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2009年第1期

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1975年德国学者Kohler 和英国学者M ilstein 发明了杂交瘤技术。他们成功地将骨髓瘤细胞和产生抗体的B 淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞稳定、有致瘤性、能产生抗体，其分泌的抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，故称之为单克隆抗体(简称单抗)。自从鼠源单抗之后，单抗历经了鼠源性抗体、嵌合抗体、

人源化抗体、人源性抗体4个发展阶段。近年来随着分子生物学和细胞生物学的发展，单克隆抗体的应用已日益普及，单抗理论几乎应用到生物学研究的每一个区域。单克隆抗体制备技术的发展也就显得尤为重要。1

单克隆抗体的研究进展

1.1鼠源性单抗自单克隆抗体制备技术问世以来，制备单抗的一般程序基本相同，从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠，获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对单个细胞进行克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前生产的单抗大多是鼠源性的，但其在临床应用方面还存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK 等免疫细胞表面Fc 段受体亲和力弱,产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用较弱，而且它与人补体成分结合能力低,对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥AD-CC 作用的时间较短；

其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，使宿主易引起过敏反应。这样一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来严重的后果。因此鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。

1.2嵌合抗体抗体的恒定区是抗体分子结构中免疫原性

最强的部位，而决定抗体特异性的是抗体的可变区。从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig 恒定区的基因连

接,再插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽可能的去除鼠源化部分或代之以人源化片断，减少了鼠源性抗体的免疫原性，从而尽可能的减少单抗的异源性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。但是这种抗体仍保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应(HAM A)。

1.3人源化抗体由于嵌合抗体异源性仍然很大，因此需要对鼠源抗体进行人源化改造，进一步人源化的方法很多,主要是重构抗体和表面重塑技术。重构抗体就是互补决定区(complementarity determining region,CDR)移植，将鼠抗体的CDR 移植到人抗体的相应部位，这样人源化程度可达90%以上，目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法。而表面重塑技术，即将鼠抗体框架区表面氨基酸的残基(surface amino acid residues,SAR)进行人源化改造。该方法是仅替换与人抗体SAR 差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。

1.4人源性抗体虽然人源化抗体解决了鼠抗体的免疫原

性等问题，但生产人源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常大，并且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用于治疗的理想抗体，目前它主要通过3种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠制备人源性抗体。1.4.1

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术是迄今发展

最成熟、

应用最广泛的抗体库技术。其基本原理是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA 中,与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白,从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。通过这种方式,形成了一个收藏上亿个以体外方式制得的不同抗体的基因数据库,使从任何真实的抗原中迅速分离高度相似的同族抗体成为可能。分离得到的抗体可用于

单克隆抗体及其应用的研究进展

孔

维1，杨文辉2

（1.东北农业大学动物医学院，哈尔滨150001；2.哈尔滨北方森林动物园，哈尔滨150300）

000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000作者简介：孔维（1979～），湖南平江人，硕士研究生

专论与综述

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畜牧兽医科技信息

制备完全人源化的单克隆抗体产品。随着噬菌体表面展示技术的成熟与不断应用，其肽库的构建及筛选技术得到迅速发展和推广，已广泛应用于包括基因定位、分子识别、疫苗设计等许多领域。但该技术也存在一定的局限性,如库容量的有限性，密码子的偏爱性,氨基酸的修饰受宿主限制等,而且该技术依赖于细胞内基因的表达,所以一些对细胞有毒性的分子很难得到有效的表达。1.4.2

核糖体展示技术

1994年,M attheakis 等建立了一种

体外核糖体展示随机肽系统,利用“多肽-核糖体-mRNA ”复合物将肽库构建在多核糖体上,借助多核糖体在体外将基因型和表型联系起来。1997年,Hanes 和Plukthun 等在此基础上加以发展和完善,建立了核糖体展示技术。它的基本原理是通过PCR 扩增目的基因的DNA 文库,同时加入启动子、核糖体结合位点及茎环,并置于具有耦联转录/翻译的无细胞翻译系统中孵育,是目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面,并形成“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体,最后通过常规的免疫学检测方法,通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用RT-PCR 扩增,经过多次循环过程，最终筛选出高亲和力的目标分子。由于此技术是一个完全在体外进行转化和筛选的过程,其中的每一步包括所有的复制、

扩增、转录、筛选均在体外完成，因此可以构建超大容量的库容，也可以联合使用一些特殊的PCR 技术。利用核糖体展示技术可以获得高特异性、高亲和力的抗体。1.4.3

基因工程小鼠制备全人抗体

制备全人抗体的基因

工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠(hu-PBL-SCID 小鼠)、

转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。Hu-PBL-SCID 小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(SCID),经抗原免疫后可获得人源抗体。转基因小鼠：转基因小鼠技术就是将外源DNA 导入到小鼠基因组中，建立小鼠基因组中带有外源基因的遗传性小鼠突变模型的方法和技术。

该方法的核心思想是利用编码人抗体的基因序列库转化鼠细胞以形成转基因鼠,在抗原刺激下,该转基因鼠可分泌合成人抗体，该抗体没有人源化鼠抗体的免疫原性，该法也避免了直接接种患者来刺激B 细胞产生抗体。发展转基因鼠技术的动力是鼠源性单克隆抗体的免疫原性，尽管转基因鼠生产的人抗体尚处于临床研究中，目前的调查结果是乐观的。Foon 等对88个接种了转基因鼠人抗体的作了追踪调查，未发现任何针对转基因抗体的抗体反应，这表明这种分子是低免疫原性的。当然，研究还有待进一步深化。转染色体小鼠：通过微细胞介导法(M M CT 方法)将人14号染色体上产生IgH 的胚系片段和2号染色体上5～50M b 的κ轻链片段转染到ES 细胞,获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后,可产生抗人血清白蛋白的人Ig ，再次免疫后产生IgM 。由转染色体技术得到的小鼠，表达的人IgG 各亚类的量与人血清中表

达的IgG 各亚类相同,且可同时在一个转基因小鼠内表达；但是,转染色体小鼠导入的人Ig 片断虽然比较大,但其表达的人Ig 量却比较低。2

单克隆抗体在临床上的应用

30年以来,人们一直尝试利用人免疫系统产生人源性单抗来制备特异性强的人源抗体药物,从而治疗肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病等。根据用途的不同，单抗大体上可分为三类，即诊断用单抗、治疗用单抗、“生物导弹”用单抗。单抗为人类疾病的防治和诊断、肿瘤体内定位、靶向药物的制备、防止移植物的排异反应、新型疫苗的研制提供了较为理想的手段。

2.1用于疾病诊断方面利用单抗进行疾病的诊断现已被

广泛应用。(1)可用以检测淋巴细胞表面分子,以区分不同分化阶段的淋巴细胞,用于鉴别淋巴细胞。(2)可用于鉴定病原体,准确诊断感染性疾病。将病原体的抗原分离,再同骨髓瘤细胞杂交建立相应的杂交瘤细胞株,分泌单克隆抗体,可以同病原体发生特异性的抗原-抗体反应,通过免疫荧光试验或ELISA 试验对疾病进行诊断。例如转铁蛋白、肾素、甲状腺素(T4)、三碘甲状腺素(T3)、干扰素、补体成分C3、cAM P 、cGM P 、生长素、绒毛膜促性腺激素(HCG)、促性腺激素(FSH)、胰岛素、

IgG 、IgE 、地高辛、氨茶碱、苯巴比妥、氨基糖甙类抗生素、维生素B12等单抗均可作为体内激素或药物等微量成分的测定。(3)可以用于肿瘤的诊断和分型。某些单抗具有在肿瘤部位蓄积的特性,可用于肿瘤的诊断。目前已批准使用的诊断剂有:用于结肠癌的votomab 和arcilumonab,用于探测感染部位的sulemab,用于卵巢癌的igovomab,用于黑色素瘤的tecnemab K-1。(4)激素类单抗可用于测定体内激素含量,判断内分泌的功能状态。

2.2用于疾病的治疗

2.2.1抗细胞表面分子单抗,可抑制同种免疫反应,主要用于移植排斥反应的防治。莫罗单抗(muromonab-CD3,Orthoclone OKT3)是FDA 批准用于肾移植病人防止异体排斥反应的第一只鼠源型单克隆抗体。

2.2.2抗肿瘤单抗,可用于肿瘤的导向治疗。利妥昔单抗(美罗华)是第一个被批准用于临床治疗的单抗。它是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体,进入人体后可与CD20特异性结合导致B 细胞溶解,从而抑制B 细胞增殖,诱导成熟B 细胞凋亡,但不影响原始B 细胞。随后上市的适用于乳腺癌治疗的曲妥珠单抗为一种针对HER22/neu 的重组人源化IgG 单克隆抗体,能特异性识Her22调控的细胞表面蛋白HER22,使其通过内吞噬作用离开胞膜进入核体内,抑制其介导的信号转导,从而起到治疗肿瘤的作用。而阿伦珠单抗是人源化、非结合型单抗,作用靶点为正常与异常B 淋巴细胞的CD52抗原,对源于B 和T 细胞的各种恶性肿瘤具有很好的治疗作用。2004年上市的西妥昔单抗和贝伐单抗均是针对大肠癌的治疗。

专论与综述

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