高效液相色谱仪使用中的注意事项

高效液相色谱仪使用中的注意事项

在现代仪器分析中，作为色谱分析的重要分支，高效液相色谱已得到日益广泛的应用。它与气相色谱相比较其基本原理是相同的，因结构和工作方式等特点而具有使用上的特殊性，它是以液体为流动相，不受样品的挥发性和热稳定性的限制，对样品的适应性广，适用于在生物学和医药上有重要意义的大分子、不稳定的天然产物及高分子量化合物、离子型物质的分析。

高效液相色谱仪从结构上大致可分为输液泵、进样器、色谱柱及柱温箱、检测器等单元。储液器中存储的除气载液经过滤后由高压泵输送到色谱柱入口，梯度洗脱时为单（双泵）送液，样品由进样器注入载液系统，送到色谱柱进行分离，分离后的组分由检测器检测，输出信号供给记录或数据处理设备。以下按流动相的流路顺序以等度系统为例分别对各单元加以说明。

一、流动相

液相色谱所用流动相根据分析目的可分为单一或混合流动相，固定相一定时，流动相的种类、配比都严重影响分离效果，最好使用重蒸馏水或HPLC级的有机试剂。依据其所流过单元的特殊性，在使用前必须对其进行过滤和脱气处理。过滤的目的是除去其中微米级的机械杂质，以避免系统污染、磨损和堵塞。脱气则是除去溶解或因混合而产生的气泡，以免引起流量和压力的稳定性及检测器的噪声，最终导致分析数据的重现性变差。应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂，流动相对试样有适宜的溶解度，本身粘度要小，与所用检测器相匹配。

韦氏滤瓶是目前过滤流动相的最常用工具，常用滤膜有0.22微米和0.45微米，又分为有机系和水系两种，过滤不同的试剂应使用相应的过滤膜。在处理混合流动相时，应先过滤后混合，还要注意操作过程中的防尘。

脱气的方法有多种，综合效果和成本而言，在等度分析中常用超声波清洗器完成一般脱气,脱气后的流动相在使用前应注意密封和温度的平衡。严格讲应使用在线脱气装置，有膜脱气和氦气脱气两种。流动相应在使用前进行过滤和脱气处理。试样也必须过滤，可用一次性针头式过滤器完成。

废液的处理应注意污染问题，可采用燃烧或掩埋等方法。

二、溶剂输送泵

因固定相粒度细，流动相具有一定的粘度，必须借助高压泵强使流动相以一定的速度通过柱子。泵的性能直接影响分析过程的稳定性和结果的精密度，它将单一或混合流动相依据分析目的不同以恒流、恒压或等（变）梯度的方式送入系统中。梯度洗脱是在分离过程中让含有两种或两种以上溶剂组成的流动相按一定程序连续变化，产生相应的浓度梯度、极性梯度、离子梯度和PH值梯度，可改善分离、加快分析速度、提高柱效，有利于痕量组分的检测，保持柱性能长期良好，但不同溶剂的紫外吸收程度稍有差异，能引起基线漂移。泵的结构以串联双柱塞和微体积双柱塞为主，使用脉动阻尼器可减少流量的脉动，可用0.1mmX2m不锈钢管作阻尼管。其液腔体积小，易清洗和更换溶剂。

在使用中注意色谱柱所能承受的最高压力，不得超过其上限。使用缓冲盐作流动相时，分析完成后立即用不含盐流动相或处理后的重蒸馏水冲洗泵单元及整个系统，防止盐结晶析出而加速系统磨损造成的漏夜和系统的堵塞。

送液前应注意使用排液（开关）阀排出泵前的气泡或旧流动相。在使用中若不断有气泡被吸入，检查吸滤器与管路及管路与泵入口处是否漏气，否则拆洗或更换吸滤器。

三、进样系统

因工作在压力较高的状态下，常用手动高压六通进样阀完成进样，如：7725i，标准配置为20微升定量环。废液瓶中排液管出口应水平于进样口的针

平面，避免虹吸产生的污染和取样误差。在全量进样时，取样体积是所用定量环容量的三倍以上，取样器中不得有气泡存在。

必须避免发生样品交叉污染，注射不同试样前应用流动相清洗进样阀针口。推荐的进样操作顺序为：在进样状态插入注射器，扳动手柄至取样状态，匀速推入试样，快速将手柄扳至进样状态。平时应保持进样阀针口密封圈处于扩张状态，以延长其寿命。

四、色谱柱

液相柱色谱按其分离原理分为吸附、分配、离子交换、空间排阻等，每种使用的固定相和流动相种类不同，应用范围也有差异。

吸附色谱是以液体为流动相，固定相则是固体吸附剂，待测组分的分子因与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的吸附能力的差别而分离，吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，导致保留时间的不同，使各组分彼此分离，由于吸附剂的活性中心常按一定几何规律排列，此法常用于结构异构体组分的分离。

分配色谱中流动相和固定相都是液体，利用被分离组分在固定相和流动相中的溶解度不同而导致分配系数差别进行分离。它分为正相液－液色谱和反相液－液色谱：正相即固定相的极性大于流动相的极性，样品中极性小的组分先流出，适用于分离容易溶于有机溶剂的强极性及中等极性的分子型物质，主要用于含有不同官能团物质的分析；反相即流动相的极性大于固定相的极性，样品中极性大的组分先流出，流动相的极性在很大范围内可调整，主要用于分离非极性至中等极性的分子型化合物，可解决液相色谱分析中８０％的课题；还有离子对色谱和离子抑制色谱。

另外还有离子交换色谱和空间排阻色谱，后者中以有机溶剂为流动相是凝胶渗透色谱法(GPC)，以重蒸馏水溶液为流动相是凝胶过滤色谱法(GFC)。

常用填充色谱柱的长度一般为10－25厘米，内径多为3－6毫米，固定相粒度为5－10微米，柱温常为室温。使用中应注意色谱柱所承受的最大压力和最高使用温度，如ODS柱的使用压力要低于12MPa，使用温度不得高于50度。使用缓冲液时的溶液PH值范围为2－7。分析柱前端最好有保护短柱。长时间放置应充满相应试剂密封保存，正相分配色谱柱使用正己烷，反向分配色谱柱使用甲醇。

有时须配备柱温箱，保证分析结果的重现性，提高柱效，降低柱压，保证检测的稳定性。

五、检测器

紫外吸收检测器(UVD)用于对紫外线及可见光有吸收组分的测定，可变波长紫外吸收检测器的波长范围是:单光源(氘灯)190－600nm，双光源(氘灯和钨灯)可扩展到1100nm，检测是基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收，对温度的变化和压力脉动不敏感，可用于梯度分析。

使用中注意要在试样的最大吸收波长下测定。样品池的大小一般为8微升，其能量取决于光源的能量和池子的清洁程度，可在250nm波长下通入甲醇或重蒸馏水，查看能量与初始状态的差别。轻度污染时可用注射器往样品池中注入异丙醇清洗，污染严重时须将透镜及密封件拆下浸泡在异丙醇中超声波清洗10－20分钟。使用背压管可提高检测器出口的压力，避免因压力变化在流通池内产生气泡引起基线噪声，常用内径0.3毫米长度不小于2米的管路做背压管。

光电二极管阵列检测器(PDAD)能同时获得样品的色谱图(A－t)曲线和每

个组分的光谱图(A－入)曲线，以便定性和定量，采集三维谱图，能进行峰纯度检验、光谱库检索，同时可以发现单波长检测时未测到的峰。

示差折光指数检测器(RID)是连续测定检测池中溶液折射率来测定试样中各组分的浓度，属通用型检测器，对温度的变化和压力的脉动较敏感，不能用

于梯度洗脱。此外还有荧光检测器(RF)、电化学检测器(L-ECD)和电导池检测器(CDD)等。

六、日常维护

高效液相色谱分析在实际应用中相比气相色谱而言操作较简单，但必须认真仔细，否则不但得不到理想的结果，还可导致仪器的损坏。

有机试剂用HPLC级，使用前须脱气及用0.45微米以下的滤膜过滤以清除微粒或灰尘。含卤素离子或反应后产生卤素离子的溶剂，对不锈钢有腐蚀作用，尽量避免使用，否则分析后立即用重蒸馏水把全流路清洗干净。重蒸馏水与有机溶剂混合时，混合液与室温相差大，注意温度的平衡。当更换无互溶性流动相时，用与新旧流动相有互溶性的中间清洗液(如异丙醇)作过渡清洗液。

严格处理后的流动相首先流过的是吸滤器，它是由不锈钢烧结而成，网眼孔径10微米。长期使用或使用含不溶物的流动相时产生堵塞现象：当吸入流动相时，吸滤器内形成减压，溶在液体内的空气产生气泡，造成管路中不断有气泡出现，大流量时更加明显。确认方法：取下泵入口处的进液管，向上提起，管中液体下流速度慢。措施：先用针管吸入处理后的流动相，反向压入进液管，仍无效时可将其金属部分取下，浸泡在异丙醇或5%稀硝酸中超声波清洗5－10分钟，重新安装后，用每分钟1毫升的流量送液10分钟，若进液管仍有气泡，更换新的吸滤器。

泵带有入口和出口单向阀，其中的宝石球或球座受污染会导致密封性不好，出现压力波动大，流量不稳定，造成组分的保留时间重现性变差。可拆下色谱柱，用0.1mmX2m阻尼管代替，后面不接检测器，将流动相换成异丙醇，以每分钟2毫升流量送液1小时以上。无效则拆下单向阀，放入异丙醇中超声波清洗，注意入口单向阀不能倒置。清洗后，恢复每分钟2毫升流量送液，观察液体是否连续流出，否则更换新的单向阀。

柱塞密封圈磨损导致密封性不良，产生漏液或系统压力波动大，可观察泵头后侧清洗管路是否漏液。当流动相中含有缓冲盐时，经常用注射器吸取重蒸馏水或不含缓冲盐的流动相冲洗泵后流路是必要的。在更换前，新柱塞密封圈须用异丙醇浸泡15分钟。更换柱塞密封圈仍漏液或使用寿命很短，应确认柱塞杆表面有无损伤，取干净纱布沾异丙醇擦净柱塞杆表面附着的密封圈渣或污垢。柱塞杆更换时密封圈和隔膜应同时更换。检修后应确认是否漏气。

进样阀所配的标准定量环为20微升，当部分注入时，改变注入量，就可用同一浓度的标准试样中作出标准曲线。进样口发生漏液时，可用铅笔橡皮头挤压针导管，必要时可重复多次。

作为检测器光源的氘灯随使用时间的推移其光能下降，2000小时其光能减半，因此2000小时作为更换的大致时间。根据试样浓度、流动相、基线噪声情况，也有可能继续使用。流通池污染的症状为基线漂移、噪声大，出现针状噪声、锯形噪声(池内可能有气泡)。拆洗重新安装后应试漏。