、DEAE基、磺酸基、羧基等强 弱阴阳离子集团。
反相色谱填料
C18、C8烷基等疏水性集团
正相色谱填料
羟基、氨基、氰基等弱疏水性集团
亲和色谱填料
蛋白质、抗体、激素、抗菌素、酶等具有生物特异 性的配基
二、有机高分子类型的HPLC填料基质树脂
基质材料决定填料物理结构和化学结构:
以合成树脂为基 质的产品，颗粒 <7µm
同左
目前的主要发展方向(研究热点):
① 颗粒单分散的填料; ② 贯穿性超大孔结构的填料; ③ 小颗粒的非多孔填料。
2、HPLC色谱柱填料在化学结构上的要求
① 特定的选择性; ② 良好的化学稳定性及热稳定性; ③ 避免不可逆吸附。
不同填料的化学结构是通过对基质材料的 化学改性而实现的。
② 高度偶联琼脂糖凝胶Sepharose Fast Flow
(Sepharose 6FF, Sepharose 4FF)
③ 高效琼脂糖凝胶Sepharose high Performance
Superdax(葡聚糖与交联琼脂糖的结合)：快流速
Superose(珠状琼脂糖经两次交联)：高效凝胶
（二）聚合物型基质材料
详见：P194表10－1
• 被分离样品的分子量大小与填料的孔径选择
如PLRP－S填料：
孔径＝10nm，适于分离15－20个氨基酸长度的肽类； 孔径＝30nm，适于分离中等分子量的球形蛋白质； 孔径＝100nm，适于分离较大的球形蛋白质或纤维状
结构的化合物； 孔径＝400nm，适于分离很大分子量的蛋白质。
• 有机溶剂为流动相 • THF四氢呋喃
八、有机高分子类型生物亲和HPLC填料 Affinity chromatography, AFC
• 优点:高选择性,能有效保持生物分子的
高级结构稳定性,活性样品的回收率。 • 按其基质不同分:多糖型和高聚物型。 • 按其所带配体对被分离物质的选择性特
征可分为通用型和专用型。
② 高交联的多糖类凝胶:Superdex,Superose, Sephacryl, Sepharose CL
• 高聚物型
多孔交联聚甲基丙烯酸酯类树脂,交联聚乙 烯醇树脂,亲水化处理的交联聚苯乙烯树脂, 羟基化聚醚类.(表10-7 P213)
凝胶渗透色谱 Gel permeation chromatography, GPC
• 交联聚苯乙烯树脂:
苯乙烯与二乙烯苯的交联共聚物(PS-DVB)， 是应用最为广泛的一类基质树脂。
• 交联聚甲基丙烯酸酯类树脂:
以甲基丙烯酸的甲脂、丁酯、羟基乙酯、 环氧丙酯等化合物为单体制备的交联高聚物。
三、填料性能评价
• 填料的物化性质指标 • 填料的色谱性能表征
1、物化性质指标:
a.颗粒大小及其分布(dp); b.比表面积S(m2/g)； c .骨架密度ρg(g/ml)、溶剂吸收量Sr(ml/g)、
三氟乙酸(TFA )
五、离子交换HPLC填料
Ion exchange chromatography IEC
在IEC中,高分子类型填料表现更大的优越性。
大致有3类： • 多糖基质的离子交换层析介质 • 聚合物基质的高效离子交换色谱填料 • 高聚物型离子交换色谱填料
1.多糖基质的离子交换层析介质
物,包括交联聚苯乙烯树脂、硅胶、羟基化聚醚 树脂、交联甲基丙烯酸酯类。
• HIC填料绝大多数是多孔结构,主要是超大孔结
构，也可以是非多孔结构的。 • P206表10-4
七、有机高分子类型的空间排阻HPLC填料 Size exclusion chromatography, SEC
SEC填料特征：
1. 填料的性质必须与溶质和淋洗体系相匹配, 可以被淋洗剂所浸润；
5PW,CM-5PW等 • 交联聚甲基丙烯酸羟基乙酯:亲水,大孔
b.非多孔树脂的IEC填料:
• 羟基化聚醚,交联聚苯乙烯,交联聚 甲基丙烯酸酯,交联琼脂糖等。
• 优点:颗粒小,均匀,刚性好,色谱穿透性
强,流速适应范围宽。避免了固相内的吸 附与扩散，因此具有高柱效,高分离度和 高样品回收率的特点。
c.薄壳型树脂的IEC填料:
（粒度与粒度分布、孔径与孔径分布、颗 粒强度和表观形态→柱效率、穿透性）
• 化学结构→色谱热力学
（连接在基质上的官能团或链段→样品保 留值、选择性）
1、HPLC色谱柱填料在物理结构上的要求:
① 颗粒大小合适，粒度分布较窄; ② 颗粒强度适应高速高压操作; ③ 多孔型的填料孔径大小和孔径分布适宜,避
2. 填料和试样尽可能不发生任何基团之间的 相互作用,即尽可能避免非空间排阻效应；
3. 填料的多孔结构是SEC建立的基础；
Hale Waihona Puke Baidu
SEC填料的色谱特征：
除了柱效,选择性,分离度,穿透性等一 般色谱表征外,尚需要满足以下指标： ① 排阻极限; ② 分离范围; ③ 固流相比
凝胶填料主要类型
• 多糖类
① 传统的软质凝胶:葡聚糖,琼脂糖,聚丙烯酰 胺型凝胶
颗粒大小与分布,颗粒强度,孔径大小,孔结构 形态,颗粒内部的化学结构及其稳定性, 直接影响 对颗粒的表面(包括内孔表面)的化学修饰。
可分为:
多糖型 聚合物型
（一）多糖型基质材料
1.葡聚糖系:
① 高交联的羟丙基化葡聚糖,其颗粒刚性好,粒度 小而且分布范围窄（10~23µm）;
Sephasorb HP Uitrafine 用于中低压色谱和高效色谱
分离机理各异，色谱柱、淋洗体系和操作 参数选择广泛;
分离纯化+分析检测; 样品量从痕量到大规模制备，实现在线监
测和自动化操作。
HPLC的关键设备
① 专用的高压输液系统; ② 高灵敏检测系统; ③ 高效分离柱
• 其中分离柱是色谱的中心, 是最为关键的部分
与经典色谱的比较
色谱法 固定相粒度 柱长及内径 采用压力 分析速度 经典 大于 100μm 10-100cm φ2-5cm 常压 几十小时 高效 5－10μm 10-30cm φ1-5mm 107Pa 几分钟
a.多孔树脂的IEC填料:
柱效、穿透性、分离度、负载量、回收率的性能优异 • Mono Beads 系列：包括Mono Q, Mono S, Mono P • SOURCE系列:15Q,15S,30Q,30S • 贯流色谱填料POROS系列 • 羟基化聚醚凝胶：如TSK gel DEAE-5PW,SP-
② 烯丙基葡聚糖与N,N`-亚甲基双丙烯酰胺交联共 聚而成的凝胶。 Sephacryl系列(S-100HR,S-200HR,S-300HR)属 于高效凝胶，较高流速下使用
2.琼脂糖系:
① Sepharose与2,3-二溴丙醇反应生成琼脂糖凝胶
Sepharose CL(CL-2B,CL-4B,CL-6B)
第十章 有机高分子基质的高效液 相色谱分离柱填料
首先回顾几个问题
• HPLC方法的主要特点有那些？ • HPLC的主要设备分哪几部分？
HPLC方法的主要特点
分离效率高，选择性好，适于各种多元组 分复杂化合物的分离;
应用范围广：无机物—有机物，天然物质 —合成产物，小分子---大分子，一般化合 物到生物活性物质;
• 常见淋洗液有(NH4)2SO4, NH4Ac, NaCl,磷 酸盐等,其中(NH4)2SO4是最广泛应用的。
疏水色谱HPLC填料
• 一般是亲水性基质,或在合成的非亲水性基质上
连接一定的亲水基团，然后引入疏水性基团,主
要有丁基、辛基、苯基等以及聚乙二醇。 • 其基质可以是多糖类,也可以是各类高分子多聚
• 优点:柱效高,选择性好,分离度高, 穿透性好,回收高,流速快等
六、有机高分子类型的疏水HPLC填料
Hydrophobic interaction chromatography,HIC
• HIC:填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏
水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互 作用。高浓度盐条件下,蛋白质与疏水固定 相的吸附能力高,随着盐浓度的下降,吸附能 力下降。当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋 白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱。